CC BY
128
Известия ТИНРО
2011 Том 167
АКВАКУЛЬТУРА
УДК 597.442:639.371.2
В.Н. Валова*
Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4
ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ МОЛОДИ АМУРСКИХ ОСЕТРОВЫХ РЫБ, ВЫРАЩИВАЕМЫХ В УСЛОВИЯХ ЛОСОСЕВОГО РЫБОВОДНОГО ЗАВОДА
Проведены исследования развития состояния кроветворной системы у амурских осетровых рыб, полученных из икры от диких производителей и выращиваемых в условиях Анюйского рыбоводного лососевого завода, на ранних стадиях онтогенеза. В ходе исследований было установлено, что низкие температуры воды (при инкубации икры, выдерживании свободных эмбрионов и личинок) не влияют на развитие кроветворных органов и становление системы кроветворения у мальков амурских осетровых рыб. Развитие кроветворных органов и становление системы кроветворения у мальков калуги и амурского осетра практически не отличается от таковых у севрюги, русского осетра и белуги. Выявлено, что скармливание малькам амурских осетровых рыб на ранних этапах экзогенного питания искусственных комбикормов, применяемых для кормления молоди кеты (Aller Futura) вызывало у них развитие хронической формы липоидной дегенерации печени разных степеней тяжести. Практически у всех исследованных мальков калуги и амурского осетра перед выпуском (масса 1-2 г) обнаруживалась липоидная дегенерация печени средней и тяжелой степени, что в дальнейшем может повлиять на выживаемость молоди в естественной среде обитания.
Ключевые слова: кроветворные органы, эритроциты, лейкоциты, нейтро-филы, развивающиеся клетки, красная пульпа, белая пульпа, селезенка, гемопоэ-тическая ткань, печень, гепатоциты.
Valova V.N. Physiological state of the Amur sturgeon fingerlings reared in conditions of salmon hatchery // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 167. — P. 207-222.
Vital capacity and alimentary diseases are important factors of industrial pisciculture. To estimate these factors, rearing of fingerlings is considered for two sturgeon species. Formation of the amur sturgeon haemopoiesis was observed and physiological state of amur sturgeon and kaluga in the beginning of exogenous feeding by dry granular fodder and before their release were examined in the salmon hatchery Anuisky (Khabarovsk Region). The juveniles were received from wild spawners; the imported fodder Aller Futura intended originally for chum salmon was used for their feeding. Low temperature of the eggs incubation and free embryos keeping did not influence negatively on the hematopoietic organs formation, which were completely formed, with definite morphology, when the fish reached the weight 1-2 g. The
* Валова Вера Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected].
hematopoietic organs and their formation for the Amur sturgeons were the same as for stellate sturgeon, russian sturgeon, and beluga. However, the Amur sturgeons fingerlings fed by the fodder Aller-Futura had lipoid degeneration of their liver in medium or severe degree that could influence negatively on their survival.
Key words: hematopoietic organ, erythrocyte, leucocyte, neutrophil, developing cell, red pulp, white pulp, spleen, hematopoietic tissue, liver, hepatocyte.
Введение
Кроветворение, или гемопоэз, представляет собой сложный, многоэтапный процесс образования клеток крови в специализированных органах, при этом кроветворные органы у рыб достаточно сильно отличаются от таковых у высших позвоночных. Для рыб характерно множество взаимозаменяемых мест кроветворения: почки, печень, селезенка, эндотелий сосудов (интраваскулярное кроветворение), слизистая оболочка кишечника, жаберный аппарат, сердце, тимус, при этом достаточно хорошо гемопоэз только изучен у костистых рыб. Согласно опубликованным данным (Лепилина и др., 2001; Ложниченко и др., 2002, 2004; Ложниченко, Федорова, 2003, 2004; Федорова, Ложниченко, 2004; Ложниченко, 2005а, б, 2007), основными и универсальными органами кроветворения у осетровых рыб являются почки, селезенка, тимус, перикард. Также функцию кроветворения выполняют слизистая оболочка среднего отдела кишечника (непосредственно перед спиральной складкой и в спиральной складке), ткани в хрящевых (костных) капсулах черепа, кроветворные островки в печени и в эпикардиальном органе. В раннем онтогенезе от своевременной дифференцировки системы кроветворения зависит формирование иммуннореактивного статуса рыб, а организм рыб через систему крови в это время уже четко реагирует на благоприятные и неблагоприятные воздействия (Житенева, 1999).
Реакции периферической крови на нарушения функционального состояния особи в ответ на воздействие являются неспецифичными и могут быть использованы в качестве средства диагностики как нормального, так и патологического состояния. Для полной диагностики заболеваний данные гематологического анализа, свидетельствующие о развитии патологических процессов в организме рыб, должны подтверждаться результатами гистологических исследований органов, у которых внешние признаки предположительно указывают на присутствие патологии (Факторович, 1959; Валова, 1999; Методические указания ..., 1999а, б).
Цель работы — оценка физиологического состояния молоди амурских осетровых рыб, выращиваемых в условиях лососевого рыбоводного завода, на ранних стадиях онтогенеза.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: дать характеристику развития кроветворных органов и становления кроветворения у мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского лососевого рыбоводного завода (ЛРЗ), оценить физиологическое состояние мальков амурских осетровых рыб перед выпуском в реку.
Материалы и методы
Объектом исследования служила ранняя молодь амурского осетра Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и калуги Huso dauricus (Georgi, 1775), выращиваемая в бассейнах Анюйского ЛРЗ. Сбор материала проводился в июне-июле 2008 г., объем выборки составлял по 10 экз. каждого вида согласно методике (Методические указания ..., 1999а). Всего было исследовано 100 экз. ранней молоди калуги и амурского осетра.
Физиологическое состояние молоди оценивалось по гематологическим показателям и состоянию кроветворных органов (селезенка, эпикардиальный кроветворный орган и печень). Обработка гематологического и гистологического материала проводилась по общепринятым методикам (Ромейс, 1954; Лилли, 1969;
Иванова, 1983; Житенева и др., 1997; Методические указания ..., 1999а, б). Гистологические препараты на морфологические исследования окрашивались стандартизированными гистологическими красителями производства фирмы “ДИА-ХИМ” гематоксилин-эозином по Караччи (Ромейс, 1954), мазки крови — по Май-Грюнвальду (Ромейс, 1954). Отпечатки кроветворных органов (селезенки, печени) для исследования становления кроветворения у рыб на ранней мальковой стадии изготавливались и окрашивались по Эшли и Смиту (Житенева и др., 1997). Исследования мазков крови и гистологических препаратов проводились на цифровой микроскопической системе “Leica”.
Рассматривались следующие гематологические показатели: содержание общего гемоглобина в крови, общее число эритроцитов и лейкоцитов, лейкоцитарная формула крови. В ходе гистологического анализа исследовалось строение селезенки, эпикардиального кроветворного органа и печени у калуги и амурского осетра в ранний мальковый период при низких температурах выращивания (7-10 оС) во время адаптации их к кормам и активного питания сухими гранулированными кормами. Выбор этих органов был обусловлен техническими причинами (невозможностью сбора материала на более ранних стадиях онтогенеза) и тем, что закладка органов и становление кроветворения в селезенке, эпикарди-альном органе, печени происходит несколько позже, чем в почке, и поэтому нам удалось застать довольно ранние этапы гемопоэза. Наряду с другими хорошо изученными кроветворными органами, такими как почки, тимус и перикард, они вносят в кроветворение значительный вклад на ранних этапах онтогенеза: селезенка — эритротромбопоэз; эпикардиальный орган — эритролимфопоэз; печень — эритропоэз. Доля различных ретикулярных клеток в кроветворных органах и полустволовых (гемогистобласты), унипотентных (гемоцитобласты) клеток и форменных элементов крови также определялась на основе подсчета 1000 клеток ретикулярной стромы (Житенева и др., 1997). Общее количество тромбоцитов и общее количество лейкоцитов просчитывалось как прямым, так и косвенным (для избежания погрешностей) методом (расчет на 500 эритроцитов). Результаты подсчетов общего числа тромбоцитов и лейкоцитов обоими методами оказались сопоставимыми. Физиологический статус мальков калуги и амурского осетра оценивался по наличию патоморфологических изменений клеток периферической крови и печени. Стадии развития липоидной дегенерации печени определялись по методу площадей (Pohlmаn, 1939; Факторович, 1959). Весь материал статистически обработан с использованием пакета Excel.
Результаты и их обсуждение
Гемопоэз у молоди амурских осетровых рыб при выращивании в условиях Анюйского ЛРЗ
Селезенка
Согласно литературным данным (Ложниченко, 2007; Грушко и др., 2009), мезенхимный зачаток селезенки у осетровых рыб впервые отмечается на 45-й стадии развития и к возрасту 45 дней активного питания уже представляет собой небольшой компактный орган, окруженный тонкой соединительнотканной капсулой, расположенный между стенкой желудка и средней кишки. У мальков калуги и амурского осетра, выращиваемых на Анюйском ЛРЗ, на 45-й день активного питания селезенка была достаточно хорошо развита и располагалась в петлях кишечника перед спиральным клапаном. Она была окружена тонкой соединительнотканной капсулой, в отдельных местах переходящей в соединительную ткань серозной оболочки. Паренхима селезенки была пронизана многочисленными капиллярами, заполненными клетками крови, и в ней довольно четко различались красная и белая пульпы. Красная пульпа составляла около 4045 % объема селезенки как у мальков калуги, так и у амурского осетра и состоя-
ла из ретикулярной ткани, заполненной свободными клеточными элементами крови, среди которых встречались редкие макрофаги.
Белая пульпа у ранних мальков калуги и амурского осетра располагалась вокруг крупных кровеносных сосудов (рис. 1). Она была сформирована из разнообразных по форме образований (иногда соединяющихся между собой), состоящих в основном из ретикулярной ткани, в составе которой (табл. 1) у мальков калуги превалировали активные ретикулярные клетки (72,20 %), у мальков амурского осетра их доля была несколько ниже (66,75 %). Количество малоактивных ретикулярных клеток у калуги было сравнительно невелико и составляло 11,0 %, у амурского осетра их количество было выше — 20,85 %. Удельный вес переходных клеток у мальков калуги был несколько выше (9,25 %), чем у мальков амурского осетра (7,15 %). Покоящиеся ретикулярные клетки составили 7,55 % у калуги и 5,25 % у амурского осетра. Ретикулярные клетки в селезенке мальков амурского осетра и калуги являлись микроокружением развивающихся элементов крови и, кроме этого, часто обнаруживались в островках кроветворения. Активные ретикулярные клетки представляли собой клетки с ячеистой цитоплазмой и ядром, содержащим ядрышко и нежную сеть хроматиновых волокон. Малоактивные ретикулярные клетки имели более крупные размеры и более грубую хроматиновую сеть. У переходных ретикулярных клеток ядро было округлое, крупное, цитоплазма имела базофильную окраску и грубую хроматиновую сеть, от активных и малоактивных ретикулярных клеток они также отличались более крупными размерами. Самыми крупными клетками в ретикулярной строме белой пульпы селезенки были немногочисленные покоящиеся ретикулярные клетки овальной формы со слабо базофильной цитоплазмой. Ядро таких клеток имело овальную форму и содержало хроматин в виде тонких нитей, ядрышки в нем не обнаруживались.
Рис. 1. Строение селезенки у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 20): а — белая пульпа; б — красная пульпа
Fig. 1. Spleen structure of the Amur sturgeons fingerlings (magnification 10 x 20): a — white pulp; б — red pulp
У мальков амурского осетра количество полустволовых (гемогистобласты) и унипотентных (гемоцитобласты) клеток-предшественниц составило соответственно 17,5 и 15,2 %, у калуги — 12,3 и 7,2 % (табл. 1). Среди бластных клеток у мальков калуги и амурского осетра преобладали миелобласты (соответственно 6,1 и 6,4 %), доли лимфобластов и эритробластов у них различались незначи-
Таблица 1
Состав клеток ретикулярной ткани (%/1000 клеток) и клеток крови в селезенке (%/1000 клеток крови) у мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского завода
Cells composition (%) for reticular tissue and blood in the spleen of the amur sturgeon and kaluga fingerlings reared in the Anuisky hatchery
Table 1
Показатель
Aмурский осетр
45 дней Выпуск
(1-2 г)
активного
питания
Калуга 45 дней активного питания
Выпуск (1-2 г)
Ретикулярная ткань
Активные ретикулярные клетки 66,75 і G,65 95,30 і 0,51 72,20 і 0,44 95,70 і 0,75
Малоактивные ретикулярные
клетки 2G,85 і G,38 2,65 і 0,34 11,00 і 0,36 2,65 і 0,54
Переходные ретикулярные
клетки 7,15 і G,33 1,35 і 0,15 9,25 і 0,17 0,90 і 0,19
Покоящиеся ретикулярные
клетки 5,25і0,30 0,70 і 0,13 7,55 і 0,40 0,75 і 0,13
Кровь
Полустволовые клетки 17,50 і 0,44 - 12,30 і 0,50 -
Унипотентные клетки 15,20 і 0,45 - 7,20 і 0,34 -
Миелобласты 6,10 і 0,29 - 6,35 і 0,21 -
Лимфобласты 2,20 і 0,21 1,2G і G,25 2,65 і 0,18 1,20 і 0,15
Эритробласты 3,25 і 0,28 1,25 і 0,20 3,15 і 0,26 1,5G і G,24
Эозинофильные миелоциты 3,35 і 0,29 - 3,60 і 0,28 -
Эозинофильные метамиелоциты 2,90 і 0,33 1,30 і 0,21 3,40 і 0,33 1,80 і 0,17
Палочкоядерные эозинофилы 3,95 і 0,38 1,35 і 0,22 4,50 і 0,18 1,30 і 0,20
Эозинофилы - 2,30 і 0,24 - 1,30 і 0,23
Нейтрофильные миелоциты 2,40 і 0,31 0,90 і 0,15 2,15 і 0,15 0,90 і 0,17
Нейтрофильные метамиелоциты 2,90 і 0,41 1,20 і 0,19 2,60 і 0,30 1,30 і 0,17
Палочкоядерные нейтрофилы - 3,60 і 0,24 - 3,90 і 0,21
Сегментоядерные нейтрофилы - 2,70 і 0,29 - 2,35 і G,31
Ретикулоциты 22,65 і 1,14 3,05 і 0,27 35,40 і 1,12 3,2G і G,3G
Эритроциты 9,45 і 0,80 51,60 і 0,46 10,15 і 0,74 51,65 і 0,59
Лимфоциты 8,15 і 0,48 20,65 і 0,30 6,55 і 0,32 21,10 і 0,52
Тромбоциты - 8,90 і 0,46 - 8,50 і 0,57
тельно (табл. 1). В классе созревающих клеток отмечалось большое количество гранулоцитов и отставание числа нейтрофилов и их доли в сравнении с эозино-филами. При этом нейтрофильные миелоциты и нейтрофильные метамиелоциты составляли чуть выше 5 % числа всех клеток крови (табл. 1). Необходимо отметить, что дифференцировка эозинофилов в селезенке происходила более интенсивно (встречались эозинофильные миелоциты, эозинофильные метамиелоциты, палочкоядерные эозинофилы), среди нейтрофилов обнаруживались только нейт-рофильные миелоциты и метамиелоциты.
Из дефинитивных клеток наблюдались эритроциты и лимфоциты, количество которых не превышало 20 % всех клеток крови (табл. 1). Микроокружением для развивающихся клеток крови в селезенке служили ретикулярные клетки в соотношении: родоначальные клетки — 1 : 12; бластные клетки — 1 : 7; созревающие клетки — 1 : 5; зрелые клетки — 1 : 3. У мальков калуги среди развивающихся клеток крови были обнаружены макрофаги и мегакариоциты, при этом в строме селезенки присутствовали отдельные тромбоциты. В строме селезенки у мальков калуги и амурского осетра также обнаруживались мегака-риоциты — крупные клетки с бледно-голубой цитоплазмой, неровными краями и крупным ядром рыхлой структуры — и макрофаги, которые были настолько редки, что при подсчете долей клеток крови, как и тромбоциты, не учитывались.
Перед выпуском молоди в р. Амур (масса 1-2 г) строение селезенки приобрело дефинитивный характер, т.е. произошли возрастные изменения. Строма ее у молоди калуги и амурского осетра имела значительное количество кровеносных сосудов. Паренхима селезенки четко разделялась на красную и белую пульпы, которые занимали примерно равные площади, и была пронизана капиллярами, заполненными клетками крови. Красная пульпа состояла из ретикулярных клеток, ортохромных эритроцитов и довольно большого количества разрушающихся эритроцитов, среди ретикулярных клеток встречались многочисленные макрофаги, располагавшиеся хаотично по всему объему красной пульпы.
Белая пульпа у исследованной молоди окрашивалась более интенсивно и располагалась компактно в виде образований неправильной формы. Основу белой пульпы составляли ретикулярные клетки, стромальные клетки, лимфоциты (малые, средние и большие). Между красной и белой пульпой просматривались четкие границы. Результаты исследований представлены в табл. 1. Согласно им большая часть ретикулярных клеток селезенки была представлена активными ретикулярными клетками (95,3-95,7 %). У мальков калуги и амурского осетра перед выпуском отмечалось отсутствие полустволовых и унипотентных клеток. Число клеток бластного ряда также снизилось, доли лимфобластов и эритробла-стов практически не различались. Доля ортохромных эритроцитов в 2-3 раза превышала количество лимфоцитов, в качестве микроокружения выступали активные ретикулярные клетки. Доля тромбоцитов в строме селезенки составила у амурского осетра 8,9 %, у калуги 8,5 % общего числа просчитанных клеток крови.
Эпикардиальный кроветворный орган
Уже у ранней молоди амурских осетровых рыб на стадии 45 дней активного питания обнаруживалось кроветворное образование (эпикардиальный орган) в виде кружевной гемопоэтической ленты, окружающее сердце в эпикардиальной области (рис. 2). Сама гемопоэтическая лента представлена отдельными конгломератами различной, чаще всего округлой, формы (рис. 3), которые состояли из ретикулярных клеток и развивающихся форменных элементов крови. В ретикулярной ткани превалировали активные ретикулярные клетки, составляющие около 73,6 % у амурского осетра и 77,8 % у калуги (табл. 2). Доли остальных групп ретикулярных клеток были незначительны. Развивающиеся клетки крови находились в своего рода кроветворных островках, различных по размеру и количеству клеток, которые были окружены ретикулярной тканью. Основные форменные элементы крови в таких островках были представлены эритроцитами, доля клеток бластного ряда не превышала 10 %.
Рис. 2. Кроветворный орган у мальков амурских осетровых рыб в виде кружевной ге-мопозтической ленты, расположенный в зпикардиальной области сердца
Fig. 2. Hematopoietic organ of the Amur sturgeons fingerlings looking as a lace trim around ep-icordial part of the heart
У молоди перед выпуском (1-2 г) в созревающем классе клеток крови наблюдалось увеличение удельного веса лейкоцитов при одновременном снижении
Рис. 3. Гистоструктура эпикардиального гемопоэтического органа у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 20): а — клетки крови; б — ретикулярная ткань Fig. 3. Histological structure for epicordial hematopoietic organ of the Amur sturgeons fingerlings (magnification 10 x 20): a — blood cells; б — reticular tissue
Таблица
Состав клеток ретикулярной ткани (%/1000 клеток) и клеток крови эпикардиальном органе (%/1000 клеток крови) у мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского завода
Table
Cells composition (%) for reticular tissue and blood in the epicordial organ of the amur sturgeon and kaluga fingerlings reared in the Anuisky hatchery
Амурский осетр
Калуга
Показатель 45 дней активного питания Выпуск (1-2 г) 45 дней активного питания Выпуск (1-2 г)
Активные ретикулярные клетки Ретикулярная ткань 73,60 і 2,30 95,80 і 0,58 77,80 ± 2,30 94,90 і 0,96
Малоактивные ретикулярные клетки 16,85 і 1,67 2,65 і 0,36 16,45 ± 1,70 3,15 і 0,61
Переходные ретикулярные клетки 6,70 і 0,39 1,00 і 0,20 4,50 ± 0,78 1,30 і 0,27
Покоящиеся ретикулярные клетки 3,05 і 0,47 0,55 і 0,16 1,20 ± 0,27 0,65 і 0,15
Миелобласты Кровь 2,95 і 0,50 - 1,65 ± 0,18 -
Лимфобласты 3,30 і 0,25 2,45 і 0,23 3,70 ± 0,34 1,8G і G,21
Эритробласты 3,15 і 0,47 1,40 і 0,19 3,00 ± 0,32 1,75 і 0,30
Эозинофильные миелоциты 8,60 і 0,64 0,55 і 0,09 2,90 ± 0,27 1,70 і 0,27
Эозинофильные метамиелоциты 3,20 і 0,28 0,85 і 0,15 8,00 ± 0,44 1,85 і 0,35
Палочкоядерные эозинофилы 9,10 і 1,01 3,35 і 0,21 9,10 ± 0,51 3,60 і 0,35
Эозинофилы - 3,50 і 0,48 - 7,75 і G,37
Нейтрофильные миелоциты 2,70 і 0,39 0,30 і 0,08 1,30 ± 0,17 1,45 і 0,19
Нейтрофильные метамиелоциты 2,70 і 0,27 0,50 і 0,07 2,40 ± 0,23 2,10 і 0,19
Палочкоядерные нейтрофилы 1,95 і 0,26 1,8G і G,25 2,50 ± 0,26 2,35 і 0,21
Сегментоядерные нейтрофилы - 1,10 і 0,18 - 1,10 і 0,18
Ретикулоциты 22,60 і 0,51 - 23,20 ± 0,65 -
Эритроциты 27,00 і 0,74 16,15 і 0,59 22,60 ± 0,90 17,30 і 1,65
Лимфоциты 12,75 і 0,84 68,05 і 1,25 19,65 ± 0,84 57,25 і 0,49
доли клеток эритропоэтического ряда (табл. 2). Также значительно повысилось число агранулоцитов, которое у калуги составило около 70 % (табл. 2). Среди гранулоцитов увеличилась доля созревающих эозинофилов, превосходящая число молодых нейтрофилов в 2-3 раза.
Класс зрелых клеток в основном был представлен ортохромными эритроцитами и лимфоцитами, причем число лимфоцитов почти в 10 раз превышало долю эритроцитов (табл. 2). Перед выпуском у мальков амурского осетра и калуги отмечена активная миграция клеток крови в капилляры наружной оболочки миокарда, а затем в периферическую кровь.
Печень
Печень у осетровых рыб закладывается на 35-й стадии в виде выпячивания вентральной стенки первичной кишки (так называемый печеночный дивертикул), и уже на 10-й день активного питания в ней отмечается экстраваскулярное кроветворение (Грушко и др., 2009), интенсивность которого постепенно снижается. У мальков амурского осетра и калуги в возрасте 45 дней активного питания очаги кроветворения остались только вокруг наиболее крупных кровеносных сосудов и имели небольшие размеры (рис. 4). Состав ткани кроветворных островков печени был следующим: ретикулярные клетки составляли более половины всех клеток, при этом доля малоактивных ретикулярных клеток была довольно высокой, а доля покоящихся и переходных клеток — незначительной (табл. 3). Удельный вес полустволовых, унипотентных и бластных клеток оказался незначительным. В классе созревающих клеток отмечалось увеличение числа зрелых форм клеток, причем повышалось число гранулоцитов. Количество мегакариоци-тов было незначительным, поэтому они не учитывались при подсчете общего числа клеток крови в очагах гемопоэза, микроокружение составляли активные и малоактивные ретикулярные клетки.
Рис. 4. Очаги кроветворения в печени у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 20)
Fig. 4. Hematopoietic foci in liver of the Amur sturgeons fingerlings (magnification 10 x 20)
Перед выпуском молоди строение печени носило дефинитивный характер. Печеночная паренхима была образована трабекулярно расположенными балками гепатоцитов. Вокруг крупных кровеносных сосудов находились скопления гемопоэтической ткани, занимающие небольшую площадь и состоящие как из ретикулярных, так и развивающихся клеток крови. При этом основная масса
Таблица 3
Состав клеток ретикулярной ткани (%/1000 клеток) и клеток крови в кроветворных островках печени (%/1000 клеток крови) у мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского завода
Table 3
Cells composition (%) for reticular tissue and blood in the liver hematopoietic centres of the amur sturgeon and kaluga fingerlings reared in the Anuisky hatchery
Показатель Амурский осетр 45 дней „ Выпуск активного /. Л (1-2 г) питания Калуга 45 дней Выпуск активного (1-2 г) питания
Активные ретикулярные клетки Ретикулярная ткань 63,85 ± 1,25 96,20 ± 0,81 74,05 і 0,68 92,80 і 0,52
Малоактивные ретикулярные клетки 34,10 і 1,37 3,10 і 0,59 24,95 і 0,68 6,00 і 0,44
Переходные ретикулярные клетки 1,35 і 0,18 1,35 і 0,18 0,70 і 0,13 0,85 і 0,15
Покоящиеся ретикулярные клетки 1,15 і 0,45 0,55 і 0,16 0,30 і 0,11 0,35 і 0,11
Миелобласты Кров 0,70 і 0,17 ь 0,90 і 0,15 1,20 і 0,15 1,30 і 0,17
Лимфобласты 0,65 і 0,17 0,50 і 0,17 0,55 і 0,16 0,75 і 0,13
Эритробласты 0,80 і 0,29 0,35 і 0,17 0,70 і 0,17 0,50 і 0,13
Эозинофильные миелоциты 0,65 і 0,13 0,75 і 0,11 1,2G і G,2G 1,4G і G,21
Эозинофильные метамиелоциты 0,60 і 0,18 0,75 і 0,11 0,90 і 0,12 1,50 і 0,11
Палочкоядерные эозинофилы 1,10 і 0,15 2,20 і 1,09 1,40 і 0,22 2,10 і 0,22
Эозинофилы - 1,8G і G,24 - 2,75 і 0,29
Нейтрофильные миелоциты 0,80 і 0,11 0,95 і 0,14 1,00 і 0,21 0,90 і 0,18
Нейтрофильные метамиелоциты 1,00 і 0,13 1,2G і G,23 1,25 і 0,20 1,05 і 0,14
Палочкоядерные нейтрофилы 1,7G і G,2G 1,95 і 0,19 1,75 і 0,20 2,60 і 0,21
Сегментоядерные нейтрофилы - 1,20 і 0,19 - 1,20 і 0,19
Ретикулоциты 12,55 і G,59 - 10,80 і 1,10 -
Эритроциты 51,80 і 1,14 55,80 і 0,82 52,50 і 0,82 59,G5 і G,87
Лимфоциты 27,65 і 0,86 31,65 і 1,28 26,35 і 0,81 24,90 і 0,76
ретикулярных клеток была представлена активными ретикулярными клетками (калуга — 92,8; амурский осетр — 96,2 %). Остальные ретикулярные клетки составляли незначительную часть. Необходимо отметить отсутствие родоначальных клеток крови и значительное снижение бластных форм, среди которых превалируют миелобласты. Среди созревающих клеток основная доля принадлежала гранулоцитам, при этом наблюдалось резкое снижение числа клеток эритро-поэтического ряда и полностью отсутствовали моноциты. Среди общего состава клеток крови основную часть занимали эритроциты и лимфоциты, полностью отсутствовали мегакариоциты, что свидетельствовало о прекращении тромбоци-топоэза в печени.
Количественные и качественные показатели периферической крови мальков амурских осетровых рыб при выращивании в условиях Анюйского ЛРЗ
В периферической крови мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского ЛРЗ, через 45 дней активного питания отмечалась следующая картина.
У мальков амурского осетра общее число эритроцитов было несколько выше, чем у мальков калуги, при этом доля юных форм несколько превышала таковую зрелых форм эритроцитов (табл. 4). Количество гемоглобина у мальков калуги было выше, чем у мальков амурского осетра, как и содержание
гемоглобина в 1 эритроците (МСН). Величина СОЭ у мальков амурского осетра и калуги практически не различалась и была достаточно высокой (табл. 4). В периферической крови мальков калуги и амурского осетра наблюдалось довольно высокое общее число тромбоцитов, которое соответственно в 1,7 и 1,8 раза превышала таковое лейкоцитов (табл. 4). У мальков амурского осетра и калуги через 45 дней активного питания дифференцировка гранулоцитов в периферической крови еще не была завершена: доля миелобластов была достаточно велика и у мальков калуги почти в 1,3 раза превышала таковую лимфобластов, у мальков амурского осетра, наоборот, число миелобластов было выше, чем лимфобластов, примерно в 1,3 раза (табл. 4). Среди гранулоцитов преобладали незрелые формы, так, количество палочкоядерных эозинофилов в 1,3 раза было выше, чем зрелых эозинофилов, у мальков амурского осетра и в 1,1 раза у мальков калуги (табл. 4). Доля юных нейтрофилов в 2,7 раза превышала таковую зрелых (сегментоядерных) форм у мальков амурского осетра и в 2,9 раза у мальков калуги (табл. 4). Количество моноцитов в лейкограмме у мальков амурского осетра было несколько выше, чем у калуги, и составляло соответственно 4,95 и 3,75 %. В лейкограмме преобладающей группой были лимфоциты двух форм, доля которых у молоди амурского осетра была на 2,5 % ниже, чем у мальков калуги.
Таблица 4
Состав клеток периферической крови у мальков амурского осетра и калуги, выращиваемых в условиях Анюйского ЛРЗ
Table 4
Cells composition for peripheral blood of the amur sturgeon and kaluga fingerlings
reared in the Anuisky hatchery
Показатель
Амурский осетр
45 дней „
Выпуск
активного
(1-2 г)
питания
Калуга 45 дней активного питания
Выпуск (1-2 г)
Эритроциты, млн/мкл Эритробласты, % Пронормобласты, % Базофильные нормобласты, % Зрелые эритроциты, % Гемоглобин, г/л МСН, пг СОЭ, мм/ч Тромбоциты, тыс./мкл Лейкоциты, тыс./мкл Миелобласты, % Лимфобласты, % Палочкоядерные эозинофилы, % Эозинофилы, % Нейтрофильные миелоциты, % Нейтрофильные метамиелоциты, %
Палочкоядерные нейтрофилы, % Сегментоядерные нейтрофилы, %
Моноциты, %
Лимфоциты (большие), % Лимфоциты (малые), % Лимфоциты (всего), %
0,840 і G G4 G,9G3 і G G4 G,787 і G G4 G,953 і G G4
4 G5 і G 68 1 G5 і G 15 5 1G і G 41 1 15 і G 15
8 3G і G 87 G 9G і G 12 7 55 і G 49 1 1G і G 21
53 3G і 1 52 33 1G і 5 14 44 65 і G 83 26 25 і 1 61
34 35 і 1 15 7G 15 і 2 3G 42 ,7G і G 81 71 5G і 1 67
48 37 і G 88 45 1G і 1 7G 51 ,4G і 1 3G 49 2G і 2 1G
6G 1G і 4 22 5G 79 і 2 59 69 ,1G і 4 3G 51 99 і 2 17
3 5G і G 5G 2 6G і G 34 3 ,6G і G 43 2 6G і G 4G
96 86 і 8 GG 107 ,65 і 7, 4G 82 ,49 і 4 94 14G 76 і 4 27
54 34 і 3 48 23 64 і 1 33 48 ,4G і 2 39 58 37 і 2 23
2 2G і G 21 1 4G і G 28 3 6G і G 3G 1 25 і G 11
2 85 і G 24 1 85 і G 25 2 85 і G 15 3 6G і G 22
3 5G і G 29 3 2G і G 2G 3 25 і G 24 3 25 і G 23
2 6G і G 44 3 6G і G 26 3 65 і G 32 3 4G і G 5G
2 55 і G 22 3 GG і G 18 3 ,85 і G 18 2 8G і G 17
3 ,4G і G 26 2 75 і G 32 4 45 і G 14 2 85 і G 15
6 9G і G 77 5 45 і G 35 6 ,00 і G 22 7 G5 і G 98
4 7G і G 55 4 2G і G 26 4 ,85 і G 21 4 85 і G 9G
4 95 і G 6G 3 1G і G 27 3 ,75 і G 21 3 G5 і G 38
33 55 і 1 G3 31 25 і G 42 31 ,55 і G 42 29 6G і G 77
32 8G і G 94 4G 2G і G 38 32 ,2G і G 34 38 3G і 1 G9
66 35 і 1 58 71 45 і G 51 63 75 і G 75 67 9G і G 96
Перед выпуском, при достижении мальками массы 1-2 г, в картине красной и белой крови произошли некоторые изменения, которые выражались в
следующем: у всей исследованной молоди калуги и амурского осетра увеличилось содержание общего числа эритроцитов в периферической крови. Одновременно возросли значения зрелых форм эритроцитов у мальков амурского осетра и калуги (в 2,0 и 1,7 раза по сравнению с предыдущим этапом) и снизилось содержание общего гемоглобина, значений МСН и СОЭ соответственно на 7,3 %, 4,2; 15,4 и 24,8; 25,7 и 27,8 % (табл. 4). В это же время у мальков калуги и амурского осетра увеличилось число тромбоцитов в периферической крови соответственно на 70,6 и 11,1 %. У мальков амурского осетра на 13,2 % повысился удельный вес лимфоцитов в лейкограмме за счет увеличения доли малых лимфоцитов (табл. 4), у мальков калуги перед выпуском общий удельный вес лимфоцитов практически не изменился, однако возросла доля малых лимфоцитов.
Болезни у молоди амурских осетровых рыб при выращивании в условиях Анюйского ЛРЗ
Одним из основных заболеваний рыб в индустриальном рыбоводстве являются алиментарные заболевания, вызываемые либо недоброкачественными кормами, либо несбалансированностью используемых искусственных кормов для выращиваемых видов рыб. При подращивании молоди амурских осетровых рыб на Анюйском ЛРЗ (в условиях низких температур) в начале активного питания использовались яйца артемии, а затем комбикорма датского производства “А11ег-Futura” (применяемые для кормления молоди кеты).
Через 45 дней активного питания у мальков амурского осетра и калуги наблюдались изменения в печеночной паренхиме, характеризовавшиеся следующим. У всех исследованных рыб цвет печени варьировал в пределах от розоватобелого с кровоизлияниями до светло-песочного. Изучение цитоструктуры печеночной паренхимы показало наличие липоидной дегенерации печени (ЛДП) легкой и средней степени тяжести (рис. 5, 6), характеризующейся присутствием пустот на месте экстрагированного жира, занимающих от 20 до 30 % (легкая степень болезни) и 55-65 % (средняя степень) площади клеток печеночной паренхимы. Ядра поврежденных клеток, как правило, смещены к плазматической мембране, чаще всего пикнотические, цитоплазма клеток зернистая и заполнена липидными каплями и крупными глыбками липидов. На неокрашенных препаратах хорошо различимы золотисто-коричневые гранулы цероида, образующие конгломераты, которые часто разрушают плазматическую мембрану гепатоци-тов. Для средней степени тяжести ЛДП характерно почти полное отсутствие регенераторных процессов в печеночной паренхиме; митотическая активность клеток печеночной паренхимы практически равна нулю. Анализ крови исследованной молоди, проведенный одновременно с гистологическим анализом, подтвердил наличие патологических процессов в организме рыб. В эритрограмме у молоди амурского осетра и калуги на 45-й день активного питания преобладали юные формы, при этом наблюдалось высокое число СОЭ и низкий уровень гемоглобина в периферической крови, несмотря на довольно высокую обеспеченность гемоглобином 1 эритроцита (табл. 4). Развитие алиментарной патологии также подтверждалось высокой долей эозинофилов и молодых форм нейтрофилов в лейкограмме мальков обоих видов (сдвиг в левую сторону, свидетельствующий о развитии воспалительных и других патологических реакций). Помимо количественных признаков, свидетельствующих о присутствии патологических изменений в организме мальков амурского осетра и калуги, у всех исследованных рыб наблюдались патоморфологические изменения клеток красной крови, такие как пойкилоцитоз, кариорексис, гемолиз, гипохромазия эритроцитов. Часто встречались шистоциты (безъядерные клетки) и эритроциты со смещенным ядром. Появление таких клеток в периферической крови обычно связано с развитием гемо-
Рис. 5. Легкая степень тяжести липоидной дегенерации печени у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 40): а — липидные включения; б — пикнотические ядра клеток
Fig. 5. Light degree of the liver lipoid degeneration for the Amur sturgeons fingerlings (magnification 10 x 40): a — lipid inclusions; б — pyknotic nuclei
* *
4*
Pi
■: * -Ч
Pис. 6. Средняя степень тяжести липоидной дегенерации печени у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 40): а — замещение цитоплазмы гепатоцитов липидными гранулами; б — гранулы цероида
Fig. 6. Middle degree of the liver lipoid degeneration for the Amur sturgeons finger-lings (magnification 10 x 40): a — substitution of hepatocytes cytoplasm for lipid granules; б — ceroid granules
литической анемии, часто наблюдаемой при хронической форме липоидной дегенерации печени средней и легкой степени тяжести (Валова, 1999; Грушко и др., 2009), что подтверждает данные гистологического анализа печени. Высокое число тромбоцитов в периферической крови подтверждало наличие патологии в организме исследованных рыб.
По мере взросления рыб при увеличении общего числа эритроцитов возросла доля их зрелых форм (табл. 4). Перед выпуском у всей исследованной молоди амурского осетра в лейкограмме также ненамного увеличилась доля эозинофилов (как незрелых, так и зрелых форм), составив 6,8 %, у калуги доля эозинофилов достоверно не изменилась и осталась высокой (табл. 4). Наиболее часто встречаемыми патоморфологическими изменениями в клетках крови выпускаемой молоди амурского осетра и калуги были пойкилоцитоз, гипохромазия, образование “монетных столбиков” (адгезия эритроцитов), кариорексис, кариолизис, гемолиз эритроцитов, появление плазматических клеток, вакуолизация цитоплазмы эритроцитов (рис. 7). Данные гематологического анализа (табл. 4), свидетельствующие о развитии патологического процесса, подтвердились данными гистологических исследований печени. У всей исследованной молоди амурского осетра и калуги, содержавшейся на корме производства фирмы “AПer-Aqua”, перед выпуском наблюдалась липоидная дегенерация печени средней и тяжелой степени хронической формы (см. рис. 6, 8), развитие которой началось на начальных стадиях активного экзогенного питания.
Рис. 7. Характерные патоморфологические изменения клеток красной крови при развитии липоидной дегенерации печени у мальков амурских осетровых рыб: а — кариолизис и гемолиз эритроцитов (увеличение 10 х 90); б — гемолиз и адгезия эритроцитов (“монетные столбики”) (увеличение 10 х 90); в — пойкилоцитоз, вакуолизация цитоплазмы (увеличение 10 х 90); г — гипохромазия эритроцитов, плазматические клетки (увеличение 10 х 40)
Fig. 7. Typical pathomorphological changes of red blood cells under development of the liver lipoid degeneration for the Amur sturgeons fingerlings: a — nuclei destruction and erythrocyte hemolysis (magnification 10 x 90); б — hemolysis and adhesion of erythrocytes (magnification 10 x 90); в — poikilocytosis, cytoplasma vacuolization (magnification 10 x 90); г — hypochromasia of erythrocytes, plasma cells (magnification 10 x 40)
6
4-3
л У ■ &
*" i-sfy , • ii'Va ,V‘^/ * '' " <P Л ? *
Рис. 8. Липоидная дегенерация печени тяжелой степени у мальков амурских осетровых рыб (увеличение 10 х 40): а — замещение цитоплазмы гепатоцитов крупными каплями и глыбками липидов; б — гранулы цероида
Fig. 8. Heavy degree of the liver lipoid degeneration for the Amur sturgeons fingerlings (magnification 10 x 40): a — substitution of hepatocytes cytoplasm for lipid drops and lumps; б — ceroid granules
Заключение
Несмотря на достаточно хорошо описанные закономерности развития элементов крови и гистогенеза кроветворных органов у осетровых рыб в предличи-ночном, личиночном и мальковом периодах, они практически не изучены у амурского осетра и калуги. Нами была предпринята попытка осветить небольшой этап развития кроветворения в мальковый период у калуги и амурского осетра при искусственном выращивании. Согласно полученным результатам, становление кроветворной системы у личинок и мальков калуги и амурского осетра происходит аналогично таковому у других видов осетровых рыб (Лепилина и др., 2001; Ложниченко и др., 2002, 2004; Ложниченко, Федорова, 2003; Федорова, Ложниченко, 2004; Ложниченко, 2005а, 2007). К моменту выпуска у всей исследованной молоди амурского осетра и калуги (1-2 г) кроветворные органы полностью сформированы и имеют дефинитивные морфологические черты. Следовательно, низкие температуры воды, характерные для лососевых рыбоводных заводов, не оказывают существенного влияния на развитие и становление кроветворных органов амурского осетра и калуги на ранних этапах онтогенеза.
Для кормления осетровых рыб, как и молоди кеты, на Анюйском ЛРЗ использовались корма фирмы “Аллер-Аква” (Aller Futura). Доказано, что использование искусственных кормов неизбежно вызывает развитие алиментарных заболеваний, поскольку состав искусственного корма всегда отличается и будет отличаться от естественной пищи (Факторович, 1984; Валова, 1999; и др.). При выращивании молоди для восстановления численности естественных популяций корма играют важную роль в повышении жизнестойкости выращиваемых особей, способных легко адаптироваться к новым условиям и естественным кормам, а также в снижении алиментарных заболеваний.
Согласно полученным данным, у всей исследованной молоди амурского осетра и калуги, выращиваемой в условиях Анюйского ЛРЗ, наблюдалось развитие ли-поидной дегенерации печени уже на ранних этапах питания искусственными кормами. К моменту выпуска практически у всей молоди отмечалось развитие
220
липоидной дегенерации печени разных степеней тяжести, преобладала средняя и тяжелая. Данные гистологического анализа подтверждены гематологическими показателями. Наблюдаемый в ходе исследований относительный тромбоцитоз является следствием функциональных изменений на физиологическом уровне, в нашем случае в результате кормления молоди комбикормами датского производства. Поскольку изначально корма “А11ег Futura” разработаны для молоди лососевых рыб, отличающихся от амурских осетровых рыб спектром питания и условиями среды обитания, применение их для кормления молоди амурских осетровых как в качестве стартовых, так и в качестве продукционных, по-видимому, нецелесообразно. Импортные корма, как правило, рассчитаны на интенсивное товарное выращивание, при котором рыбы не выпускаются в естественную среду обитания. При этом развитие алиментарных патологий, не вызывающих массового отхода рыб, не наносит серьезного экономического ущерба. Выпуск же молоди с алиментарными патологиями в природную среду обитания может препятствовать адаптации рыб к новым условиям и пище. Так, например, развитие патологических изменений в стенке желудка усложняет процесс переваривания и усвоения естественной пищи. Наличие патологических изменений в печени (липоидная дегенерация печени средней и тяжелой степени) ухудшает функцию детоксикации и выработки вителлогенина (будет способствовать появлению нарушений спермато- и оогенеза). Развитие алиментарных патологий у молоди резко снижает ее жизнестойкость и коэффициент возврата производителей, а также качество их потомства, поэтому для выращивания молоди амурских осетровых с целью восстановления численности естественных популяций необходима разработка комбикормов, соответствующих их потребностям в основных питательных компонентах.
Список литературы
Валова В.Н. Характеристика физиологического состояния молоди тихоокеанских лососей при выращивании на комбикормах : дис. ... канд. биол. наук. — Владивосток, 1999. — 172 с.
Грушко М.П., Ложниченко О.В., Федорова Н.Н. Гемопоэз у осетровых рыб : монография. — Астрахань : Триада, 2009. — 190 с.
Житенева Л.Д. Экологические закономерности ихтиогематологии : монография. — Ростов н/Д : АзНИИРХ, 1999. — 45 с.
Житенева Л.Д., Рудницкая О.А., Калюжная Т.И. Эколого-гематологические характеристики некоторых видов рыб (справочник). — Ростов н/Д, 1997. — 151 с.
Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб. — М. : Лег. и пищ. пром-сть, 1983. — 184 с.
Лепилина И.Н., Федорова Н.Н., Ложниченко О.В. Предличиночное развитие основных систем органов севрюги // Международная конференция “Проблемы изучения и рационального использования природных ресурсов морей”. — Астрахань : Касп-НИРХ, 2001. — С. 128-132.
Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия : монография. — М. : Мир, 1969. — 624 с.
Ложниченко О.В. Особенности некоторых органов кроветворения молоди русского осетра // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных : мат-лы. Междунар. науч. конф. — Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 2005а. — С. 138-141.
Ложниченко О.В. Анализ некоторых органов кроветворения молоди русского осетра // Вестник Российского университета дружбы народов. — М. : Изд-во РУДН, 2005б. — № 2(12). — С. 57-59.
Ложниченко О.В. Цитогенез форменных элементов крови и особенности формирования органов кроветворения у осетровых : автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Астрахань, 2007. — 40 с.
Ложниченко О.В., Федорова Н.Н. Морфология селезенки молоди русского осетра // Актуальные проблемы морфологии : сб. науч. тр. — Красноярск : КрасГМА, 2004. — С. 179.
Ложниченко О.В., Федорова Н.Н. Морфофункциональные особенности клеточного состава кроветворной ткани мезонефроса в раннем онтогенезе осетровых рыб // Материалы международной очно-заочной конференции, посвященной памяти С.Н. Са-марцева. — Тула : Изд-во ТулГУ, 2003. — С. 367-368.
Ложниченко О.В., Федорова Н.Н., Загрийчук В.П. Кроветворение у осетровых рыб в раннем онтогенезе // Морфология. — 2004. — Т. 126(4). — С. 70.
Ложниченко О.В., Федорова Н.Н., Зайцев В.Ф. Лимфоцитарный тип крови в раннем онтогенезе у осетровых рыб // Общероссийская международная конференция “Гомеостаз и инфекционный процесс”. — Сочи : Дагомыс, 2002. — С. 66.
Методические указания по проведению гематологического обследования рыб № 13-4-2/1487 от 02 февраля 1999 г. — М. : Минсельхозпрод, 1999а.
Методические указания по диагностике алиментарных токсикозов у рыб № 13-4-2-/1755 от 07.10.1999 г. — М. : Минсельхозпрод, 1999б.
Ромейс Б. Микроскопическая техника : монография. — М. : Иностр. лит., 1954. — 712 с.
Факторович К.А. Алиментарные заболевания у рыб // Биологические основы рыбоводства: паразиты и болезни рыб. — М. : Наука, 1984. — С. 144-159.
Факторович К.А. О патогенезе липоидной дегенерации печени у радужной форели // Науч.-техн. бюл. ВНИОРХ. — 1959. — Вып. 8. — С. 55-58.
Федорова Н.Н., Ложниченко О.В. К вопросу о кроветворении у личинок и молоди белуги // Фундаментальные исследования. — 2004. — № 2. — С. 179.
РоЫтап I. H. Outogenia und mikroskopisher Bau der Leber einiger Fishene // Arch. Nezland der Zoologie. — 1939. — B. 13. — P. 234.
Поступила в редакцию 22.06.11 г.
