CC BY
16
Физико-химические свойства и структурные исследования олигомицина 8С-ІІ, продуцируемого Зїгерїотусез уі^іпіае 17
А. Н. ДАНИЛЕНКО1, М. В. БИБИКОВА2, И. А. СПИРИДОНОВА2, Н. Э ГРАММАТИКОВА3, А. В. КАТЛИНСКИЙ4
1 Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва
2 ООО «Виорин», Москва
3 ООО «Олфарм», Москва
4 НПО «Микроген», Москва
Physico-Chemical Properties and Structure of Oligomycin SC-II, Produced by Streptomyces virginiae 17
A. N. DANILENKO, M. V. BIBIKOVA, I. A. SPIRIDONOVA, N. E. GRAMMATIKOVA, A. V. KATLINSKY
N. M. Emmanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow Viorin Co., Moscow Olfarm Co., Moscow Microgen Co., Moscow
При выполнении программы поиска антибиотиков с антифунгальной и иммуносупрессивной активностью отобрана культура Streptomyces virginiae 17, которая образовывала комплекс антибиотиков олигомицинов. Разделение комплекса на индивидуальные компоненты методом ВЭЖХ показало, что он состоит из двух компонентов в соотношении 8:2. Были изучены физико-химические характеристики компонентов антибиотического комплекса. Методом ЯМР 13С и 1Н определена структура олигомицина.
Ключевые слова: Streptomyces virginiae, олигомицин SC-II, физико-химические свойства.
Under the screening programme for antibiotics with antifungal and immunosuppressive activities, Streptomyces virginiae 17 producing an oligomycin complex was isolated. Separation of the complex by HPLC showed that it contained two components at a ratio of 8:2. The physico-chemical characteristics of the components were investigated. The structure of oligomycin was assessed by 13C NMR and 1H NMR.
Key words: Streptomyces virginiae 17, oligomycin SC-II, physico-chemical properties.
При выполнении программы поиска антибиотиков с гиполипидемической и антифунгальной активностью нами была отобрана культура Streptomyces sp.1V, выделенная из почвенного образца Тувы [1]. Культура образовывала комплекс антибиотиков, близких по физико-химическим свойствам олигомицинам А, В и С [2, 3], но отличающихся от них временами удерживания при хроматографии на колонке С18 и антибиотической активностью. По своей химической природе олигомицины являются макролидными антибиотиками, содержащими 26-членный а, в-ненасы-щенный лактон, соединенный с бициклической спирокетальной группировкой.
Выделение и очистка
Культуральную жидкость фильтровали на бумажном фильтре № 3 под вакуумом водоструйно© Коллектив авторов, 2012
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул, 3 а. ООО «Олфарм»
го насоса. Фильтрат отбрасывали, а осадок помещали в химический стакан и экстрагировали антибиотик ацетоном дважды при массовом соотношении мицелий/ацетон 1:3 в течение 1 ч при перемешивании механической мешалкой. После каждой экстракции мицелий от жидкости отделяли на фильтре № 3. В полученных фильтратах определяли содержание антибиотика методом ВЭЖХ, используя в качестве стандарта для количественных расчётов препарат фирмы Sigma, содержащий 60% олигомицина А, 30% олигомицина В и 10% олигомицина С.
Количественное содержание антибиотика в культуральной жидкости составляло, по данным ВЭЖХ, 37 мг/л. Наилучшее разделение компонентов комплекса было достигнуто при следующих условиях: хроматографическая колонка Alltima С 18 (250x4,6 мм ; 5 мкм); подвижная фаза — метанол/вода в соотношении 85:15; скорость потока — 0,8 мл/мин, детектирование — 225 нм; объём вводимой пробы — 20 мкл (с=240 мкг/мл). В этих условиях на хроматограмме получали два
Рис. 1. Хроматограмма препаративного выделения олигомицина.
Условия: колонка — Zorbax C18 (250x22 мм; 5 мкм); подвижная фаза — метанол:вода в соотношении 85:15; скорость протока — 8 мл/мин; детектирование — рефрактометрия; объем вводимой пробы — 1 мл (с = 30 мг/мл).
пика с временами удерживания 11,5 и 13,2 мин и соотношением площадей под пиками 8:1. Методом ВЭЖХ показано, что хроматографический пик с временем удерживания на колонке 13,2 мин(минорный компонент) соответствует времени удерживания олигомицина А для стандартного образца. На этом основании можно считать, что минорный компонент олигомицинового комплекса является олигомицином А.
В первом ацетоновом экстракте, по данным ВЭЖХ, находилось 85% антибиотика от его содержания в культуральной жидкости, а во втором — ~15%. Следует отметить, что второй экстракт был сильно пигментирован и по этой причине для дальнейшей очистки антибиотика не использовался. Первый фильтрат упаривали на роторном испарителе под вакуумом водоструйного насоса при температуре 40°С до полного удаления ацетона. Образовавшуюся водную суспензию помещали в колбу с притертой пробкой, добавляли двукратный объем этилового эфира и экстрагировали антибиотик в течение 1 ч при перемешивании на магнитной мешалке. Смесь помещали на делительную воронку, выдерживали ее до полного разделения на две фазы. Верхнюю (эфирную) фазу, содержащую ~97% антибиотика от его содержания в ацетоновом экстракте (определено методом ВЭЖХ), собирали в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе досуха при комнатной температуре. Сухой остаток растворяли в 100 мл 80%-ого водного метанола и приливали равный объем гексана. Экстракцию проводили при перемешивании на магнитной мешалке в течение часа. Смесь помещали на делительную
Рис. 2. Аналитическая хроматограмма хроматографически очищенного олигомицина.
Условия: колонка — Alltima C18 (250x4,6 мм; 5мкм); подвижная фаза — метанол:вода в соотношении 85:15; скорость протока — 0,8 мл/мин.; детектирование УФ при 225 нм; объем вводимой пробы — 20 мкл (с = 240 мкг/мл).
воронку и после разделения на фазы, нижнюю фазу (водно-метанольную) содержащую ~95% антибиотика от его содержания в эфирном экстракте (определено методом ВЭЖХ) собирали в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе досуха. Сухой остаток в виде кристаллов растворяли в 4 мл метанола и использовали для дальнейшей очистки методом препаративной ВЭЖХ в обращенных фазах.
Хроматографическая колонка 2огЪах С18 (250x22 мм, 5 мкм), подвижная фаза — метанол/вода при соотношении 85:15, скорость протока — 8 мл/мин, детектирование осуществляли рефрактометром, объём вводимой пробы — 1 мл при концентрации — 30 мг/мл. Хроматограмма при препаративной наработке основной фракции-1 приведена на рис. 1. Фракцию собирали в круглодонную колбу и упаривали на роторном испарителе досуха. Полученный кристаллический препарат досушивали в эксикаторе над пяти-окисью фосфора под вакуумом. На рис. 2 приведена аналитическая хроматограмма полученного препарата. Степень очистки по данным ВЭЖХ не менее 98%.
Физико-химические свойства
В табл. 1 приведены физико-химические свойства исследуемого компонента антибиотического комплекса (фракция 1), продуцируемого культурой Streptomyces virginiae 17.
УФ-абсорбционные спектры получены на спектрофотометре Specord UV VIS (Каг1 Zeiss) при концентрации антибиотика в растворе мета-
Таблица 1. Физико-химические свойства олигомицина (фракция-1), выделенного из Streptomyces v'rginiae 17
Физико-химические свойства Параметры
Moлeкyлярнaя ма^а, d(MS) УУ8
Брутто фoрмyлa (данные элeмeнтнoгo анализа) C44H74O11
Брутто фoрмyлa (данные ßMP) C44H74O11
Удeльнoe вращение, [a]D, в CH3OH, ° -44,7(c=0,36)
УФ-aбcoрбциoнный cпeктр, нм 220; 225; 233; 242
Удельная экcтинция(E12CM, CH3OH) 450
ИK-cпeктр, vmax (cм-1) 3435, 2964, 2929, 1У02,1644,1459,1385,1284,1225,1136,98У
Температура плавления криcтaллoв, °C 102-105
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Wavenumber cm-1
Рис. 3. ИК-спектр исследуемого олигомицина.
Спектр снят в таблетках KBr на ИК-спектрометре Bruker Logo, Type JFS113.
BSK-17a #2-40 RT: 0.03-0.83 AV: 39 NL: 3.86E6 T: +p ESI Full ms [220.00-1500.00]
10CH
95-^
9fc
85-f
80z
7fc
65-^
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
_______________________________________________________________________________miz_______________________________________________________________________________________
Рис. 4. Масс-спектр исследуемого олигомицина.
Получен на масс-спектрометре LCQ deca XP при ионизирующем напряжении 3,2 кВ и температуре 200°С. Ион с m/z = 801,7 соответствует Na+ форме олигомицина.
ноле 20 мкг/мл в 1 см кюветах. Удельные экс-
тинкции oпрeдeлeны при длинє вoлны 225 нм. УФ-отектры для oлигoмицинa А [3] и толученто-гo нами антибтотика идентичны (табл. 1). Они
имєют мaкcимyмы пoглoщeния при oднoй и тoй жє длинє вoлны и 3 «плеча», рacпoлoжeнныe при oдинa-кoвыx длинax вoлн. Удельная эга-тинция для нaшeгo антибтотика равна 450 (cм. табл. 1), что практиче-cки coвпaдaeт c вeличинoй для oли-гoмицинa А (е=436) [3]. É^OTe^-ры толучены в тaблeткax KBг на прибoрe Bгukeг Logo, Туре JFS113 приведены на рто. 3 и значения vmax в табл. 1. Значения vmax для нaшeгo aнтибиoтикa и oлигoмицинa А при-вeдëнныe в рaбoтe [4], прaктичecки пoлнocтью швпадают.
Пoлyчeнныe данные cвидeтeль-cтвyют o том, что выделенный нами антибтотик близoк к извecтным aнтибиoтикaм группы oлигoмици-нoв, нo oтличaeтcя то времени удерживания на кoлoнкe C18 oí oлигoмицинoв А, В и C (данные не привoдятcя).
Moлeкyлярнaя мacca антибтоти-ка была oпрeдeлeнa на мacc-cпeкт-рoмeтрe LCQ deca XP при тонизирующем напряжении 3,2 кВ и температуре на капилляре 200°C (рто. 4). Значение мoлeкyлярнoй ма^ы пoлyчeннoгo aнтибиoтикa приведето в табл. 1. Она o^maeTCH oт мoлeкyлярныx мacc для извест-ныx oлигoмицинoв [2—4].
Элементный анализ, прoвe-дëнный мeтoдoм cжигaния прoбы и c yчëтoм мoлeкyлярнoй ма^ы анти-биoтикa дал cлeдyющyю брутто фoр-мулу — C44Hy4Oll.
Удельтое вращение антибтоти-ка в метатоле (c=0,36%) быго o^e-дeлeнo на толяриметре Peгkin-Elmeг 141 при длине вoлны 589 нм в 1 дм кювете. Слученные данные приведены в табл. 1.
Температура плавления крто-тaллoв была oпрeдeлeнa в кaпиллярax и мeтoдoм дифференциальтой cкaнирyющeй кaлoримeтрии на прибoрe DSM-З при cкoрocти cкaнирoвaния 8
Таблица 2. Данные двухмерного ЯМР антибиотика 17, выделенного из Streptomyces virginiae 17
C, №. Группа à (C), ppm à (H), ppm
1 O=C-O 165,2644 —
2 CH sp2 122,1339 5,80
3 CH sp2 149,7556 6,70
4 CH 40,8888 2,48
5 CH-O 80,4529 3,66
6 CH 36,1898 1,86
У CH-O 80,2614 3,88
8 CH 41,2706 1,48
9 CH-O 68,0141 4,04
10 CH2 31,6146 2,76
11 C=O 217,7442 —
12 Cquaгt-O(H) 82,5768 —
13 CH-O 71,5457 4,05
14 CH 33,3845 1,87
15 CH2 38,3599 2,12
16 CH sp2 129,8501 5,24
1У CH sp2 132,5892 6,07
18 CH sp2 130,4746 5,97
19 CH sp2 137,3733 5,27
20 CH 46,2310 1,86
21 CH2 31,5359 1,53/1,47
22 CH2 31,0173 1,65/1,04
23 CH-O 68,9108 3,80
24 CH 35,7796 2,15
25 CH-O 76,3116 4,90
26 CH 37,7609 1,82
2У O-Cquaгt-O 99,0818 —
28 CH2 26,0362 1,93/1,25
29 CH2 26,5444 2,13/1,42
30 CH 30,5374 1,58
31 CH-O 67,2142 4,01
32 CH2 42,6325 1,62/1,30
33 CH-O 64,6993 4,05
xxi CH2 28,7336 1,40/1,30
xxxiii CH3 24,7347 1,24
xii CH3 20,9723 1,17
iv CH3 17,9258 1,7
xiv CH3 14,6784 1,02
xxii CH3 12,0307 0,84
xxvi CH3 11,8917 0,98
xxx CH3 11,2475 0,92
viii CH3 9,1791 1,03
xxiv CH3 5,9346 0,86
vi CH3 4,4784 0,86
град/мин в диапазоне температур от 50 до 170°С (см. табл. 1).
Используя физико-химические данные, приведенные в табл. 1, был проведён поиск по банку данных для антибиотиков (Berdy Вегёу J. BNPD, data base for microbial metabolite research. Abstr of Intern Conf Microbial Secondary Metabolism. Interlaken, Suisse 1994: 2). Однако антибиотик с приведёнными физико-химическими характеристиками не был найден.
Спектры ЯМР 13С и :Н получены на ЯМР-спе-ктрометре Brurar DRX 500 (500/125 МГЦ 'Н/13С) в CDCl3 при комнатной температуре (10 мг препарата антибиотика растворяли в 0,5 мл CDCl3). Отнесение сигналов в спектрах выполнено при помощи двухмерных экспериментов: COSY,
Рис. Б. Химическая формула олигомицина SC-II олигомицина SC-II полученного нами (а) и из японского патента (б).
TOCSY, ROESY, HSQC и HMBC. Xимичecкиe сдвиги cигнaлoв 13C и *H ЯMP aнтибиoтикa 17 представлены в табл. 2.
Ha ocнoвaнии этик данньгс была ycтaнoвлeнa xимичecкaя фoрмyлa антиб^^ка, как aнaлoгa группы oлигoмицинoв (риа 5, а). При детальтом анализе литературы найден я^^кий патент [5], в кoтoрoм приведены данные двyxмeрнoгo ЯMP и xимичecкaя фoрмyлa oлигoмицинa SC-II (риа 5, б), cooтвeтcтвyющaя нашим данным. Одната в yкaзaннoм патенте дoпyщeнa oшибкa, ЯMP данные 13C для yглeрoдoв C(38) и C(39) дoлжны быть прoнyмeрoвaны в прoтивoпoлoжнoм пoрядкe.
Следует так же отметить, что олигомицин SC- II запатентован в Японии на японском языке, а продуцентом антибиотика является грамотрица-тельная энтеробактерия Pantotea aglomerans [5].
ЛИТЕРАТУРА
1. Бибикова М. В. Грамматикова Н. Э. и др. Штамм Streptomyces sp. 17 — продуцент антибиотика олигомицина SC-II.([xарактеристика продуцента, биологически свойства антибиотика). Антибиотики и химотер 2012; 7—8; 3—6.
2. Smith R. A., Peterson W. H., Соу E. Oligomycin, а new antifungal antibiotic. Antibiot Chemother 1954; 4: 962—970.
3. Nakakita Y., NaKagava M., Sakai H. Isolation of oligomycin А аs а result of screening for antagonists of lipids. J Antibiot 1980; 33: 514—516.
Таким образом установлена структура нового компонента комплекса антибиотика 17 (фракция 1), которым отличается от олигомицинов А,В,С и соответствует олигомицину SC-II.
4. Кабанов A. E., Даниленко A. H., Спиридонова И. А. и др. Определение структуры основного компонента антибиотического комплекса, образуемого Streptomyces driseolus 182. Антибиотики и хи-миотер 2003; 10: 16—20.
5. Daisuke K., Makato K., Yamada K. et. al. Oligomycin SC compounds of Pantotea Agliomerans as anticancer agents. J P Pat Appl 09,208,587 (C1.C07D493/20) aug.12,1997.
