CC BY
75
УДК 597-111:597.442
О. В. Ложниченко, А. В. Амплеева, С. М. Хвостова
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРОВЕТВОРЕНИЯ В МЕЗОНЕФРОСЕ У ОСЕТРОВЫ1Х РЫБ
Введение
Морфологические основы формирования органов кроветворения в онтогенезе у низших позвоночных до сих пор полностью не изучены. До настоящего времени в литературе крайне противоречивы данные об образовании клеток крови. Интересным является изучение особенностей гемопоэза у таких древних рыб, как осетровые. В связи с этим целью исследования явилось изучение развития клеток крови в мезонефросе осетровых рыб.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили предличинки, личинки, молодь и сеголетки севрюги (Acipenser stellatus Pallas), белуги (Huso huso L.), осетра (Acipenser guldenstadti Brandt), полученные заводским методом. Материал обрабатывался методами классической гистологии [1]. Для изучения строения органов и тканей парафиновые блоки нарезали на стандартном микротоме сагиттально. Серии срезов толщиной 5-6 микрон окрашивали гематоксилин-эозином.
Результаты исследования и их обсуждение
Предличиночный период развития. На ранних стадиях развития (36-45) большое значение в кроветворении имела осевая клеточная масса, состоявшая из мезенхимы и расположившаяся между хордой и спиральным клапаном, - формирующийся мезонефрос.
На 36-37 стадиях развития мезонефрос - это довольно массивный клеточный тяж, состоявший из молодой соединительной ткани с рыхлым расположением клеток и «цепочек» везикул, лежавших с обеих сторон сегментарно на латеро-вентральной поверхности целома. Вдоль мезонефроса также с обеих сторон опускались два относительно широких мезонефральных канала, выстланные кубическим эпителием. Везикулы были выстланы высоким призматическим эпителием, их полость была едва заметна. Именно вокруг везикул имелись неплотные скопления мезенхимной ткани, игравшие роль кроветворного органа. Сформированных четких кровяных островков у белуги и осетра на 36 стадии развития не отмечено. Родоначальные и бластные клетки крови располагались в массе мезенхимы хаотично. Мезенхимные клетки на ранних стадиях развития играли роль микроокружения.
Полустволовыми клетками крови и клетками-предшественницами реализуется основная количественная регуляция кроветворения, т. е. на этой стадии развития предличинок происходит обеспечение необходимого количества клеток нужного типа в ответ на конкретные потребности развивающегося организма. Качественный анализ формирующейся кроветворной ткани на 36 стадии развития показал, что максимальное количество полустволовых клеток было отмечено у белуги - 20,8 %, минимальное количество - у севрюги - 9,4 %; максимальное количество гемоцитобластов или унипотентных клеток-предшественниц было у осетра - 32,4 %, минимальное - у севрюги - 6,3 %. Кроме того, основную массу формирующихся форменных элементов крови севрюги и осетра составляли эритробласты - 37,5 и 29,8 % соответственно, у белуги преобладали лимфобласты - 29,2 %. Миелобласты и монобласты обнаружены в незначительном количестве у всех видов предличинок осетровых. Бластные клетки дают начало морфологически идентифицируемым стадиям дифференцировки гемопоэтических клеток.
У севрюги на этой стадии в кровяных островках отмечена дифференцировка эритроцитов: пронормобластов было 6,2 %, базофильных нормобластов - 3,0 %. Характерным признаком пронормобластов является способность к интенсивной пролиферации. В результате митотического деления пронормобластов появляются более мелкие округлые клетки - базофильные про-нормобласты. Они отличались тем, что их гомогенная цитоплазма имела резко выраженную базофилию, связанную с накоплением в ней РНК.
На 37-43 стадиях развития в формирующемся мезонефросе происходило развитие извитых канальцев, но врастания клубочков капилляров в почечные капсулы обнаружено не было. В кровяных островках мезонефроса у предличинок осетровых в 9 раз сократилось количество гемогистобластов. Удельный вес гемоцитобластов среди всех развивающихся клеток снизился
в 3 раза. Если на 37 стадии развития основу составляли лимфобласты у предличинок белуги, эритробласты - у осетра и севрюги, то к 43 стадии эритробласты доминировали у всех исследуемых видов осетровых. У осетра с 37, у белуги и севрюги с 40 стадии развития происходила дифференцировка клеток лимфоцитопоэтического ряда в кровяных островках, но зрелых лимфоцитов отмечено не было. У предличинок севрюги началась дальнейшая дифференцировка гранулоцитов - отмечены эозинофильные миелоциты (0,4 %), в максимальном количестве присутствовали оксифильные нормобласты (20,8 %), у осетра и белуги - пронормобласты (23,1 и 30,0 % соответственно). Основного аморфного вещества молодой соединительной ткани было значительное количество.
Развитие клеток эритропоэтического и лимфоцитопоэтического рядов у белуги и севрюги на 44 стадии развития было завершено - имелись зрелые лимфоциты и эритроциты. Доля полу-стволовых и унипотентных клеток крови у этих двух видов осетровых резко снизилась, составив у белуги 4,3 %, у севрюги - 4,8 %. Доминировали оксифильные нормобласты - 22,9 % и 20,5 % соответственно и пролимфоциты - 12,6 и 19,5 %. Скорость эритропоэза и лимфоцито-поэза оказалась у осетра в предличиночный период развития относительно невысокой. Среди развивающихся клеток крови превалировали пролимфоциты - 27,3 %. Количество основного аморфного вещества в молодой соединительной ткани заметно сократилось.
На 45 стадии развития впервые обнаружено врастание клубочков капилляров в полость двухслойной чаши, т. е. к началу экзогенного питания формирование нефронов первой генерации в мезонефросе было завершено. Количество полустволовых и унипотентных клеток крови увеличилось до 7,5 % у белуги, 8,1 % - у осетра, у севрюги уменьшилось до 3,7 %. В составе класса бластных клеток значительных изменений не произошло: доминировали эритробласты, доля лимфобластов была несколько ниже. Монобласты и миелобласты отмечены в незначительном количестве. Присутствовали все виды клеток из созревающего класса, причем их состав, по сравнению с предыдущими стадиями, изменился незначительно. Следует отметить, что именно клетки V класса составляли более половины всех клеток крови. Количество оксифиль-ных нормобластов увеличилось: 14,1 % у осетра, 10,1 % - у севрюги, 6,1 % - у белуги. Лимфоцитопоэтический и эритроцитопоэтический ряды были сформированы у всех исследуемых видов осетровых. Дефинитивные эритроциты и лимфоциты составили соответственно: у белуги -
13,6 и 2,5 %, у севрюги - 12,2 и 1,5 %, у осетра - 8,0 и 1,7 %.
В развитии клеток крови у предличинок осетровых рыб можно отметить следующие особенности: у всех анализируемых предличинок осетровых к моменту перехода на активное питание было завершено развитие клеток лимфоцитопоэтического и эритропоэтического ряда.
Таким образом, в предличиночный период развития (36-45 стадия развития) у осетровых рыб завершается эмбриональное кроветворение. В этот период мезонефрос является главным и единственным органом кроветворения, в котором образуются все типы клеток крови. Следует указать на то, что часть клеток крови завершала свое развитие в мезонефросе, другая часть поступала в периферическую кровь в виде бластных форм и завершала свое развитие внутри сосудов. Обнаружена видовая гетерохронность в развитии клеток эритропоэтического, лимфоцитопоэтического и миелоцитопоэтического рядов у предличинок осетровых рыб: у севрюги и белуги эритропоэз происходил более интенсивно, чем у осетра. Гранулоцитопоэз наиболее интенсивно происходил у предличинок севрюги.
Личиночный период развития. Возраст 10 дней активного питания. У личинок осетровых в структуре мезонефроса наблюдались характерные видовые отличия, в строении почечных телец проявляющиеся в наличии небольших капиллярных клубочков, занимающих центральное или периферическое положение в капсуле телец. Основной объем телец приходился на долю мочевого пространства. Наружный париетальный листок капсул телец был образован плоскими эпи-телиоцитами. От мезонефральных телец в виде «перешейка» отходили канальцы 1-го типа, которые были выстланы кубическим эпителием. Канальцы 1-го типа, образуя изгиб, переходили в значительный по объему следующий сегмент - проксимальный, или канальцы 2-го типа. Проксимальные отделы мезонефронов у всех исследуемых видов осетровых были выстланы однорядным призматическим эпителием. Мезонефральные канальцы 3-го типа представляли собой продолжение канальцев 2-го типа, имели площадь сечения несколько меньшую, чем последние, сравнительно широкий просвет и выстилались однослойным кубическим эпителием. Дистальные канальцы (канальцы 3-го типа) продолжались в канальцы 4-го типа, которые открывались в вольфовы протоки. Стенка канальцев 4-го типа была образована однослойным кубическим эпителием.
В почках личинок белуги встречались канальцы 4-го типа, которые служили коллекторами для нескольких мезонефральных нефронов. Обращало на себя внимание структурное сходство эпителия, выстилающего канальцы 4-го типа, и эпителия, выстилающего вольфов проток.
У личинок белуги, осетра и севрюги в возрасте 10 дней активного питания в мезонефросе, наряду с развивающимися клетками крови, встречались небольшие скопления ретикулярных клеток, тогда как в туловищной и хвостовой части почки ретикулярные клетки были единичными. Основную массу ретикулярных клеток составляли покоящиеся клетки. Это самые крупные из ретикулярных клеток, овальной формы и со слабобазофильной цитоплазмой, ядро бледно-окрашенное, содержало тонкие нити хроматина. Переходные ретикулярные клетки, малоактивные и активные ретикулярные клетки составили незначительную долю. Наименьшее количество полустволовых и унипотентных клеток-предшественниц находилось в мезонефросе белуги -1,8 и 2,2 % соответственно, у осетра - 3,1 и 2,4 %, максимальное их количество обнаружено у личинок севрюги - 2,5 и 4,6 %.
Анализ качественного состава развивающихся клеток крови показал: доминировали клетки эритропоэтического ряда у белуги - 55,0 % всех клеток крови и клетки лимфоцитопоэтического и миелоцитопоэтического рядов у осетра - 60,3 % и севрюги - 59,4 %. Следует указать, что в личиночный период развития с 10 дня активного питания начинается дифференцировка нейтрофилов, имеются нейтрофильные миелоциты: у белуги - 8,3 %, у осетра - 3,1 %, у севрюги - в 2,1 %. Развитие эозинофилов происходит активно, количество эозинофильных миелоцитов увеличилось: у белуги - 10,1 %, у осетра - 9,9 % у севрюги - 4,1 %.
В личиночный период развития, на 15 сутки активного питания, у белуги увеличивается количество межканальцевой ткани вентральной части мезонефроса - начинает развиваться головная почка. У осетра и севрюги особенностей морфологического строения головной и туловищной части отмечено не было.
Следовательно, в личиночный период развития морфологические единицы мезонефроса, мезонефроны, сформированы, отмечается их рост, проявляющийся в увеличении размеров почечных телец и канальцев. Кроме того, наблюдается смена клеток микроокружения. Эту функцию с личиночного периода и до окончания жизненного цикла осетровых рыб выполняли ретикулярные клетки. Одной из особенностей гемопоэза в этот период у осетровых является интенсивная дифференцировка гранулоцитов, причем развитие эозинофилов происходит активнее, чем развитие нейтрофилов.
Мальковый период развития. Возраст 45 дней активного питания. Качественный анализ состава развивающихся клеток крови и их микроокружения в мезонефросе молоди осетровых в возрасте 45 дней активного питания показал, что основу ретикулярной ткани составляли активные ретикулярные клетки: у белуги - 46,3 %, у осетра - 60,7 %, у севрюги - 51,7 %. Доля малоактивных ретикулярных клеток оставалась еще на довольно высоком уровне: у белуги - 35,1 %, у осетра - 32,0 %, у севрюги - 35,5 %. Покоящиеся и переходные ретикулярные клетки составили незначительное количество у всех мальков осетровых рыб. Развитие клеток крови происходило в кровяных островках. Количество полустволовых и унипотентных клеток-предшественниц увеличилось и составило: 5,3 % - у белуги, 7,6 % - у осетра, 8,5 % - у севрюги. Топографическое расположение родоначальных клеток у мальков осетровых значительно не изменилось: по-прежнему более половины всех клеток-предшественниц находилось в вентральной части мезонефроса. В туловищной и хвостовой частях наибольшее количество полустволовых клеток отмечено вокруг почечных канальцев 2-го и 3-го типа и почечных телец. Микроокружением полустволовых клеток были активные ретикулярные клетки в соотношении 1 : 12.
Анализ качественного состава развивающихся клеток крови показал, что количество лейкоцитов увеличилось: 60,2 % - у белуги, 61,1 % - у осетра, 54,0 % - у севрюги. В классе бластных клеток количество миелобластов увеличилось в 2 раза по сравнению с количеством миелобластов в личиночном периоде. Из класса созревающих клеток дифференцировка эозинофилов у осетра и белуги была завершена, имелись сегментоядерные эозинофилы - 0,1 и 1,3 %, у севрюги имелись палочкоядерные эозинофилы - 2,1 %. Созревание нейтрофилов еще не было закончено.
У осетра и белуги имелись палочкоядерные нейтрофилы - 1,6 и 0,7 %, у севрюги - нейтрофильные метомиелоциты - 2,1 %. Продолжилась дальнейшая дифференцировка лимфоцитов -в небольшом количестве у осетровых рыб имелись плазматические клетки. Микроокружением клеток крови служили активные и малоактивные ретикулярные клетки. Необходимо добавить, что среди кроветворной ткани мезонефроса белуги были найдены крупные макрофаги, которые располагались в медиальной части туловищной почки в непосредственной близости от почечной вены.
Туловищная почка без четких границ переходила в головную. В переходной зоне редко встречались почечные канальцы 2-го и 3-го типа. Головная почка была пронизана густой кровеносной сетью, вокруг крупных сосудов были отмечены небольшие единичные скопления хро-мафинной и интерреналовой ткани. Среди ретикулярных клеток встречались макрофаги - клетки округлой или овоидной формы, с центрально или несколько эксцентрично расположенным ядром. Следует указать на то, что чаще всего макрофаги были расположены вблизи кровеносных сосудов. Рядом с кровеносными сосудами располагались мегакариоциты - крупные клетки.
Именно головная почка содержала половину полустволовых и унипотентных клеток-предшественниц, причем их доля была выше, чем в туловищной и хвостовой части органа:
12,6 % - у белуги, 9,1 % - у осетра и 10,1 % - у севрюги. Особенностью качественного состава головной почки мальков осетровых было увеличение доли клеток бластного и созревающего классов. Среди ретикулярной ткани доминировали активные ретикулярные клетки, которые составили более половины всех клеток ретикулярной ткани. Малоактивные ретикулярные клетки составили одну четвертую часть, покоящиеся и переходные ретикулярные клетки встречались в незначительном количестве.
Таким образом, в мальковый период развития наблюдается интенсификация процессов кроветворения. Отмечается повышение активности гранулоцитопоэза и завершение дифферен-цировки эозинофилов - имеются палочкоядерные формы. Развитие нейтрофилов еще не закончено. Продолжилась дальнейшая дифференцировка лимфоцитов - плазматические клетки составили незначительное количество. Следует отметить, что в мальковый период развития мезонефрос морфологически был сформирован, имелось деление на головную и туловищную почки, в головной почке, кроме кроветворной ткани, имелась эндокринная (интерреналовая и хромафинная ткань).
Мальковый период развития. Возраст 150 дней активного питания. В туловищных почках всех исследуемых видов осетровых мезонефроны были полностью сформированы. Они дифференцировались на мезонефральные тельца, канальцы 1-го типа, проксимальные (канальцы 2-го типа) и дистальные (канальцы 3-го типа) сегменты и канальцы 4-го типа, впадающие в вольфов проток. Анализ межканальцевой ткани сеголеток осетровых показал, что среди ретикулярных клеток у всех исследуемых видов превалировали активные ретикулярные клетки, максимальное количество которых составляло: у белуги - 96,1 %, у осетра - 95,8 %, у севрюги -95,2 %. Доля молодых ретикулярных клеток у сеголеток была невысокой, но среди них малоактивных ретикулярных клеток оказалось больше, чем переходных и покоящихся ретикулярных клеток. Количество полустволовых и унипотентных клеток-предшественниц снизилось у сеголеток белуги (4,7 %) и осетра (6,6 %), чего не произошло у севрюги - у этого вида рыб количество родоночальных клеток оставалось по-прежнему высоким - 8,3 %. Необходимо отметить, что более половины этих клеток было найдено в вентральной части почки. Кроме того, наибольшее количество гемогистобластов и гемоцитобластов отмечено у сеголеток вокруг почечных канальцев 2-го и 3-го типа и почечных телец. Микроокружением полустволовых клеток были активные ретикулярные клетки. Доля клеток IV и V класса сократилась. Среди клеток созревающего класса доминировали клетки белой крови - гранулоциты - они составили одну четвертую всех развивающихся клеток крови, причем численно эозинофильные клетки превалировали над нейтрофильными. Среди зрелых клеток больше всего было лимфоцитов, причем наибольшее их количество наблюдалось у белуги - 20,7 %, наименьшее у севрюги - 13,9 %. Доля плазматических клеток увеличилась.
Микроокружением клеток крови у сеголеток служили только активные ретикулярные клетки. Необходимо добавить, что среди кроветворной ткани мезонефроса были макрофаги, которые располагались в медиальной, реже латеральной части туловищной почки в непосредственной близости от почечной вены или кровеносных сосудов.
Головная почка была покрыта общей с туловищной и хвостовой почкой тонкой соединительнотканной капсулой. Пигментные клетки в большом количестве располагались по периферии органа и подчеркивали его границы. Основу органа составили ретикулярная ткань и развивающиеся клетки крови. В топографии ретикулярных клеток следует отметить, что покоящиеся и переходные ретикулярные клетки, количество которых заметно снизилось, располагались небольшими группами. Активные ретикулярные клетки образовывали микроокружение для развивающихся клеток крови. Качественный анализ развивающихся клеток крови в головной почке осетровых показал, что количество полустволовых и унипотентных клеток крови было значи-
тельным. Следует отметить следующие особенности топографии клеток II и III класса. Развитие эозинофилов было завершено - имелись сегментоядерные формы клеток, тогда как развитие ней-трофильных клеток, возможно, завершалось в кровяном русле, в кроветворной ткани встречались только палочкоядерные нейтрофилы. Доля развивающихся клеток эритропоэтического ряда сократилась на одну четверть, наблюдался сдвиг эритроцитарной формулы вправо, т. е. превалировали более зрелые клетки крови. У всех анализированных рыб лимфоциты доминировали над ортохромными эритроцитами. Так, у севрюги количество лимфоцитов оказалось намного больше, чем у осетра и белуги - 20,0 %, эритроцитов было в 2 раза меньше - всего 9,7 %. У осетра и белуги эти клетки составили 15,4 и 15,3 % соответственно, при этом эритроцитов оказалось больше у белуги - 10,0 %, у осетра - 8,4 %. Следует указать также на процессы дальнейшего развития лимфоцитов - удельный вес плазматических клеток в головной части почки увеличился и был максимальным у осетра - 4,3 %, 3,9 % - у белуги и 3,2 % - у севрюги. Клетки крови развивались в кровяных островках, диаметр которых не изменился по сравнению с 45-дневными мальками.
На этом этапе развития головная почка состоит только из гемопоэтической и эндокринной ткани и не выполняет выделительной функции. К пятимесячному возрасту в головной части почки происходит активное развитие и увеличение занимаемой площади интерреналовой и хромаффинной ткани. Клубочковая, или наружная, зона интерреналовой ткани образована крупными железистыми клетками удлиненной формы, которые наслаиваются друг на друга, образуя округлые или продолговатые скопления или одиночные группы. Эти клетки окрашены светлее остальных, в ядрах содержится 2-3 ядрышка. Нередко около подобных скоплений имелись гранулы гемосидерина довольно крупных размеров. Хромофильные клетки чаще всего располагались по ходу крупных кровеносных сосудов. Массивных скоплений отмечено не было.
Из вышесказанного можно заключить, что к моменту зимовки у осетровых рыб мезонеф-ральный тип кроветворения, осуществляемый до конца жизненного цикла, приобрел дефинитивные черты. Сформированы все клеточные ряды.
Заключение
Таким образом, мезонефрос является органом кроветворения, который раньше остальных начинает выполнять гемопоэтическую функцию и выполняет ее до конца жизненного цикла рыб. Следует отметить, что если в предличиночный период развития в гемопоэтической ткани почки заканчивается развитие клеток эритропоэтического и лимфоцитопоэтического рядов, то в личиночный период происходит формирование гранулярного ряда, причем раньше, чем в других кроветворных органах (на 43 стадии развития) отмечаются эозинофильные миелоциты и позже - ней-трофильные миелоциты. Выделение головной почки мезонефроса, которая принимает в кроветворении более активно участие, отмечается на 15 сутки активного питания у личинок белуги и в меньшей степени - у личинок осетра и севрюги. Выявлены особенности в топографическом расположении полустволовых и унипотентных клеток - большее их количество отмечено в средней части мезонефроса головной почки. В процессе исследования развития клеток крови установлено, что их формирование происходит в своеобразных «кровяных островках», центром которых являются полустволовые и унипотентные клетки или бластные формы клеток со своим микроокружением. С малькового периода развития начинает происходить не только морфологическая, но и функциональная специализация почки: для головной почки основная функция - кроветворение, для туловищной, вместе с кроветворением, - выделительная.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Волкова О. В., Елецкий Ю. К. Основы гистологии с гистологической техникой. - М.: Медицина. -1989. - 234 с.
Статья поступила в редакцию 12.10.2010
PHYSIOLOGICAL ASPECTS OF HEMOPOIESIS IN MESONEPHROS OF THE STURGEON
O. V. Lozhnichenko, A. V. Ampleeva, S. M. Khvostova
Mesonephros is a hemopoietic organ, which first starts to perform the hemopoietic function, and executes it until the end of the life cycle of fish. Cells development of erythropoietic and lymphocytopoiesis series is over in the prolarva period of the development in the hematopoietic tissue of the kidney, and the formation of the granular series occurs in the larval period, and eosinophilic myelocytes are marked much earlier than in other hematopoietic organs (the 43 stage of the development), and a bit later - neutrophil myelocytes. The isolation of head kidney of mesonephros is observed in 15 days of the active feeding in the larvae of the white sturgeon, and to a lesser extent in the larvae of the sturgeon and stellate sturgeon. The features in the topographic location of semi-stem and unipotent cells are revealed: the majority is marked in the middle of the head kidney mesonephros. It is established that the formation of blood cells takes place in so-called "blood islands", whose center is semi-stem and unipotent cells, or in blast-shape cells with its microenvironment. Both morphological and functional specialization begin from the larval period: hematopoiesis is the main function of the head kidney, and the excretory function - for the body together with hematopoiesis.
Key words: mesonephros, Wolff duct, vesicles, blood islands, gemogisto-blasty, hematopoiesis, mezonefrones, interrenal tissue, chromaffin tissue.
