CC BY
29
УДК 636.227.28.053.2:636:612.111.7
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАРУШЕНИЙ ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА
© 2016 Т. А. Белова
докт. биол. наук, профессор кафедры общей биологии и экологии е-mail: [email protected]
Курский государственный университет
У новорожденных телят с диспепсией выявлено повышение агрегационной функций тромбоцитов in vitro и in vivo. В основе этих нарушений лежат глубокие сдвиги липидного состава мембран тромбоцитов, повышение содержания в плазме и кровяных пластинках уровня средних молекул, активация перекисного окисления липидов в них, усиление синтеза в стенке сосудов фактора Виллебранда и интенсификация тромбоксанообразования в кровяных пластинках. Активация тромбопластинообразования является ведущей причиной повышения свертывания крови у новорожденных телят с диспепсией. Коррекция нарушений тромбоцитарного звена гемостаза должна включать в себя патогенетически обусловленный комплекс, способный снижать уровень средних молекул в организме и лечить диспепсию.
Ключевые слова: тромбоциты, новорожденные телята, диспепсия.
Исследование тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с диспепсией имеет важное практическое значение, так как именно активация первичного звена гемостаза играет ведущую роль в активизации гемостаза в целом, повышении вязкости и ухудшении реологии крови с наклонностью к внутрисосудистому тромбообразованию [Белова 2015, 2011; Медведев, Белова 2011]. Вместе с тем очень слабо изучены нарушения агрегационной способности тромбоцитов и их внутрисосудистой активности у новорожденных телят с диспепсией. Не определена степень нарушенности при дисфункции тромбоцитов у новорожденных телят с диспепсией липидного состава их мембран, уровня пероксидации и антиоксидантной защиты тромбоцитов, а также уровня обмена в них арахидоновой кислоты. В литературе имеются отрывочные сведения о том, что диспепсия сопровождается у новорожденных телят повышением уровня в плазме средних молекул (СМ) [Киселева и соавт. 2015], способных нарушать многие функции организма. Не выяснена степень увеличения СМ в тромбоцитах, способствующих во многом формированию тромбоцитопатии. Цель работы - исследовать особенности нарушения тромбоцитарного звена гемостаза у новорожденных телят с диспепсией.
Под наблюдением находились новорожденные телята с диспепсией сроком 1-3 дня от здоровых коров первого-второго отела. Кормление и содержание осуществлялось в стандартных условиях телятника. Группу контроля составили здоровые новорожденные телята. Взятие крови проводилось в утренние часы. Обследование включало определение следующих показателей. Уровень средних молекул (СМ) в плазме и отмытых и ресуспендированных тромбоцитах определяли по скриннинговому методу [Габриэлян и соавт. 1985]; активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы - по содержанию ТБК-активных продуктов набором фирмы ООО «Агат-Мед», ацилгидроперекисей (АГП) [Гаврилов, Мишкорудная 1983], а внутритромбоцитарное ПОЛ - по концентрации базального уровня малонового диальдегида (МДА) в реакции восстановления тиобарбитуровой кислотой [Schmith...
1976], в модификации (см.: [Курбатов, Андреев 1979]) и АГП (см.: [Гаврилов, Мишкорудна 1983]). Внутритромбоцитарную антиоксидантную систему характеризовали активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) [Чевари и соавт. 1991].
В отмытых и ресуспендированных тромбоцитах определяли содержание холестерина энзиматическим колориметрическим методом набором фирмы «Витал Диагностикум» и фосфолипидов по фосфору [Колб, Камышников 1982]. Исследовали также активность и время образования эндогенного тромбопластина [Biggs et al. 1953]. Для косвенной оценки обмена арахидоновой кислоты в тромбоцитах, а также активности в них циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы использованы 3 пробы переноса по методу Т.А. Ермолаевой и соавт. [1992] с регистрацией агрегации тромбоцитов (АТ) на ФЭКе [Захария, Кипах 1989]. Производили подсчет количества тромбоцитов в капиллярной крови в камере Горяева. Агрегационная способность тромбоцитов исследовалась визуальным микрометодом [Гемостаз... 1999] по А. С. Шитиковой с использованием в качестве индукторов АДФ (0,5 х 10-4 М.), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125 ед/мл.), ристомицина (0,8 мг/мл.) (НПО «Ренам»), адреналина (5х10-6 М., завод «Гедеон Рихтер» А.О.); для моделирования реальных условий кровотока применены сочетания индукторов АДФ+адреналин, АДФ+коллаген и адреналин+коллаген. Морфологическая внутрисосудистая активность тромбоцитов (ВАТ) определялась с использованием фазовоконтрастного микроскопа [Медведев, Белова 2011] по А.С. Шитиковой и соавт. [ 1997]. Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде М±т.
У телят с диспепсией отмечалось повышение ПОЛ плазмы. Так, концентрация ТБК-активных продуктов в плазме составила 5,10±0,02 мкмоль/л., в контроле -3,92±0,06 мкмоль/л. Уровень МДА в тромбоцитах также оказался повышен (1,54±0,004 нмоль/109 тр.) и в контроле (0,89±0,02 нмоль/109 тр.), что свидетельствует об активации в них свободно-радикального окисления (СРО) в связи с ослаблением внутритромбоцитарной антиокислительной активности. Содержание АГП в плазме больных телят составляло 3,50±0,01 Д233 /1 мл. (в контроле 1,92±0,02 Д233 /1 мл. В тромбоцитах больных АГП (3,49±0,01 Д233 /109 тр.) также существенно превышали контрольные значения (2,87±0,04 Д233 /109 тр.).
Активация СРО в тромбоцитах у больных телят стала возможной в результате существенного ослабления антиокислительных ферментов кровяных пластинок - СОД - 1250,0±4,36 МЕ/109 тр. (у здоровых телят 1780,0±2,06 МЕ/109 тр.) и каталазы -5690,0±21,0 МЕ/109 тр. (в группе сравнения 10500,0±11,05 МЕ/109 тр.). Уровень СМ в плазме при 280 нм. составлял 0,49±0,01 усл.ед., при 254 нм. - 0,32±0,02 усл.ед., против контроля 0,32 ±0,002 усл.ед. и 0,24±0,03 усл.ед., соответственно. В тромбоцитах телят с диспепсией СМ составили при 280 нм. - 0,061±0,02 усл.ед./109 тр., при 254 нм. -0,069±0,03 усл.ед./109 тр. (в контроле 0,050±0,04 усл.ед./109 тр. и 0,055±0,0403 усл.ед./109 тр. соответственно).
Исследование липидного состава мембран тромбоцитов у больных телят выявило снижение содержания в них ОФЛ до 0,38±0,001 мкмоль/109 тр. и увеличение уровня ОХС до 0,82±0,001 мкмоль/109 тр. В контроле аналогичные показатели составили 0,49±0,002 мкмоль/109 тр. и 0,73±0,001 мкмоль/109 тр. соответственно. У больных животных отмечалось усиление тромбопластинообразования. Время образования активного тромбопластина у них составляло 2,95±0,01 мин., активность -9,6±0,02 с. В группе контроля тромбопластин образовался за 2,40±0,01 мин., а активность его составляла 14,0±0,05 с.
Весь комплекс биохимических изменений в тромбоцитах характеризовал усиление обмена в них арахидоновой кислоты и повышение тромбоксанообразования. В простой пробе переноса косвенно оценен уровень тромбоксана в кровяных пластинках телят - 74,3±0,03% (в контроле - 39,2±0,02%). Эти показатели говорят об активации циклооксигеназы, выявленной по восстановлению АТ в коллаген-аспириновой пробе - 96,8±0,05% и тромбоксансинтетазы, определенной по восстановлению АТ в коллаген-имидазольной пробе - 54,6±0,02%. У здоровых животных аналогичные показатели составили 78,4±0,19 и 30,3±0,01% соответственно.
Количество тромбоцитов в крови больных было в пределах нормы. Было отмечено ускорение АТ, особенно под влиянием коллагена - 25,3±0,20 с. (в контроле -30,0±0,12 с.). Несколько медленнее АТ развивалась у телят под влиянием АДФ (33,0±0,12 с.) и ристомицина (26,2±0,13 с.), в контроле - 39,0±0,28 с. и 41,0±0,26 с. соответственно. Тромбиновая и адреналиновая АТ также развивались быстрее, чем в контроле, и были равны у телят 42,4±0,11 с. и 75,6±0,16 с. соответственно (Р<0,01). Время развития АТ под влиянием сочетанного применения индукторов также было ускоренным. АДФ+адреналин - 20,0±0,12 с., АДФ+коллаген - 18,0±0,09 с., адреналин+коллаген - 20,3±0,07 с.
Внутрисосудистая активность тромбоцитов больных характеризовалась ее повышением. Дискоциты в крови больных телят составили 62,0±0,20% (в контроле -82,0±0,16%). Количество диско-эхиноцитов увеличивалось (18,0±0,40%). Содержание сфероцитов, сферо-эхиноцитов и биполярных форм тромбоцитов также значительно превышало контрольные значения и достигало у больных телят 12,0±0,03%, 6,0±0,02% и 2,0±0,01% соответственно. Сумма активных форм тромбоцитов больных была равна 38,0±0,30%, в контроле - 18,0±0,20%, малых и больших агрегатов содержалось 15,2±0,06 и 4,7±0,03, в контроле - 3,6±0,04 и 0,12±0,01 соответственно, причем количество тромбоцитов в агрегатах у больных животных достигало 14,6±0,02% против 5,0±0,20% в контроле.
Течение диспепсии у телят носит сложный характер и сопровождается развитием тромбоцитопатии и активацией процесса свертывания крови. Патогенез диспепсии обусловливает сдвиги в соотношении ХС/ФЛ в мембранах тромбоцитов, что в совокупности с нарушениями пищеварения и всасывания способствует увеличению в кровотоке, а затем и в тромбоцитах содержания СМ, вызывающих ослабление антиоксидантной защиты кровяных пластинок и повышение концентрации в них первичных и вторичных продуктов ПОЛ. В этих условиях у телят происходит активация тромбоцитов и тромбопластинообразования. Повышение тромбогенного потенциала плазмы крови при диспепсии связано в первую очередь с активацией тромбоцитарных функций, а не с повышением уровней различных факторов свертывания, в том числе фибриногена. Активация фибринообразования, без сомнения имеющая место при диспепсии, происходит в первую очередь на поверхности активированных тромбоцитов и носит всегда вторичный характер по отношению к их адгезии и агрегации.
Совокупность метаболических нарушений, изменение состава мембран тромбоцитов, повышение содержания в них СМ и усиление внутритромбоцитарного ПОЛ приводят к повышению ВАТ, увеличивая содержание активных форм кровяных пластинок в кровотоке. Высокая ВАТ обусловливает усиление агрегационной активности тромбоцитов под влиянием различных индукторов. Возможными механизмами этого усиления можно считать активизацию обмена арахидоновой кислоты с повышением в них тромбоксанообразования, зарегистрированную в пробах переноса, и повышение концентрации участвующего в процессе агрегации фактора Виллебранда, косвенно оцененной по ускорению АТ с ристомицином.
Исследование сочетанного влияния индукторов на процесс АТ у больных телят показало их взаимопотенцирующее действие. Регистрация АТ под влиянием сочетания двух индукторов позволяет приблизиться к пониманию реальных условий кровотока у животных с диспепсией и свидетельствует о целесообразности назначения соответствующей терапии, способной нормализовать реологию крови.
Выявленные нарушения тромбоцитарного гемостаза у телят с диспепсией нуждаются в адекватной коррекции, направленной на разрыв «порочных кругов», развивающихся при диспепсии.
Таким образом, у новорожденных телят с диспепсией выявлено повышение агрегационной функций тромбоцитов in vitro и in vivo. В основе этих нарушений лежат сдвиги липидного спектра мембран тромбоцитов, повышение уровня в них средних молекул, активация перекисного окисления липидов плазмы и тромбоцитов, усиление синтеза в стенке сосудов фактора Виллебранда и интенсификация тромбоксанообразования в кровяных пластинках. Активация
тромбопластинообразования является ведущей причиной повышения свертывания крови у новорожденных телят с диспепсией. Коррекция нарушений тромбоцитарного звена гемостаза должна включать в себя патогенетически обусловленный комплекс, способный лечить диспепсию и оптимизировать реологию крови одновременно.
Библиографический список
Белова Т.А. Поверхностная геометрия эритроцитов у телят растительного питания // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. 2015. № 1. С. 40-44.
Белова Т.А. Функциональные особенности эритроцитов у телят в раннем онтогенезе // Ветеринария. 2011. № 2. С. 51-53.
Габриэлян Н.И., Липатова В.И. и др. Скрининговый метод определения средних молекул в биологических жидкостях: метод. рек. М., 1985.
Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лабор. дело. 1983. № 3. С. 33-36.
Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний / под ред. Н.Н. Петрищева, Л.П. Папаян. СПб.: 1999. 117 с.
Ермолаева Т.А., Головина О.Г., Морозова Т.В. и др. Программа клинико-лабораторного исследования больных тромбоцитопатиями. СПб., 1992. 25 с.
Захария Е.А., Кипах М.В. Упрощенный способ определения агрегации и дезагрегации тромбоцитов // Лабор. дело. 1989. № 1. С. 36-38.
Киселева Р.Е., Борченко Р.В., Кузьмичева Л.В. Эндогенная интоксикация у телят при диарее // Ветеринария. 2005. № 12. С. 39-41.
Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Мн.: Изд-во «Беларусь», 1982.
Кубатиев А.А., Андреев С.В. Перекиси липидов и тромбоз // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1979. № 5. С. 414-417.
Медведев И.Н., Белова Т.А. Агрегационная активность и деформационные изменения эритроцитов у телят в фазу молочного питания // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2011. № 2. С. 58-61.
Чевари С., Андял Т., Штренгер Я. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте // Лабор. дело. 1991. № 10. С. 9-13.
Шитикова А.С., Тарковская Л.Р., Каргин В.Д. Метод определения внутрисосудистой активации тромбоцитов и его значение в клинической практике // Клинич. и лабор. диагностика. 1997. № 2. С. 23-35.
Biggs R., Doyglas A.S., Macfarlane R.G. The formation of the thromboplastin in human blood // J. Physiol. 1953. Vol. 119, № 1. Р. 89-104.
Fridwald W.T., Levy R.J., Fredrickson D.S. Estimation of the concentration of low-density-lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge // Clinical Chem. 1972. Vol. 18. Р. 499-502.
Schmith J.B., Jngerman C.M., Silver M.J. Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin, production by human platelet // J.Lab. Clin. Med. 1976. Vol. 88, № 1. Р.167-172.
