CC BY
14Cyclodextrins
Циклодекстрины
Макрогэтэроцмклы
Статья
Paper
http://macroheterocycles.isuct.ru
DOI: 10.6060/mhc141139y
Физико-химическая характеристика и биологическая активность супрамолекулярного комплекса глицирама с в-циклодекстрином
Л. А. Яковишин,а@ В. И. Гришковец,ь Е. Н. Корж,а Е. В. Ветрова,с Н. И. Борисенкос
Севастопольский национальный технический университет, 299053 Севастополь, Россия ъТаврический национальный университет имени В.И. Вернадского, 295007 Симферополь, Россия сНИИ физической и органической химии Южного федерального университета, 344090 Ростов-на-Дону, Россия @Е-таИ: chemsevntu@rambler.ru
Методом спектрофотометрии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением исследовано комплексообразование лекарственного вещества глицирама (моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты, GC) с в-циклодекстрином (в-СБ). Показано, что в водном растворе при рН 7.2 GC образует с в-СБ комплекс состава 1:1. Рассчитана константа устойчивости комплекса и свободная энергия Гиббса процесса комплексообразования. в-СБ может быть перспективным стабилизатором GC. Установлено, что комплекс не обладает ихтиотоксичностью.
Ключевые слова: Глицирам, в-циклодекстрин, молекулярный комплекс, спектрофотометрии, масс-спектрометрия, ихтиотоксичность.
Physico-Chemical Characteristic and Biological Activity of the Supramolecular Complex of Glycyram with p-Cyclodextrin
Leonid A. Yakovishin,a@ Vladimir I. Grishkovets,b Elena N. Korzh,a Elena V. Vetrova,c and Nikolay I. Borisenkoc
aSevastopol National Technical University, 299053 Sevastopol, Russia hV.I. Vernadsky Taurida National University, 295007 Simferopol, Russia
cInstitute of Physical and Organic Chemistry, Southern Federal University, 344090 Rostov-on-Don, Russia @Corresponding author E-mail: chemsevntu@rambler.ru
Glycyram (monoammonium glycyrrhizinate, GC) is an anti-inflammatory and antiallergic drug, and is used in medical practice. GC over time is exposed to epimerization and decay. The possibility of complexation with fi-cyclodextrin (fi-CD) was examined to improve the stability of GC. The complexation of GC with fi-CD in aqueous solution at pH 7.2 was investigated by method of spectrophotometry. The composition of the complex was determined by the isomolar series method (Job-Ostromyslenskii method). GC forms 1:1 complex with fi-CD. Stability constant for complex Ks(GC-fi-CD)=2.61-104 M-1. Gibbs's free energy of complexation process was calculated. Thus, fi-CD can be a promising stabilizer of GC. Using a method of electrospray ionization mass spectrometry, the complexation of GC with fi-CD was investigatedfor the first time. In negative-ion mode, the ion peaks of complexes with 1:1 and 1:2 molar ratio were recorded. The complex with a 1:1 molar ratio was the most stable. In positive-ion mode, complexation of GC and fi-CD was not observed. The influence of the GC-fi-CD complex against Poecilia sphenops (Poeciliidae) was studied. GC, fi-CD, and their 1:1 complex are not ichthyotoxic.
Keywords: Glycyram, p-cyclodextrin, molecular complex, spectrophotometry, electrospray ionization mass spectrometry, ichthyotoxicity.
Введение
Циклодекстрины (CD) и их производные широко используют для молекулярного капсулирования лекарственных веществ.[1-5] Получены молекулярные комплексы CD с рядом терпенов и терпеноидов. При этом основное внимание было уделено комплексам моно-и сесквитерпенов и их производных.[6]
Фрагментарно исследовано комплексообразование некоторых тритерпеноидов и их гликозидов с различными CD. В частности, получены комплексы бетулино-вой кислоты с диметил- ß-CD,[7]y-CD[8] игидроксипропил-y-CD,[7,9] бетулина с гидроксипропил-y-CD,[9I олеано-ловой и урсоловой кислот с диметил-ß-CD,[7I y-CD,[8] гидроксипропил-y-CD,[7I гидроксипропил-ß- и y-CD [1011] и олеаноловой кислоты с a-, ß- и y-CD.[12]
Описаны комплексы даммаранового тритерпе-нового гликозида 20-0-ф-0-глюкопиранозил)-20(>$')-протопанаксадиола с ß-CD и его гидроксипропильным производным.[13] Установлено, что дикалиевая соль гли-цирризиновой кислоты образует клатраты с ß-CD и его ди- и триметильными производными.[14] Глицирризино-вая кислота (3-0^-0-глюкуронопиранозил-(1^2)-0^-D-глюкуронопиранозид глицирретиновой кислоты) -преобладающий тритерпеновый гликозид различных видов солодки Glycyrrhiza L.
Наиболее важным производным глицирризиновой кислоты является ее моноаммонийная соль (глицирам, GC, Рисунок 1). GC относится к противовоспалительным и антиаллергическим средствам и широко применяется в медицинской практике.[15]
Рисунок 1. Глицирам (моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты, GC).
Известно, что в водных растворах глицирризино-вая кислота и GC подвергаются эпимеризации.[16] Гли-цирризиновая кислота не устойчива к нагреванию.[17] Установлено, что при хранении некоторых лекарственных форм с GC в них быстро уменьшается его содер-
жание даже при комнатной температуре.[18] Глицирри-зиновая кислота и GC подвергаются деструкции из-за взаимодействия со свободными радикалами и кислородсодержащими частицами, проявляя при этом анти-оксидантную активность.[19]
CD традиционно используют для повышения устойчивости лекарственных веществ путем комплек-сообразования с ними.[2] Поэтому с целью поиска перспективных стабилизаторов GC и расширения сведений о комплексах CD с сапонинами нами рассмотрена возможность образования комплекса GC с ß-CD, одного из наиболее коммерчески доступных CD. Комплек-сообразование может увеличить срок хранения лекарственных препаратов, содержащих GC.
Установлено, что CD нетоксичны,[1] но их токсический профиль может отличаться в зависимости от способа введения в организм.[20] Тритерпеновые гликози-ды проявляют разнообразное биологическое действие, в частности они могут быть токсичны для рыб и мол-люсков.[21,22] При этом их токсические свойства могут коррелировать с другими видами активности.[21] Кроме того, степень активности комплекса и индивидуальных веществ, которые его образуют, может существенно отличаться.[23,24] Поэтому для предварительной оценки биологической активности комплекса ß-CD с GC нами исследованы его ихтиотоксические свойства.
Экспериментальная часть
Использовали образцы GC фирмы Calbiochem (США) и ß-CD фирмы Acros Organics (США). ß-CD предварительно сушили до постоянного веса при 50-80 °С в течение 3 ч.
Изомолярпую серию готовили из 10-4 M водных растворов ß-CD и GC с рН 7.2 (фосфатный буфер Na2HPO4-NaH2PO4), которые смешивали в антибатных соотношениях (от 1:9 до 9:1) при неизменном общем объеме. Смеси выдерживали при температуре 28 °С в течение 40 мин при постоянном перемешивании. Для определения состава комплекса и константы его устойчивости Ks было проведено 5 независимых экспериментов. При этом погрешность определения Ks пе превышала 10%. Расчет К выполнен при Х=258 пм. УФ-спектры получены при температуре 28 °С на спектрофотометре Unico UV-Vis 4802 (США) в кварцевых кюветах (1=1 см).
Комплекс получали препаративно путем смешивания по 0.1 ммоль компонентов с 25 мл 40 % этапола при 40-50 °C в течение 1.5 ч при постоянном перемешивании. Растворитель отгоняли в вакууме.
Масс-спектральные измерения проведены па спектрометре Bruker Daltonics micrOTOF-Q с ионизацией электрораспылением. Использовали программное обеспечение micrOTOFcontrolTM2.2. Калибровка масс-спектрометра выполнена с использованием калибровочного раствора для электрораспыления (Electrospray Calibrant Solution) фирмы Fluka. Детектирование отрицательных и положительных иопов выполнено в интервале m/z от 50 до 3000. Согласно характеристикам прибора точность измерений на micrOTOF-Q II достигает выше 1-2 ppm, точность определения масс 2 мДа. Напряжение на капилляре распылителя ±4200 В, параметры газа-осушителя (азот квалификации «ос.ч.», 5 л/мин, 200 °С) оптимизированы для детектирования пиков иопов ассоциатов. Для прямого ввода использованы растворы веществ в метаноле (фирма Merck, квалификация HPLC/MS) в концентрации 0.2 мг/мл (10-7-10-6 М). Соотношения m/z и относительные
Supramolecular Complex of Glycyram with P-Cyclodextrin
интенсивности пиков ионов (I, %) приведены в Таблице 1.
Таблица 1. Масс-спектры смеси GC и P-CD.
Ион Соотношение m/z I , % отн'
[Me"CD+2K+H]3+ 404.54 8.13
[Me"CD+Na+H]2+ 579.34 16.6
[Me-CD+K+H]2+ 587.33 100.0
[Me-CD+Na]+ 1157.68 1.0
[MGC-3H]3- 273.12 20.8
[MGC-2H]2- 410.18 100.0
[Me"CD-2H]2- 566.16 1.7
[Me"CD+MGC-3H]3- 651.23 1.7
[MGC-H]- 821.37 2.4
[MP-cd+Mgc-2H]2- 977.35 0.9
[2Mp-cd+Mgc-3H]3- 1029.68 0.2
[Me"CD-H]- 1133.33 0.1
[2Me"CD+MGC-2H]2- 1544.53 0.01
Ихтиотоксичность проверяли на рыбах РоесШа sphenops (РоесПШае) по известной методике.[25] Рыб (по 10 штук) помещали в 10-4 М растворы GC и P-CD, а также в их комплекс, содержащий по 10-4 М каждого из компонентов. Определяли время инкубации, в течение которого происходил бы 100 % летальный исход.
Результаты и обсуждение
Спектральные исследования
Состав комплекса p-CD с GC определен методом изомолярных серий (методом Остромысленского-Жоба).[26] На Рисунке 2 показана изомолярная кривая, полученная для смеси p-CD и GC. При этом для компонентов установлено молярное отношение, соответствующее комплексу состава 1:1. Клатраты такого со-
ДД258
Рисунок 2. Зависимость изменения оптической плотности АЛ от соотношения компонентов изомолярной серии при Х=258 нм: с(Р-СБ)=10-4 М, с(ОС)= 10-4 М (рЯ 7.2, 28 °С).
става наиболее характерны для CD.[1I Спектр поглощения изомолярной серии обладает изобестической точкой при 296 нм (Рисунок 3). Наличие изобестической точки указывает на формирование лишь одного типа комплекса между p-CD и GC.[26I Кроме того, с увеличе -нием концентрации p-CD и постоянной концентрации GC максимум поглощения их смесей (258 нм) существенно не сдвигается, но уменьшается их оптическая плотность Л (Рисунок 4). Наблюдается гипохромный эффект, который обычно обнаруживается при образовании комплексов CD.[3I
Рисунок 3. Спектры поглощения изомолярной серии растворов: c(P-CD)=1Q-4 М, c(GC)= 10-4 М (рЯ 7.2, 28 °С).
Рисунок 4. УФ-спектры растворов GC (с=10-4 М=сош^ при различных концентрациях Р-СБ (рЯ 7.2, 28 °С): 0 М (кривая 1), 1.25-10-4 М (кривая 2), 2.5-10-4 М (кривая 3) и 5.0-10-4 М (кривая 4).
Таким образом, в водном растворе устанавливается равновесие между P-CD и GC следующего вида:
P-CD + GC 5 P-CD-GC
K = [¡3 - CD - GC] ^ [3 - CD][GC] '
(1)
где К - константа устойчивости комплекса.
На основе изомолярной кривой по формуле (2) была рассчитана константа устойчивости комплекса К при Х=258 нм по методу,[27] применимому для комплексов состава 1:1.
ДА ДД
K =- 01
с(ДД0 -ДД1)2
(2)
где с - общая концентрация, равная 10 4 М, ДА0 -изменение оптической плотности, соответствующее комплексу при полном отсутствии диссоциации, а ДА1 -изменение оптической плотности, соответствующее значению на фактической кривой.
Свободная энергия Гиббса ДО для процесса комплексообразования определена по формуле (3).
AG=-2.3RT lgKS.
(3)
и [Мр"сс+Мос-3Н]3- (т/г=651.23), соответствующие комплексам состава 1:1. Кроме того, идентифицированы малоинтенсивные пики ионов комплексов [2Мр-сс+Мос-3Н]3- с т/?=1029.68 и [2Мв-сс+Мос-2Н]2- с т/?=1544.53, в которых соотношение компонентов равно 2:1. Комплексы состава 1:1 существенно преобладают в масс-спектре, т.к. интенсивности пиков их ионов больше в 8.5 раз (для трехзарядных ионов) и в 90 раз (для двух-зарядных ионов).
В режиме регистрации положительных ионов преобладает пик иона [МР-сэ+К+И]2+. При этом ионов, отвечающих образованию комплекса p-CD с GC, не зафиксировано.
Биологическая активность
Установлено, что индивидуальные Р-СЭ и GC, а также их комплекс состава 1:1, не проявили токсического действия на рыб РоесШа &ркепор&' (РоесПШае) при экспозиции в течение 24 ч. Гликозиды олеананового типа с высокой токсичностью обычно имеют свободную карбоксильную группу у атома С-17 их агликонов.[22] У GC в агликонной части присутствует свободная карбоксильная группа, но она расположена у атома С-20. Таким образом, активность комплекса и образующих его компонентов не отличается.
Таким образом, для комплекса GC и Р-сЭ К^2.61-104 М-1. Д0=-2.54-104 Дж/моль. У ряда комплексов глицирризиновой кислоты и GC с лекарственными веществами К[=103-105 М-1.[23-28]
Среди комплексов тритерпеновых гликозидов с р-сэ К были определены только для комплексов 20-О-(Р -Б-глюкопиранозил)-20(£ )-протопанаксадиола с Р-СЭ и гидроксипропил-Р-СЭ,[13] а также для комплексов дикалиевой соли глицирризиновой кислоты с Р-СЭ и диметил- и триметил-Р-сЭ.[14] Для комплексов гликозида протопанасадиола они равны 4.52-10-3 и 0.68-10-3 М-1, соответственно, а для комплексов дикалий глицирризината - 470, 2.3-103 и 9.2 М-1. Существенные различия величин К комплексов GC и гликозида про-топанаксадиола возможно связаны с особенностями структуры их агликонных частей. У GC пентацикличе-ский агликон (олеанановый тип), а протопанаксадиол -это тетрациклический даммарановый агликон. В отличие от GC, у дикалий глицирризината нет свободных карбоксильных групп в углеводной части. Также ранее были установлены К для комплексов индивидуальных пентациклических агликонов. Так, в водной среде К комплекса Р-СЭ с олеаноловой кислотой составила только 57.6 М-1.[12]
Высокое значение К комплекса GC с Р-СЭ позволяет рассматривать Р-СЭ как перспективный стабилизатор GC в водных растворах, а также в составе его лекарственных форм.
Наличие комплексообразования между GC и Р-сЭ также подтверждали методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. В масс-спектре отрицательных ионов, полученном для смеси GC и Р-СЭ, наибольшую интенсивность имеет пик иона [М^-2И]2-. Также найдены пики ионов [МР-сс+М^-2Н]2- (т^=977.35)
Выводы
1. Спектрофотометрически исследовано взаимодействие Р-сЭ с GC в водных растворах при рН 7.2. Методом изомолярных серий установлено, что комплекс Р-СЭ^С имеет состав 1:1. Рассчитана константа устойчивости комплекса К=2.61-104 М-1. Р-СЭ может быть
s 1
перспективным стабилизатором GC.
2. В масс-спектре преобладают пики ионов комплекса Р-СЭ с GC состава 1:1.
3. Комплекс Р-СЭ с GC не оказал токсического действия на рыб РоесШа &ркепор&\
Благодарность. Работа проведена при финансовой поддержке РФФИ (проект 14-43-01031 р_юг_а). Масс-спектроскопические исследования выполнены Е.В. Ветровой и Н.И. Борисенко при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках государственного задания по проекту №1895.
Список литературы
References
1. Steed J.W., Atwood J.L. Supramolecular Chemistry Chichester: John Wiley & Sons, Ltd, 2000. 745 p.
2. Challa R., Ahuja A., Ali J., Khar R.K. AAPSPharm. Sci. Tech. 2005, 6, E329-E357.
3. Li S., Purdy W.C. Chem. Rev. 1992, 92, 1457-1470.
4. Singh R., Bharti N., Madan J., Hiremath S.N. J. Pharm. Sci. Tech. 2010, 2, 171-183.
Supramolecular Complex of Glycyram with ß-Cyclodextrin
5. Brewster M.E., Loftsson T. Adv. Drug Deliv. Rev. 2007, 59, 645-666.
6. Yakovishin L., Grishkovets V., Schroeder G., Rybachenko V. Supramolecular Complexes of Terpenes and Their Derivatives with Cyclodextrins. In: Molecular Receptors (Rybachenko V.I., Ed.) Donetsk: East Publisher House, 2011. p. 285-316.
7. Claude B., Morin Ph., Lafosse M., Andre P. J. Chromatogr. A. 2004, 1049, 37-42.
8. Fontanay S., Kedzierewicz F., Duval R.E., Clarot I. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2012, 73, 341-347.
9. Soica C.M., Dehelean C.A., Peev C.I., Coneac G., Gruia A.T. Farmacia 2008, 56, 182-190.
10. Cerga O., Borcan F., Ambrus R., Popovici I. J. Agroalim. Proces. Technol. 2011, 17, 405-409.
11. Cerga (Vlaston) O., Borcan F., Bernad E., Popovici I. J. Agroalim. Proces. Technol. 2012, 18, 130-135.
12. Guo M., Zhang S., Song F., Wang D., Liu Z., Liu S. J. Mass Spectrom. 2003, 38, 723-731.
13. Lee P.S., Han J.-Y., Song T.W., Sung J.H., Kwon O.-S., Song S., Chung Y.B. Int. J. Pharm. 2006, 316, 29-36.
14. Tamagaki S., Koide M., Takahashi M., Mizushima T., Ukawa J., Tagaki W. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 1996, 1257-1260.
15. Mashkovskii M.D. Drugs. Vol. 1, Kharkov: Torsing, 1997. 560 p. (in Russ.) [Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1, Харьков: Торсинг, 1997. 560 с.].
16. Baltina L.A., Serdyuk N.G., Flekhter O.B., Krasnova L.V., Davydovva V.A., Ismagilova A.F., Zarudii F.S., Tolstikov G.A. Pharm. Chem. J. 1996, 30, 613-616.
17. Zapesochnaya G.G., Zvonkova E.N., Kurkin V.A., Kaza-kova E.V., Pervykh L.N., Sheichenko B.I., Bykov V.A. Chem. Nat. Compd. 1994, 30, 720-726.
18. Abramovich R.A. Author's abstract Cand. Diss. Pharm. Sci., Moscow, 1994. 23 p. (in Russ.).
19. Tolstikov G.A., Baltina L.A., Grankina V.P., Kondratenko R.M., Tolstikova T.G. Licorice: Biodiversity, Chemistry, Application in Medicine. Novosibirsk: Geo, 2007. 311 p. (in Russ.) [Толстиков Г. А., Балтина Л.А., Гранкина В.П., Кондратенко Р.М., Толстикова Т.Г. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: Академическое издательство «Гео», 2007. 311 с.]
20. Gould S., Scott R.C. Food Chem. Toxicol. 2005, 43, 14511459.
21. Hostettmann K., Marston A. Saponins. Cambrige: Cambrige University Press, 1995. 548 р.
22. Podolak I., Galanty A., Sobolewska D. Phytochem. Rev. 2010, 9, 425-474.
23. Tolstikova T.G., Khvostov M.V., Bryzgalov A.O. Mini Rev. Med. Chem. 2009, 9, 1317-1328.
24. Yakovishin L.A., Lekar A.V., Vetrova E.V., Borisenko N.I., Borisenko S.N., Grishkovets V.I. Biopolym. Cell. 2012, 28(1), 62-67.
25. Yakovishin L.A., Borisenko N.I., Rudnev M.I., Vetrova E.V., Grishkovets V.I. Chem. Nat. Compd. 2010, 46, 49-52.
26. Bulatov M.I., Kalinkin I.P. Practical Guide of Photometric Methods of Analysis. Leningrad: Khimiya, 1986. 432 p. (in Russ.) [Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1986. 432 с.]
27. Babko A.K. Physico-Chemical Analysis of Complex Compounds in Solutions. Kiev: Izd-vo AN USSR, 1955. 328 p. (in Russ.) [Бабко А.К. Физико-химический анализ комплексных соединений в растворах (Оптический метод). Киев, 1955. 328 с.]
28. Yakovishin L.A., Grishkovets V.I., Klimenko A.V., Deg-tyar A.D., Kuchmenko O.B. Pharm. Chem. J. 2014, 48, 391394.
Received 20.11.2014 Accepted 27.12.2014
