CC BY
30
УДК 636.5.858.576.8.095.7
Ключевые слова: грипп лошадей, вирус, морфометрия
Key words: equine influenza, virus, morphometry
Батырбаева Б. А., Зайцев В. Л., Султанкулова К. Т., Червякова О. В., Сандыбаев Н. Т.
ФИЗИЧЕСКИЕ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА ВИРУСА ГРИППА ЛОШАДЕЙ, ВЫДЕЛЕННОГО В КАЗАХСТАНЕ
PHYSICAL AND MORPHOMETRIC CHARACTERISTICS OF EQUINE INFLUENZA STRAIN ALLOCATED IN KAZAKHSTAN
РГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» (НИИПББ) КН МОН РК,
п. г. т. Гвардейский (Республика Казахстан) Адрес: 080409, Казахстан, Жамбылская обл., Кордайский район, п. г. т. Гвардейский
DGE «Research Institute for Biological Safety Problems» RK ME&S SC, Gvardeiskiy (Republic of Kazakhstan) Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylsky region, Kordaysky district, Gvardeiskiy
Батырбаева Багдат Алмахановна, мл. научный сотрудник Batyrbayeva Bagdat A., Junior Research Scientist Зайцев Валентин Лукьянович, к. б. н., вед. научный сотрудник Zaitsev Valentin L., Ph.D. in Biology Science, Leading Research Scientist Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна, к. б. н., зав. лабораторией Sultankulova Kulyasan T., Ph.D. in Biology Science, Laboratory Chief Червякова Ольга Викторовна, к. б. н., ст. научный сотрудник Chervyakova Olga V., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Scientist
Сандыбаев Нурлан Тамабаевич, к. б. н., зам. ген. директора Sandybayev Nurlan T., Ph.D. in Biology Science, Deputy General Director
Аннотация. Представлены результаты электронно-микроскопического анализа, морфометрические и физические характеристики штаммов вируса гриппа лошадей подтипов ffiN8 и K7N7. Показано, что исследуемые штаммы отличаются не только по морфологии, но и по таким физическим показателям, как плавучая плотность и константа седиментации вирионов. Для всех штаммов характерен полиморфизм.
Summary. Results of electronic-microscopial analysis, morphometric and physical characteristics of equine influenza strain of subtypes H3N8 and H7N7 are presented in the work. It is showed that studied strains sharply differ by morphology and physical indices like buoyant density and sedimentation constant of virions. All above mentioned strains are polymorphic.
Введение
Важной особенностью вируса является то, что он подвержен различным мутациям и из-за этого вспышки болезни могут возникать зачастую непредсказуемо и даже инфицировать уже привитых лошадей [2]. Несмотря на интенсивность исследований иммунобиологических свойств вируса, проводимых во многих странах мира, аспекты, касающиеся физико-химических свойств вируса гриппа лошадей, пока еще изучены недостаточно. Поэтому анализ эпизоотической обстановки и обмен информацией необходим для своевременного выявления инфекции и проведения профилактических мероприятий заболевания, а также модификации существующих вакцин.
Среди лошадей циркулируют два подтипа вируса семейства Orthomyxoviridae.
Influensa A equine 1 (H7N7) - первый подтип и Influensa A equine 2 (H3N8) - второй подтип. К настоящему времени методом электронной микроскопии показано, что вири-оны ортомиксовирусов в популяции имеют округлую или полиморфную форму диаметром 60-150 нм, длина нитевидных вирусных частиц может значительно превышать диаметр сферических структур (1-4 мкм). В популяции вируса гриппа содержатся частицы, различающиеся по морфологии, плавучей плотности, скорости седиментации. В среднем относительная молекулярная масса вириона - 270х106... 290х106 Д, объем -5,2*10-16 см3, плавучая плотность в хлористом цезии - 1,25-1,90 г/см3, константа седиментации - 700-800 S. Вирионы покрыты липопротеидной оболочкой, покрытой шипиками. Наружный слой оболочки со-
держит два гликопротеида - гемагглютинин и нейраминидазу, определяющих антигенные свойства вирусов гриппа А. Гемагглютинин и нейраминидаза обусловливают важные свойства вирусов: токсигенность, иммуногенность, изменчивость [7, 11, 12].
Целью нашей работы являлось изучение морфологических и физических характеристик высокопатогенных штаммов вируса гриппа подтипа Н3№ и ^N7, выделенных от лошадей.
Материалы и методы
В работе нами были использованы штаммы вируса гриппа лошадей (ВГЛ): А/лошадь/ 0тар/764/07 (ЮШ), А/лошадь1/Киргизия/74 (Н7Ш), А/лошадь2/Майами/63 (ЮШ). Для сравнения использованы штаммы А/лошадь2/Майами/63 (ЮШ) и А/лошадь1/ Киргизия/74 (^N7), предоставленные Лабораторией коллекции микроорганизмов НИИПББ.
1. Очистка и концентрирование вируса гриппа лошадей
Для очистки и концентрирования вируса гриппа лошадей использовали методы ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе [3, 5].
2. Электронная микроскопия очищенных препаратов вируса гриппа лошадей
Для электронной микроскопии препараты готовили адсорбцией вируса в электростатическом поле тефлоновой пластины на сетке с формваровой подложкой, укрепленной углем. Препараты контрастировали 2%-м водным раствором и исследовали в электронном микроскопе ШМ-100 СХ JEOL.
3. Определение морфометрических характеристик вируса гриппа лошадей
Для морфометрического исследования вирионов вируса гриппа лошадей применяли фотонегативы с отснятым при увеличении 20 тысяч вируссодержащим препаратом.
Обсчет размеров вирионов проводили с помощью специальной шкалы с делением, равным 0,1 мм, затем рассчитывали среднюю арифметическую величину и среднее квадратичное отклонение [1]. На основе полученных данных строили гистограммы рас-
пределения вирионов по размерам в популяции штаммов.
4. Определение основных физических характеристик вируса гриппа лошадей
Определение плавучей плотности вируса гриппа лошадей
Плавучую плотность вируса определяли путем центрифугирования очищенной вирусной суспензии в преформированном градиенте соли - хлористого цезия (CsCl) с концентрацией 30 мас. %, в роторе SW-50 ультрацентрифуги Optima L - 90K («Becman») [3, 6, 19]. Центрифугирование проводили при 146800 g в течение 16 ч. Определяли коэффициент преломления (n) на рефрактометре, плотность вычисляли по эмпирической формуле р25 = 10,860 * n25 - 13,497 (при 25 °С).
Активность вируса гриппа во фракциях определяли методом титрования в РГА.
Определение константы седиментации вируса гриппа лошадей
Константу седиментации определяли по методу Мартина-Эймса [15] исходя из соотношений пропорциональности констант седиментации и расстояний пика маркерного вируса и исследуемого вируса гриппа лошадей:
где Rj- расстояние, пройденное частицей с известным коэффициентом седиментации; R2 - расстояние, пройденное исследуемой частицей;
S25 w1 - известный коэффициент седиментации (при температуре 25 °С); S25 W2 - коэффициент седиментации исследуемого вируса (при температуре 25 °С).
Результаты и обсуждение
Штамм А/лошадь2/Майами/63 разновидность Influenza A equine 2 (H3N8) был выделен в 1963 г. G. H. Waddel с соавторами в Майами (США, штат Флорида) от беговых лошадей [9]. Согласно литературным данным, популяция ВГЛ штамма А/лошадь2/ Майами/63 представлена вирионами сферической формы диаметром 100-120 нм
Рис. 1. Электронная микроскопия очищенных препаратов штаммов вируса гриппа лошадей. Ув.*50000. а) штамм А/лошадь2/Майами/63 (Н3Ш), б) штамм А/лошадь/Отар/764/07 (H3N8), в) штамм А/лошадь1/Киргизия/74 (H7N7).
с плавучей плотностью в растворе хлористого цезия 1,21 г/см3 - 1,58 г/см3 и константой седиментации 612-832 S [14, 16, 17]. Вирусные частицы гриппа лошадей А/лошадь/ Киргизия/74 имеют сходные морфологические характеристики. Диаметр вирионов варьирует в пределах 80-120 нм [10].
Распространение гриппа лошадей в значительной степени определяется двумя факторами: состоянием иммунитета у животных к возбудителю и изменчивостью вируса.
В литературных источниках в основном имеются результаты исследований установления диагноза при заболевании лошадей с признаками острых респираторных инфекций. Например, с 1989 по 1993 г. причиной вспышек гриппа среди лошадей в Китае, а также в Казахстане являлся вирус гриппа А серотипа Н3Ш [4, 8, 13]. Таким образом, наряду с выделением местных изолятов вируса гриппа лошадей, весьма актуальным является вопрос их всестороннего изучения.
При исследовании морфологии вирионов штаммов ВГЛ: А/лошадь2/Майами/63 (Н3Ш), А/лошадь/Отар/764/07 (Н3Ш), А/лошадь1/Киргизия/74 (Н7К7) установлено, что все они содержат вирусные частицы
округлой и удлиненной формы размером от 70 до 200 нм и более. Около 67 % популяции штаммов ВГЛ составляют вирионы диаметром 100-170 нм. Поверхность вирусных частиц покрыта шипиками высотой 6-8 нм. Толщина наружной оболочки вирионов штаммов ВГЛ 8,5-9 нм (рис. 1).
Исследования показали, что размеры ви-рионов штаммов А/лошадь/Отар/764/07 (Н3Ш) и А/лошадь2/Майами/63 (Н3Ш) ВГЛ практически одинаковы (121 и 124 нм). Штамм А/лошадь1/Киргизия/74 (Н7К7) по размерам (130 нм) близок к двум предыдущим штаммам. Результаты статистической обработки размеров вирионов штаммов А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш), А/лошадь1/ Киргизия/74 (Н7Ш) и А/лошадь2/Майа-ми/63 (Н3К8) ВГЛ представлены в таблице 1.
На основе полученных данных построена гистограмма распределения вирионов по размерам в популяции вирионов штаммов. Гистограмма распределения вирионов штаммов вируса гриппа лошадей представлена на рисунке 2.
При определении в популяциях штаммов однородных групп вирусных частиц у штаммов А/лошадь/0тар/764/07 (Н3К8),
Таблица 1.
Результаты статистической обработки размеров вирионов штаммов вируса гриппа лошадей
Вирус гриппа лошадей Количество анализированных вирионов Средняя арифметическая величина, нм Среднее квадратичное отклонение, нм
штамм А/лошадь/0тар/764/07 (Н3Ш) 339 121 2,01
штамм А/лошадь1/Киргизия/74 (Н7Ш) 326 130 1,41
штамм А/лошадь2/Майами/63 (Н3Ш) 309 124 1,20
А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7К7), А/лошадь2/ Майами/63 (H3N8) вируса гриппа лошадей преобладают в основном вирионы округлой (46-49 %) и овальной (35-50 %) формы. В пределах 3-16 % в популяции штаммов А/лошадь/Отар/764/07 (H3N8) и А/лошадь1/ Киргизия/74 (H7N7) присутствуют вирионы нитевидной формы, длина которых достигает 750 нм и более. В популяции штамма А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7К7) выявлены вирионы различной морфологии.
Рис. 2. Распределение размеров вирионов вируса гриппа лошадей штаммов А/лошадь/0тар/764/07 (Ы3Ш), А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7Ш), А/лошадь2/ Майами/63 (Ы3Ш).
Рис. 3. Распределение по плотности штаммов вируса гриппа в 30 мас. % растворе хлорида цезия при изопикническом центрифугировании. а) А/лошадь2/ Майами/63 (Ы3Ш), б) А/лошадь/0тар/764/07 (Ы3Ш), в) А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7Ш).
Определение плавучей плотности вируса гриппа лошадей имеет большую практическую ценность для постоянного контроля чистоты вирусных препаратов; плотностной анализ используется для изучения природной плотностной гетерогенности мутантов.
Изучение плотностных характеристик чистых препаратов вируса гриппа лошадей проводили с использованием равновесного (изопикнического) центрифугирования в преформированных градиентах хлористого цезия по общепринятым методикам [3, 6]. Результаты экспериментов представлены на рисунке 3 и 4.
Значение плавучей плотности в пиках проявления вирусной активности определяли из градуировочных графиков зависимости показателя преломления от плотности раствора соли цезия хлорида.
В процессе центрифугирования вируса гриппа лошадей в градиенте хлористого цезия выявлена плотностная гетерогенность вирусных частиц в очищенном препарате. Из рисунка видно, что точка пересечения кривой градиента плотности с максимумом проявления вирусной активности соответствовала величине для штамма А/лошадь2/ Майами/63 (Ы3Ш) - 1,258 г/см3, для штамма А/лошадь/0тар/764/07 (Ы3Ш) - 1,260 г/см3 и для штамма А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7Ш) - 1,250 г/см3.
Проведенные эксперименты в градиенте плотности хлористого цезия показали, что вирионы гриппа лошадей имеют плавучую плотность в пределах 1,25-1,26 г/см3. Полученная нами величина плавучей плотности гриппа лошадей лежит в пределах, свойственных для других представителей орто-миксовирусов, и соответствует параметрам,
Рис. 4. Графическое определение плавучей плотности вирусных частиц штаммов ВГЛ.
Таблица 2.
Физические константы очищенных препаратов вируса гриппа лошадей
ВГЛ Физические константы
Плавучая плотность р, г/см3 Константа седиментации S
штамма А/лошадь2/Майами/63 (Ы3Ш) (контроль) 1,258 714,0±9,8
штамм А/лошадь/Отар/764/07 (Ы3Ш) 1,260 778,0±11,8
штамм А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7Ш) 1,250 737,0±2,4
полученным ранее для штаммов А/лошадь2/ Майами/63 (Ы3Ш) и А/лошадь1/Кирги-зия/74 (ЫЖ7) [3, 6, 9,10, 16].
0дной из важных физических характеристик вирусов является коэффициент седиментации, который зависит от формы частицы в данном растворе и его молекулярного веса. Константу седиментации определяли по методу Мартина-Эймса [15].
Значения плавучей плотности и константы седиментации штаммов вируса гриппа лошадей представлены в таблице 2.
Как представлено в таблице 2, среднее значение константы седиментации, рассчитанное нами для вируса гриппа лошадей, составляло от 700 до 780 единиц Сведберга. Эта величина сходна со значениями констант седиментации других членов группы орто-миксовирусов [18].
Проведенные исследования показали, что исследуемые штаммы незначительно отличаются по морфологии и физическим показателям - плавучей плотности и константе седиментации вириона и лежат в области значений, характерных для ортомик-совирусов [3, 6, 18]. Полученные данные по физико-химическим свойствам вирио-нов могут быть использованы для контроля чистоты вирусных препаратов, а также для изучения природной гетерогенности мутантов.
Заключение
Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы.
1. Штаммы А/лошадь/0тар/764/07 (Ы3Ш) и А/лошадь1/Киргизия/74 (Ы7К7) ВГЛ имеют следующие морфометрические характеристики:
- вирионы в популяциях исследованных штаммов имеют сферическую, эллипсоидную и нитевидную формы;
- размер округлых вирионов составляет 80-200 нм, длина некоторых нитевидных форм вирусных частиц достигает 750 нм и более;
- поверхность вирусных частиц покрыта шипиками высотой 6-8 нм.
2. Исследуемые штаммы вируса имеют незначительные отличия по морфометри-ческим и физическим характеристикам. Полученные физические константы рекомендуется использовать при контроле чистоты вирусных препаратов.
Список литературы
1. Ашмарин, И. П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И. П. Ашмарин, А. А. Воробъев. - М, 1959.
2. Грипп лошадей ^ррш eguarum) http://www. webmvc.com/bolez/livestok/infect/horse/grippus.php.
3. Гринин, А. С. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных / А. С. Гринин, И. Н. Титов. - М., 1971. - 240 с.
4. Жуматов, К. Х. Изучение штаммов вируса гриппа А, выделенных от диких птиц в Центральном Казахстане в 2006 году / К. Х. Жуматов, А. И. Кыдырма-нов, К. О. Карамендин и др. // Межд. науч. практ. конф. «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», 19-21 мая 2008 г. : [посвящ. 50-летию НИИПББ НЦБ МОН РК : материалы]. - Республика Казахстан, Алматы, 2008. -С. 113-115.
5. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман. - М. : Наука, 1985. - 536 с.
6. Остерман, Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Остерман // Электрофорез и ультрацентрифугирование : практич. Пособие. -М. : Наука, 1981. - 228 с.
7. Пейлиза, П. Генетика вирусов гриппа / П. Пей-лиза, Д. У Кингсбери. - М. : Медицина, 1986.
8. Розанова, Р. А. Эпизоотия гриппа лошадей в Казахстане в 1992 году / Р. А. Розанова, Р. У Бейсен-баева, Л. М. Фурсова, Т. И. Хлебова, З. К. Чувакова // Науч. конф. «Актуальные проблемы вирусологии (молекулярная биология, иммунология, диагностика, биотехнология, эпизоотология и эпидемиология)», 18-20 мая 1994 г. [Тезисы докл.]. - Республика Казахстан, п. Гвардейский, 1994. - 120 с.
9. Саятов, М. Х. Биология вирусов гриппа человека и животных / М. Х. Саятов и др. - Алма-Ата : Гы-лым, 1991. - С. 58-66.
10. Юров, К. П. Грипп лошадей. Инфекционные и инвазионные болезни лошадей / К. П. Юров. - М. : Колос, 1976. - С. 81-90.
11. Cooper, L. A. Simple Restriction Fragment Length Polymorphism-Based Strategy That Can Distinguish the Internal Genes of Human H1N1, H3N2, and H5N1 Influenza A Viruses / L. A. Cooper, К. A. Subbarao // Journal of Clinical Microbiology. - 2000, July. -Vol. 38. -No. 7. - Р. 2579-2583.
12. Guo, X. Sequence of HA gene of avian influenza / X. Guo, M. Liao, C. Xin - 1992.
13. Guo, Y. Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China / Y. Guo, M. Wang,
Y. Kawaoka, O. Gorman, T. Ito, T. Saito, R. Webster // Virology. - 1992, May. - Vol. 188 (1).
14. Lauffer, A. The sedimentation rate of the biological activities of influenza A virus / A. Lauffer, L. Miller // J. Exp. Med. - 1944. - P. 521-529.
15. Martin, R. G. A method for deterining the sedimentation behavior of enzymes: Aplication to protein mixture / R. G. Martin, B. N. Ames // J. Biol. Chem. -1961. - P. 1372-1376.
16. Nayak, D. P. Characterization of Influenza Virus Ribonucleic Acid Duplex Produced by Annealing In Vitro / D. P. Nayak, M. A. Baluda // Journal of Virology. -Vol. 3. - No. 3. - 1969, Mar. - P. 318-325.
17. Nayak, D. P. Isolation and Partial Characterization of Nucleic Acid of Influenza Virus / D. P. Nayak, M. A. Baluda // Journal of Virology. - Vol. 1. - No. 6. -1967, Mar. - P. 1217-1223.
18. Pye, J. Sedimentation behavior and electron microscopic examination of purifed influenza virus / J. Pye, H. F. Holden, H. B. Donald // J.gen.Microbiol. -V. 14. - 1956. - P. 634-636.
19. Thorne, H. V. Electrophoretic characterization and fractionation of Polyoma virus DNA / H. V Thorne // J. Mol.Biol. - V. 24. - 1967. - P. 203-211.
CO S CO
Si
Ф CL
Издательский дом «Логос Пресс» представляет вашему вниманию первое переводное оригинальное научно-практическое издание для ветеринарных врачей, освещающее проблемы лечения и профилактики заболеваний мелких домашних животных - журнал «JSAP /Российское издание».
Данный проект - Российская версия журнала «Journal of Small Animal Practice» - официального печатного органа Британской ассоциации ветеринарии мелких домашних животных (BSAVA), осуществляющей свою деятельность с 1957 года.
На страницах издания публикуются обзорные статьи, результаты исследований и описания клинических случаев, авторами которых являются специалисты ведущих мировых центров ветеринарной науки и практики. В рубрике «Российская ветеринарная практика» представлены материалы о новых лекарственных средствах и принципах фармакотерапии мелких домашних животных.
Журнал представляет теоретическую и практическую ценность для ветеринарных врачей различных специальностей, студентов и преподавателей профильных ВуЗов.
Номера журнала представлены в Российской книжной палате, центральных библиотеках РФ, научной электронной библиотеке (НЭБ) и на сайте издательства www.jsap.ru.
Наши координаты:
E-mail: [email protected], тел.: + 7 (495) 220-48-16, факс: + 7 (499) 978-57-43
JSAP
JOURNAL OF SMALL ANIMAL PRACTICE
РОССИЙСКОЕ ИЗДАНИЕ
