CC BY
55
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2017 БИОЛОГИЯ Вып. 1
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.695
М. Ю. Коротаевa, Е. В. Вихареваa, В. Д. Белоноговаa, И. Б. Ившинаbc
a Пермская государственная фармацевтическая академия, Пермь, Россия b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия c Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия
ФИТОРЕГУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОДУКТОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ПАРАЦЕТАМОЛА
Показано, что продукты биодеструкции парацетамола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 имеют гуминоподобную природу. В составе их молекул присутствуют "симметричные" и "асимметричные" участки, включающие аминофенольные, феноксазиновые, индольные и бензофурановые фрагменты. В основе химической структуры данных фрагментов лежат замещенные ароматические или хиноидные циклы с пара- ("симметричным") и мета- ("асимметричным") положениями эквивалентных заместителей - фенольных гидроксильных или азотсодержащих функциональных групп. Выявлено фиторегулирующее действие продуктов бактериальной деструкции парацетамола на прорастание семян пшеницы мягкой Triticum aestivum L., обусловленное влиянием "симметричных" и "асимметричных" молекулярных участков на функциональную активность пероксидазы. Экспериментально обосновано, что эффект фитостимуляции зависит от стадии роста растения и концентрации веществ, содержащихся в водном извлечении из продуктов бактериальной деструкции парацетамола.
Ключевые слова: парацетамол; биодеструкция; Rhodococcus ruber; Triticum aestivum L.; пероксидазная активность.
M. Yu. Korotaeva, E. V. Vikharevaa, V. D. Belonogovaa, I. B. Ivshinab,c
a Perm State Pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation
b Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation c Perm State University, Perm, Russian Federation
PHYTOREGULATING ACTION OF BACTERIAL PARACETAMOL DEGRADATION PRODUCTS
Products of bacterial paracetamol degradation by Rhodococcus ruber IEGM 77 cells were shown to be humic-like substances. According to our data, the molecules of the products of bacterial paracetamol degradation comprise "symmetric" and "asymmetric" sites, including aminophenol, phenoxazine, indole and benzofuran fragments. The chemical structures of these fragments are based on aromatic and quinoid rings with equivalent substituents, i.e. phenol hydroxyl and nitrogen-containing functional groups, in para- ("symmetric") and meta- ("asymmetric") positions. The products of bacterial paracetamol degradation were found to produce a phytoregulating action on seed germination of soft wheat Triticum aestivum L. due to the influence of "symmetric" and "asymmetric" molecular sites on the functional peroxidase activity. It was experimentally proved that the phytostimulating effect depends on the plant growth phase and concentrations of substances contained in water extracts from products of bacterial paracetamol degradation.
Key words: paracetamol; biodegradation; Rhodococcus ruber; Triticum aestivum L.; peroxidase activity.
Введение
Важной фармакохимической проблемой является поиск эффективных способов переработки лекарственных средств, не пригодных к медицинскому использованию, для получения на их основе новых биологически активных соединений, в том числе фито-стимулирующего действия. Одним из широко ис-
пользуемых в медицинской практике лекарственных препаратов является парацетамол (CAS: 103-90-2; N-(4-гидроксифенил)ацетамид).
В качестве деструкторов парацетамола и продукта его гидролиза и-аминофенола применяют различные микроорганизмы, в том числе актино-бактерии рода Rhodococcus, выделенные из почвенных и водных экосистем [Warhurst, Fewson,
© Коротаев М. Ю., Вихарева Е. В., Белоногова В. Д., Ившина И. Б., 2017
60
1994; Takenaka et al., 2003;Ившина и др., 2006; de Gusseme et al., 2011; Wu, Zhang, Chen, 2012; Zhang et al., 2013; Arora, 2015]. Согласно данным B. de Gusseme et al. [2011], бактериальная деструкция парацетамола может сопровождаться поликонденсацией фенольных интермедиатов. При этом окислительные поликонденсационные процессы, протекающие с участием ферментов почвенных бактерий, лежат в основе образования гумусовых кислот (гуминовой и фульвовой) и гуми-ноподобных соединений [Stevenson, 1994; Орлов, 1997]. Особый интерес при рассмотрении вопросов, связанных с возможностью превращения фенолов в гуминоподобные соединения, представляет биоконверсия аминофенолов, которые, как и гуми-новые кислоты, являются азотсодержащими соединениями [Орлов, 1990].
Гуминовые кислоты представляют собой смесь высокомолекулярных органических азотсодержащих соединений с бензольным ядром и алифатической углеводородной цепочкой, содержащих в качестве заместителей различные функциональные группы (рис. 1). Наибольшее значение среди последних имеют фенольный гидроксил и карбоксил, присутствие которых обусловливает растворимость гуминовых кислот в щелочах, а также хиноидная группа, определяющая их темную окраску. Фе-нольные и хиноидные группы определяют способность гуминовых кислот к окислительно-восстановительным реакциям.
негидролизуемая часть гидролизуемая часть
Рис. 1. Строение структурных ячеек (а, б) и молекулы (в) гуминовой кислоты. Цит. по: а) Д.С. Орлову [1990]; б) F.J. Stevenson [1994]; в) С.С. Драгунову [Орлов, 1990]
В ранее проведенных нами исследованиях установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus способны к биодеструкции парацетамола с образованием водорастворимых веществ, окрашивающих культуральную среду в коричневый цвет, и черного аморфного осадка (АО) полимерной природы [Ившина и др., 2006; Коротаев и др., 2015]. Сравнение элементных составов АО и поли-м-аминофенола показало их сходство. Высокая молекулярная масса (- 6 кДа), растворимость в щелочах и осаждение кислотонерастворимой фракции при подкислении щелочного раствора АО, а также наличие фитостимулирующего действия обусловливают сходство АО с гуминоподобными веществами [Орлов, 1990; Гладков и др., 2006]. Наличие бензофурановых и индольных фрагментов в составе «симметричных» ('^уш") и «асимметричных» ("Ауш") участков молекул АО (рис. 2) подтверждает меланизацию полиаминофенолов, первоначально образующихся при биотрансформации парацетамола родококками [Коротаев, Вихарева, Ившина, 2016; Коротаев и др., 2016]. При этом под «симметричными» следует понимать участки молекул, включающие ароматические и хиноид-ные кольца с одинаковыми заместителями в пара-положении, под «асимметричными» - молекулы с одинаковыми заместителями в мета- положении [Коротаев, Вихарева, Ившина, 2016].
"Бут" "Аэут"
а б в г
Рис. 2. Структурные фрагменты молекул АО, представленные остатками:
а - 2,5-диамино-1,4-фенилендиола; б - 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинондиимина; в - 4,6-диамино-1,3-фенилендиола; г - 2-амино-5-гидрокси-1,4-бензохинонимина
Как видно на рис. 2, в составе молекул АО могут присутствовать как аминофенольные, так и ин-дольные фрагменты. В молекулах гуминовых кислот также имеются данные структурные фрагменты (рис. 1), что предопределяет их фитостимули-рующую активность.
Известно, что фитостимулирующее действие гумусовых кислот и родственных им соединений обусловлено несколькими факторами, в том числе участием фульвовой кислоты как водорастворимой и наиболее подвижной фракции гумусовых кислот в переносе микроэлементов питания из почвы в корни растений [Ыш^ et а1., 2002]. При этом фуль-вовая кислота за счет фенольных гидроксильных,
карбонильных и карбоксильных групп (рис. 3) способна образовывать хелатные комплексы с ионами различных металлов.
а
Рис. 3. Химическая формула фульвовой кислоты.
Цит. по J.A.E. Buffle [1977]
Именно в форме фульватов большинство микроэлементов являются биодоступными для корневой системы растений. Кроме того, гумусовые кислоты оказывают влияние на ферментные системы подземных органов растительного организма вследствие фенольно-хиноидной составляющей их химической структуры. Не случайно содержание пероксидазы в корнях значительно больше, чем в надземной части растения [Рогожин, 2004]. В связи с этим исследование фитостимулирующего действия необходимо проводить параллельно с изучением активности ферментов растений, в частности, пероксидазы [Рогожин, 2004].
Пероксидаза - растительный гемсодержащий фермент класса оксидоредуктаз, обладающий двумя «опциями»: собственно пероксидазной, обусловленной способностью фермента переносить кислород пероксида водорода на окисляемый субстрат (аскорбиновую кислоту, в частности), и ок-сидазной, связанной с переходом кислорода из молекулярной формы на 3-индолилуксусную кислоту (ИУК), что сопровождается продукцией перекис-ных соединений [Газарян и др., 2006]. Последние способны диспропорционировать с образованием атомарного кислорода и его радикальных форм [Kawano, 2003]. Частицы радикалов необходимы при выходе семян из покоя и активизации их прорастания за счет потребления энергии, полученной в результате перекисного (радикального) окисления липидов. Регуляторами пероксидазной и окси-дазной функций пероксидазы могут выступать фе-нольные соединения, которые являются его быстро окисляемыми субстратами и, соответственно, ускоряют или замедляют (в зависимости от концентрации) окисление медленно окисляемых субстратов, аскорбиновой кислоты, в частности [Рогожин, 2004]. Так, установлено регуляторное действие гидрохинона на пероксидазную активность данного фермента и о-дианизидина - на его оксидазную функцию. Отмечено, что обе представленные "опции" пероксидазы находятся в антагонистическом отношении и не могут включаться одновременно, а лишь последовательно [Рогожин, 2004; Давидянц, 2013].
Цель настоящей работы - установление зависимости между химическим составом водного извлечения из осадка, образующегося в процессе
чения из осадка, образующегося в процессе биодеструкции парацетамола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77, и его росторегулирующим действием на процесс прорастания семян пшеницы мягкой Triticum aestivum L., широко используемой в качестве тест-культуры при фитохимических исследованиях.
Материалы и методы исследований
Для биодеструкции парацетамола (Аньцю Лу-ань Фармасьютикал Ко., Лтд., Китай) использовали штамм R. ruber ИЭГМ 77 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур WDCM 768, www.iegmcol.ru) [Catalogue of Strains, 2016]. Выделение осадка из постферментационной среды культивирования родококков осуществляли в соответствии с условиями, описанными в работе [Ившина и др., 2006].
Изучение спектральных характеристик продуктов биодеструкции парацетамола
Электронные спектры АО и продуктов его фракционирования регистрировали на спектрофотометре Lambda EZ 201 (Perkon Elmer, USA) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см в диапазоне длин волн от 190 до 1000 нм. Анализируемый раствор готовили из 0.1%-ного раствора АО в 0.1 М растворе NaOH путём стократного разведения его аликвотной части дистиллированной водой или 0.1 М раствором NaOH. Растворами сравнения являлись 0.001 М раствор NaOH и 0.1 М раствор NaOH.
Фракционирование АО осуществляли методами дробного осаждения и растворения. В химическом стакане вместимостью 100 см3 смешивали 1.00 см3 0.1%-ного раствора АО с 1.00 см3 0.1 М раствора HCl. Полученную взвесь разбавляли дистиллированной водой и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100.00 см3, доводя объем растворителем до метки. Собранный в мерную колбу фильтрат представлял собой водорастворимую фракцию АО в Б+-форме (ВФ-И+). Для получения спирто-водорастворимой фракции АО в Б+-форме (СВФ-И+) вышеуказанную взвесь обрабатывали последовательно 50.00 см3 дистиллированной воды и 96%-ного этилового спирта и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100.00 см3, доводя объем фильтратом до метки.
Для изучения влияния pH на изменение спектральных характеристик фракций АО готовили растворы последних в 0.1 M NaOH. Предварительно в мерную колбу вместимостью 100.00 см3 вносили 50.00 см3 0.2 М раствора NaOH. Далее взвесь, полученную по вышеприведенной методике, разбавляли дистиллированной водой и фильт-
ровали через бумажный фильтр в мерную колбу, доводя объем фильтратом до метки. Полученный раствор представлял собой водорастворимую фракцию АО в №+-форме (ВФ-№+). Для получения спирторастворимой фракции АО в №+-форме (СФ-№+) в мерную колбу вместимостью 100.00 см3 вносили 50.00 см3 0.2 М раствора №ОН. Данную взвесь обрабатывали в химическом стакане 96%-ным этиловым спиртом и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу, доводя ее объем фильтратом до метки.
Растворы для заполнения кювет сравнения при регистрации спектров ВФ-Н+, СВФ-Н+, ВФ-№+ и СФ-№+ готовили аналогично исследуемым, но с использованием вместо 2.00 см3 взвеси, полученной по вышеприведенной методике, 2.00 см3 0.05 М раствора №С1.
Получение водорастворимых продуктов
биодеструкции парацетамола
Извлечение водорастворимых продуктов (ВП) из АО (0.2500 г) проводили экстракцией дистиллированной водой (100.00 см3) при нагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 3 ч. [Коротаев и др., 2015]. Водное извлечение охлаждали и фильтровали через обеззоленный бумажный фильтр "синяя лента" (Химреактивком-плект, Россия). В фильтрате гравиметрическим методом устанавливали концентрацию ВП, которую рассчитывали по массе остатка, полученного после испарения воды из 10.00 см3 фильтрата. Серию растворов ВП готовили посредством разбавления фильтрата дистиллированной водой. Соотношение объемов фильтрата и полученного разведения находилось в пределах от 1:6.2 до 1:1.2.
Проращивание семян и анализ проростков
пшеницы
Предварительно взвешенные семена пшеницы мягкой ТгШсыт ае&'^ит Ь. помещали по 30 штук во флаконы из темного стекла вместимостью 25 см3, заливали растворами ВП (2.50 см3) и выдерживали в темноте в течение 1 сут. при комнатной температуре. Объем вносимого во флаконы раствора подбирался таким образом, чтобы он покрывал слой семян [Христин, Ковальченко, Алкацева, 2008]. Флаконы на период замачивания семян прикрывали крышкой во избежание значительного испарения растворителя. В контрольном опыте вместо растворов ВП использовали дистиллированную воду.
Через 1 сут. от начала замачивания семена извлекали из флаконов, промывали дистиллированной водой (1 дм3 на 30 семян), подсушивали и переносили по 30 шт. в чашки Петри. Проращивание семян осуществляли между 3 нижними слоями и 1 верхним слоем смоченной фильтровальной бумаги. Первоначальный объем дистиллированной воды, введенный в каждую чашку Петри, составлял
4.00 см3. По мере высыхания слоев фильтровальной бумаги вносили дополнительное количество дистиллированной воды. Общий объем внесенной в одну чашку Петри дистиллированной воды на 6 сут. составлял 6.50 см3. Отбор проростков для определения их морфометрических показателей и пероксидазной активности осуществляли на 1-, 2-, 4-, 6-е сут., а также на 1-, 3-, 6-е сут., соответственно, с момента помещения семян в чашки Петри. Для каждого проростка определяли суммарную длину всех корней и длину ростка. С целью определения сухой биомассы 3- и 6-суточных проростков пшеницы закладывали дополнительно 14 чашек Петри.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием F-критерия Фишера и ^ критерия Стьюдента при уровне значимости а=0.05. Различия между выборками считали статистическими значимыми при 4ксп > 4р. При статистической обработке морфометрических показателей проростков пшеницы предварительно проводили отсев грубых погрешностей наблюдений (критерий Рошера) и проверку выборок на нормальность (метод моментов) [Бондарчук, 2010].
Пероксидазную активность корней проростков определяли модифицированным методом Боярки-на [Воскресенская и др., 2006]. Выбор корней проростков в качестве объекта анализа связан с большим, в сравнении с ростками, содержанием в них пероксидазы [Рогожин, 2004; Рогожин, Рогожина, 2011; Давидянц, 2013]. Для проростков, отобранных на 1-е сут. эксперимента, для анализа использовали всю сырую биомассу ростков и корней, так как прирост за данный интервал времени был незначительным. Для получения ферментной вытяжки навеску корней проростков пшеницы 0.05-0.10 г гомогенизировали в ступке с дистиллированной водой и переносили в мерную колбу вместимостью 25.00 см3. После доведения объема водой до метки растительную вытяжку настаивали в течение 10 мин., фильтровали через бумажный фильтр и использовали для определения пероксидазной активности. В одну из кювет с толщиной слоя 1.00 см помещали 1.00 см3 раствора бензидина, 1.00 см3 фильтрата и 1.00 см3 дистиллированной воды (раствор сравнения), в другую - 1.00 см3 раствора бензидина, 1.00 см3 фильтрата и 1.00 см3 0.3%-ного раствора пероксида водорода (анализируемый раствор). С момента падения последней капли 0.3%-ного раствора пероксида водорода включали секундомер и регистрировали оптическую плотность анализируемого раствора на концентрационном фотоэлектрическом фотометре КФК-3-01 (ЗОМЗ, Россия) при длине волны 670 нм. Пероксидазную активность выражали в единицах оптической плотности на грамм сырой массы в секунду (отн. ед.хг-1хсм-1). Раствор бензидина готовили в среде ацетатного буфера согласно методике, представленной в работе [Воскресенская и др., 2006].
Результаты исследования и их обсуждение
Сравнение электронных спектров АО и его фракций, представленных на рис. 4, подтверждает наличие в молекулах АО системы сопряжения двойных связей, карбонильной и азометиновой функциональных групп. Электронные спектры фракций АО свидетельствуют о гипсохромных и батохромных сдвигах в кислой среде максимумов поглощения при Х=248 нм и Х=329 нм, соответственно (рис. 4).
ца ^ора^ату, 2014].
В эксперименте на проростках пшеницы при прорастании семян выявлена обратная зависимость между длиной ростков (1 сут.) и сухой биомассой корней (3 сут.) от их пероксидазной активности (рис. 5, рис. 6). На этапе восхождения семян (6 сут.), напротив, отмечается прямо пропорциональная зависимость между сухой биомассой корней проростков пшеницы и пероксидазной активностью (рис. 7).
190 290 390 490 590 690 Длина волны, нм
Рис. 4. Электронные спектры поглощения АО и его фракций:
а) I - 0.001 %-ный раствор АО в 0.001 М NaOH, II -СВФ-Н+, Ш - ВФ-Н+; б) I - 0.001%-ный раствор АО в 0.1 М растворе NaOH, II - СФ-№+, Ш - ВФ-№+
Рис. 5. Зависимость средней длины корней (1*), средней длины ростков (3*) и пероксидазной активности (2) от концентрации ВП для проростков пшеницы (1 сут.)
" 5
га
g =
1,60
1,20
0,80
0,40
0,00
* ..-А.
}, 2 /
♦oí "А \ А
А -
0,12
0,09
0,06
0,03
0,00
0,0
0,2
0,4
0,6
Концентрация ВП, i/n,m3
Так, поглощение в области длин волн 230-260 нм обусловлено переходом п-п* в трансоидной форме еноновой системы (рис. 4 а, II, III), а образование енолят-иона в щелочном растворе сдвигает данную полосу поглощения в сторону длинных волн (рис. 4 б, II, III) [Сильверстейн, Басслер, Моррил, 1977]. Батохромный сдвиг максимума при X=329 нм (рис. 4 б, II, III) соответствует п-п* переходу находящейся в сопряжении азометиновой группы. При подкислении на атоме азота данной группы создается положительный заряд, обусловливающий смещение максимума в сторону длинных волн (рис. 4 а, II, III) [Сильверстейн, Басслер, Моррил, 1977]. Исчезновение полосы поглощения при X = 490 нм при подкислении (рис. 4 а, II, III) связано с протонированием несвязывающей электронной пары гетероатома азота, участвующей в n-п* переходе между HOMO орбиталью ароматического цикла и LUMO орбиталью хиноидного коль-
Рис. 6. Зависимость сухой биомассы корней (1*) и пероксидазной активности (2) от концентрации ВП для проростков пшеницы (3 сут.)
Рис. 7. Зависимость сухой биомассы корней (1*) и пероксидазной активности (2) от концентрации ВП для проростков пшеницы (6 сут.)
а
б
Зависимость между длиной корней и перокси-дазной активностью в 1-суточных проростках имеет некоторое расхождение с выявленной тенденцией, что объясняется использованием в качестве объекта анализа всей сырой биомассы ростков и корней, где граммовое содержание первых, по всей видимости, в значительной степени превышает в навеске содержание последних (рис. 5).
Средние значения длины побегов (ростков) и корней проростков пшеницы, а также сухой биомассы корней 6-суточных проростков пшеницы, представлены в таблице.
Динамика изменения морфометрических показателей (сухой биомассы) проростков пшеницы
Концентра-
ция ВП, 1 сут. 2 сут.
г/дм3
Длина ростков, см
Контроль 0.09±0.03 0.24±0.05
0.0913 0.08±0.02 0.2±0.06
0.1826 0.08±0.02 0.31±0.09
0.2739 0.09±0.02 0.27±0.09
0.3652 0.04±0.02 0.18±0.06
0.4565 0.12±0.03 0.23±0.05
0.5500 0.12±0.03 0.21±0.06
Длина корней, см
Контроль 0.18±0.07 0.9±0.2
0.0913 0.10±0.04 1.2±0.3
0.1826 0.22±0.06 2.3±0.4
0.2739 0.22±0.12 1.5±0.2
0.3652 0.13±0.07 1.3±0.3
0.4565 0.24±0.09 0.8±0.2
0.5500 0.34±0.09 1.2±0.3
4 сут. 6 сут.
Длина ростков, см
Контроль 2.1±0.3 4.9±0.4
0.0913 2.4±0.4 5.6±0.5*
0.1826 1.8±0.4 5.1±0.7
0.2739 2.5±0.3 6.0±0.6
0.3652 1.4±0.3 4.8±0.7
0.4565 1.7±0.3 5.0±0.6
0.5500 2.1±0.3 5.2±0.5
Длина корней, см Сухая биомасса корней, г
Контроль 14.2±1.5 0.1644
0.0913 15.3±1.8 0.1274
0.1826 13.3±1.9 0.1499
0.2739 15.3±1.5 0.1399
0.3652 11. 8± 1. 5 0.1096
0.4565 13.7±1.4 0.1492
0.5500 12.4±1.1 0.1444
* Статистическое отличие от контрольной выборки
(£эксп > ^кр)-
Как следует из данных, представленных в таблице и на рис. 4-6, динамика изменения морфометрических показателей и сухой биомассы корней и побегов проростков пшеницы, связанная с активностью содержащейся в них пероксидазы, имеет «маятниковый» характер [Рогожин, 2004].
Спектральными характеристиками гуминовых кислот и родственных им веществ являются E-величина (E4650001%) и коэффициент цветности (E465 / E650) [Орлов, 1990]. Наличие максимума поглощения вблизи X = 490 нм для АО и его фракций в щелочной среде затрудняет определение данных характеристик. Батохромный сдвиг максимума поглощения азометиновой группы влияет на значения E-величины и, соответственно, цветного показателя СВФ и ВФ. Тем не менее, большее значение E465 / E650 для СВФ-H (9.74) в сравнении с ВФ-H (16.63) является характерной особенностью гуми-новых веществ. Так, возрастание цветного показателя наблюдается при выделении фракций гумусовых кислот, имеющих большую растворимость в воде и меньшую среднюю молекулярную массу. Среднее значение E465 / E650 для фракций гумусовых кислот со средней молекулярной массой от 5 до 10 кДа равно 6.0 и менее 5 кДа - 9.0. Следовательно, ожидаемое значение цветного показателя АО будет меньше 9.74 и может быть сопоставимо со значением его средней молекулярной массы, приблизительно равной 6 кДа [Орлов, 1990]. Таким образом, водорастворимые вещества, присутствующие в ВФ-Н+ после фракционирования путем изменения pH и содержащиеся в растворе ВП после термической обработки АО на водяной бане, могут быть представлены низкомолекулярными фрагментами АО, при этом также включающими "Sym" и "Asym" участки (см. рис. 2). По-видимому, химическая двойственность участков молекул АО и, соответственно, ВП связана с биохимической химерностью пероксидазы, функционирующей в режимах пероксидазного и оксидазно-го окисления медленно окисляемых субстратов. Так, «симметричность» или «асимметричность» взаимодействующих с пероксидазой молекул циклического строения (аскорбиновая кислота, ИУК), обусловленная числом и положением заместителей в кольцевой системе, вероятно, является причиной их связывания в различных участках активного центра фермента и определяет различный механизм переноса электронов при их окислении [Рогожин, 2004; Газарян и др., 2006].
В самом деле, «симметричная» молекула гидрохинона в небольших концентрациях активирует, а в больших - ингибирует пероксидазное окисление таких медленно окисляемых субстратов, как аскорбиновая кислота [Рогожин, 2004]. Наличие в химической структуре аскорбиновой кислоты четного числа енольных гидроксильных групп предполагает в реакциях ее пероксидазного окисления «симметричный» перенос электронов на молекулу окислителя (пероксида водорода). Напротив, окси-
дазное окисление ИУК в силу ее химического строения сопровождается «асимметричным» переносом электронов, в результате которого образуются свободные радикалы ^ауйзку et а1., 1999]. Аналогично гидрохинону в реакциях пероксидаз-ного окисления аскорбиновой кислоты о-дианизидин оказывает регуляторное действие на оксидазное окисления ИУК [Рогожин и Рогожина, 2004]. Таким образом, участвующие в биохимическом взаимодействии фенольные регуляторы (в малых концентрациях активаторы) и окисляемые субстраты можно разделить на две группы: те, что имеют отношение к пероксидазной функции, и те, что связаны с оксидазной функцией пероксидазы (рис. 8).
но
он
он
он
соон
но
он
Н3СО.
HoN
он
а б
Рис. 8. Субстраты пероксидазного (а) и оксидазного (б) окисления:
1 - аскорбиновая кислота; 2 - гидрохинон; 3 -"симметричные" участки молекул АО и ВП; 4 -ИУК; 5 - о-дианизидин; 6 - "асимметричные" участки молекул АО и ВП
Биохимическое взаимодействие участников окисления упрощенно может быть отражено следующей схемой [8ау^ку et а1., 1999; Рогожин, Рогожина, 2004]: \asym, SYM | ^ |оксидазная функция Т, пероксидазная функция !|
ИУК + О2 + Н2О ^ скатол + СО2 + Н2О2 + О \syrn, ASYM\ ^ \пероксидазная функция оксидазная функция !\ 2Н2О2 + аскорбиновая кислота ^ 2Н2О + дегидроаскорбиновая кислота
Прописные (SYM, ASYM) и строчные буквы (дуж, asym) обозначений фенольных регуляторов на данной схеме соответствуют их большим и малым концентрациям в растительных клетках.
Таким образом, концентрация и природа окисляемых субстратов оказывают определяющее влияние на направление протекания реакций в сторону образования или разрушения пероксида водорода - источника свободных радикалов, необхо-
димых для активизации процессов прорастания семян.
Так, обратная зависимость между сухой биомассой и пероксидазной активностью на этапе «проклевывания» и прорастания семян связана с образованием радикалов, которые оказывают повреждающее действие на мембраны клеток при перекисном окислении содержащихся в них липи-дов и угнетают рост растения. Вероятно, избыточное накопление радикалов, образованных при ок-сидазном окислении ИУК, по принципу отрицательной обратной связи выключает оксидазную и включает пероксидазную опцию фермента. По нашим данным, при большем значении пероксидаз-ной активности наблюдается меньший прирост сухой биомассы корней проростков пшеницы (см. рис. 5, 6).
Прямая зависимость между пероксидазной активностью и сухой биомассой корней 6-суточных проростков пшеницы объясняется расходом энергии, образованной на этапе прорастания при пере-кисном окислении липидов (рис. 7). Так, при более сильном окислительном стрессе, испытанном рас-тигельными клетками на 1-3 сут. с момента помещения семян в чашки Петри, выделяется большее количество энергии, потребляемой растением на более поздних этапах его роста. Более интенсивное образование свободных радикалов в начале роста растения по принципу отрицательной обратной связи может стимулировать биосинтез эндогенных антиоксидантов (аскорбиновая кислота, витамин E), что, в свою очередь, далее вызывает возрастание пероксидазной активности фермента. Постепенное нивелирование различий между значениями сухой биомассы к 6 сут., вероятно, связано с полным израсходованием на рост запасных питательных веществ, изначально содержащихся в семенах.
Таким образом, росторегулирующее действие продуктов биодеструкции парацетамола на пшеницу мягкую связано с их влиянием на пероксидаз-ную систему растения. Эффект фитостимуляции зависит от стадии роста растения и концентрации веществ, содержащихся в водном извлечении из продуктов биодеструкции парацетамола.
Заключение
Продукты бактериальной деструкции парацетамола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 проявляют выраженное фиторегулирующее действие, обусловленное их влиянием на функциональную активность пероксидазы.
Работа выполнена при частичной поддержке Комплексной программы Уральского отделения РАН (проект 15-12-4-10).
Библиографический список
Бондарчук С.С. Основы практический биостатистики. Томск: Изд-во ТГПУ, 2010. 72 с.
Воскресенская О.Л. и др. Большой практикум по биоэкологии. Ч. 1: учеб. пособие. Йошкар-Ола, 2006. 107 с.
Газарян И.Г. и др. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 303-322.
Гладков О.А. и др. Способ получения солей гуми-новых кислот: Евраз. пат. № 006824. Бюл. № 2. 2006. 6 с.
Давидянц Э.С. Влияние обработки семян тритер-пеновыми гликозидами на активность перокси-дазы, ИУК-оксидазы и полифенолоксидазы в проростках пшеницы // Химия растительного сырья. 2013. № 4. С. 225-231.
Ившина И.Б. и др. Алканотрофные родококки как катализаторы процесса биодеструкции не пригодных к использованию лекарственных средств // Прикладная биохимия и микробиология. 2006 . Т. 42, № 4. С. 443-447.
Коротаев М.Ю., Вихарева Е.В., Ившина И.Б. Ме-ланизация полиаминофенолов в процессе биотрансформации парацетамола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 // Вестник Пермского университета. Сер. Биология, 2016. Вып. 2. С. 166-170.
Коротаев М.Ю. и др. Определение средней молекулярной массы нерастворимых продуктов биодеструкции парацетамола клетками Rhodococ-cus ruber ИЭГМ 77 // Фундаментальные исследования. 2015. № 2, Ч. 26. С. 5850-5854.
Коротаев М.Ю. и др. Химическая структура осадка, образующегося в процессе биотрансформации парацетамола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 77 // Биофармацевтический журнал. 2016. Т. 8, № 1. С. 13-19.
Коротаев М.Ю., Солодянкина Е.С., Шибанова Е.Н. Определение удельного показателя поглощения водорастворимых продуктов бактериальной деструкции парацетамола // Научный альманах. 2015. № 12-2(14). С. 372-375.
Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд-во МГУ, 1990. 325 с.
Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере // Со-росовский образовательный журнал. 1997. № 2. С. 56-63.
Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент антиок-сидантной системы живых организмов. СПб.: ГИОРД, 2004. 240 с.
Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Роль индолил-3-уксусной кислоты в реакциях окисления быстро и медленно окисляемых субстратов пероксидаз // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2004. Т. 45. № 6. С. 423-428.
Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Физиолого-биохи-
мические механизмы прорастания зерновок пшеницы // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2011. № 8 (82). С. 17-21.
Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений / под ред. А.А. Мальцева. М.: Мир, 1977. 592 с.
Христин М.С., Ковальченко Ю.М., Алкацева Н.И. Препарат для стимуляции проращивания семян и повышения устойчивости проростков к дефициту влаги и способ его получения: Пат. РФ 2337543. Бюл. № 31. 2008. 13 с.
Arora P.K. Bacterial degradation of monocyclic aromatic amines // Frontiers in Microbiology. 2015. Vol. 6, № 820. URL: http://dx.doi.org/10.3389/ fmicb.2015.00820
Buffle J.A.E. The humic substances in water and their interactions with mineral ions ("Les substances humiques et leurs interactions avec les ions mineraux"). Conference proceedings de la commission d' hydrologie appliquee de A.G.H.T.M. L' Universite d' Orsay, 1977. P. 3-10.
Catalogue of Strains of Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. 2016. URL: http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html (дата обращения: 26.12.2016).
de Gusseme B. et al. Degradation of acetaminophen by Delftia tsuruhatensis and Pseudomonas aeruginosa in a membrane bioreactor // Water Research. 2011. Vol. 45. P. 1829-1837.
Gopalasamy T. et al. Poly Meta-Aminophenol: chemical synthesis, characterization and AC impedance study // Journal of Polymers. 2014. Vol. 2014. The mode of access: http://dx.doi.org/10.1155/2014/827043
Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction // Plant Cell Reports. 2003. Vol. 21, № 9. P. 829-837.
Nardi S. et al. Physiological effects of humic substances on higher plants // Soil Biology and Biochemistry. 2002. Vol. 34. P. 1527-1536.
Savitsky P.A. et al. Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases: specificity for the enzyme structure // Biochemical Journal. 1999. Vol. 340, № 3. P. 579-583.
Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. N. Y.: John Wiley & Sons, 1994. 512 p.
Takenaka S. et al. The metabolic pathway of 4-aminophenol in Burkholderia sp. strain AK-5 differs from that of aniline and aniline with C-4 sub-stituents // Applied and Environmental Microbiology. 2003. Vol. 69, № 9. P. 5410-5413.
Warhurst A.M., Fewson C.A. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus // Critical
Reviews in Biotechnology. 1994. Vol. 14, № 1. P. 29-73.
Wu S., Zhang L., Chen J. Paracetamol in the environment and its degradation by microorganisms // Applied Microbiology Biotechnology. 2012. Vol. 96. P. 875-884.
Zhang L. et al. Degradation of paracetamol by pure bacterial cultures and their microbial consortium // Applied Microbiology and Biotechnology. 2013. Vol. 97, № 8. P. 3687-3698.
References
Bondarchuk S.S. Osnovy prakticheskoy biostatistiki [Fundamentals of practical biostatistics]. Tomsk: TGPU Publ., 2010. 72 p. (In Russ.).
Voskresenskaya O.L., Alyabysheva E.A., Polovnikova M.G. (2006) Bol'shoi praktikum po bioekologii [Large Manual on bioecology]. Ch. 1. Ioshkar-Ola: Mariisk. Gos. Univ. Publ. 107 p. (In Russ.).
Gazaryan I. G., Khushpul'yan D. M., Tishkov V. I. [Features of the structure and mode of action of peroxidases in plants]. Uspekhi biologicheskoy khimii. V. 46 (2006): pp. 303-322. (In Russ.).
Gkadkov O.A., Poloskin R.B., Polyakov Yu.Yu., Sokolova I.V., Sorokin N.I., Glebov A.V. Sposob polucheniya soley guminovykh kislot [Method for producing humic acid salts]. Eurasian patent N. 006824. Bull., 2006, N. 2. 6 p. (In Russ.).
Davidyants E.S. [Effect of the treatment of seeds of triterpenoid glycosides on peroxidase, IAA-oxidase, polyphenoloxidase activities in wheat seedlings]. Khimiya rastitel'nogo syr'ya (Barnaul). N. 4 (2013): pp. 225-231. (In Russ.).
Korotaev M.Yu., Rychkova M.I., Vikhareva E.V., Ivshina I.B. [Polyaminophenol melanization in the process of paracetamol biotransformation by Rhodococcus ruber H3rM 77]. Vestnik Perm-skogo universiteta. Ser. Biologiya (Perm). V. 2 (2016): pp. 166-170. (In Russ.).
Korotaev M.Yu., Polyakova E.B., Vikhareva E.V., Rychkova M.I. [Chemical structure and biological activity of precipitate formed in the process of paracetamol biotransformation with Rhodococcus ruber IEGM 77]. Biofarmatsevticheskiy zhurnal (Moscow). V. 8, N. 1 (2016): pp. 13-19. (In Russ.).
Korotaev M.Yu., Rychkova M.I., Vikhareva E.V., Ivshina I.B. [Determination of the mean molecular weights of insoluble products formed during paracetamol biodegradation by Rhodococcus ru-ber IEGM 77]. Fundamental'nye issledovaniya (Moscow). N. 2 (2015): pp. 5850-5854. (In Russ.).
Korotaev M.Yu., Solodyankina E.S., Shibanova E.N. [Determination of paracetamol bacterial degradation water-soluble products mass extinction coefficient]. Nauchnyy al'manakh (Tambov). V. 12-2, N. 14 (2015): pp. 372-375. (In Russ.).
Orlov D.S. Humusovye kisloty pochv i obshchaya te-oriya gumifikatsii [Humic substances of soils and general theory of humification]. Moscow, MSU Publ., 1990. 325 p. (In Russ.).
Orlov D.S. [Humic substances in the biosphere]
Sorosovskiy obrazovatel'nyy zhurnal (Moscow). N. 2 (1997): pp. 56-63. (In Russ.).
Khristin M.S., Koval'chenko Yu.M., Alkatseva N.I. Preparat dlya stimulyatsii prorashchivaniya semyan i povysheniya ustoychivosti prorostkov k defitsitu vlagi I sposob ego polucheniya [Agent for seed greensprouting stimulation and increasing sprout resistance to moisture deficiency, and method for its obtaining]. Russian patent N. 2337543. Bull., 2008, N. 31. 13 p. (In Russ.).
Rogozhin V.V. Peroksidaza kak komponent antioksi-dantnoy sistemy zhivykh organizmov [Peroxidase as a component of the antioxidant system of living organisms]. St. Petersburg: GIORD, 2004. 240 p. (In Russ.).
Rogozhin V.V., Rogozhina T.V. [Effect of indolyl-3-acetic acid in oxidation reaction of slowly and rapidly oxidizable peroxidaze substrates]. Vestnik Moskovskogo universiteta. Ser. 2. Khimiya (Moscow). V. 45, N. 6 (2004): pp. 423-428. (In Russ.).
Rogozhin V.V., Rogozhina T.V. [Physiological and biochemical mechanisms of germination of wheat grains]. Vestnik Altayskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta (Barnaul). V. 8, N. 82 (2011): pp. 17-21. (In Russ.).
Silverstein R.M., Bassler G.C., Morrill T.C. Spektro-metricheskaya identifikatsiya organicheskih soedineniy [Spectrometric identification of organic compounds]. Edited by A.A. Mal'tsev. Moscow, Mir Publ., 1977. 592 p. (In Russ.).
Arora P.K. Bacterial degradation of monocyclic aromatic amines. Frontiers in Microbiology. V. 6, N. 820 (2015). The mode of access: http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2015.00820
Buffle J.A.E. The humic substances in water and their interactions with mineral ions ("Les substances humiques et leurs interactions avec les ions mineraux"). Conference proceedings de la commission d' hydrologie appliquee de A.G.H.T.M. L' Universite d' Orsay, 1977. p. 3-10.
de Gusseme B., Vanhaecke L., Verstraete W., Boon N. Degradation of acetaminophen by Delftia tsu-ruhatensis and Pseudomonas aeruginosa in a membrane bioreactor. Water Research. V. 45. (2011): pp. 1829-1837.
Gopalasamy T., Gopalswamy M., Gopichand M., Raj J. Poly Meta-Aminophenol: chemical synthesis, characterization and AC impedance study. Journal of Polymers. V. 2014 (2014). The mode of access: http://dx.doi.org/10.1155/2014/827043
Ivshina I.B., Rychkova M.I., Vikhareva E.V., Chek-ryshkina L.A., Mishenina I.I. Catalysis of the biodegradation of unusable medicines by alkanotro-phic rhodococci. Applied Biochemistry and Microbiology. V. 42, N. 4 (2006): pp. 392-395.
Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant Cell Reports. V. 21, N. 9 (2003): pp. 829-837.
Nardi S., Pizzeghello D., Muscolo A., Vianello A. Physiological effects of humic substances on higher plants. Soil Biology and Biochemistry. V. 34 (2002): pp. 1527-1536.
Catalogue of Strains of Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. 2010. The mode of access: http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html
Savitsky P.A., Gazaryan I.G., Tishkov V.I., La-grimini L.M. Oxidation of indole-3-acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases: specificity for the enzyme structure. Biochemical Journal. V. 340, N. 3 (1999): pp. 579-583.
Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. New York: John Wiley & Sons, 1994. 512 p.
Takenaka S., Okugawa S., Kadowaki M., Murakami S., Aoki K. The metabolic pathway of 4-aminophenol in Burkholderia sp. strain AK-5 differs from that of aniline and aniline with C-4 substituents. Applied and Environmental Microbiology. V. 69, N. 9 (2003): pp. 5410-5413.
Warhurst A.M., Fewson C.A. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus. Critical Reviews in Biotechnology. V. 14, N. 1 (1994): pp. 29-73.
Wu S., Zhang L., Chen J. Paracetamol in the environment and its degradation by microorganisms Applied Microbiology Biotechnology. V. 96 (2012): pp. 875-884.
Zhang L., Hu J., Zhu R., Zhou Q., Chen J. Degradation of paracetamol by pure bacterial cultures and their microbial consortium. Applied Microbiology and Biotechnology. V. 97, N. 8 (2013): pp. 36873698.
Поступила в редакцию 09.01.2017
Об авторах
Коротаев Михаил Юрьевич, аспирант кафедры аналитической химии
Пермская государственная фармацевтическая академия
ORCID: 0000-0002-6376-1435 614990, Пермь, ул. Полевая, 2; mikhail5555@mail.ru; (342)2825856
Вихарева Елена Владимировна, доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой аналитической химии Пермская государственная фармацевтическая академия
ORCID: 0000-0002-0219-5214 614990, Пермь, ул. Полевая, 2; vikhareva@pfa.ru; (342)2825856
Белоногова Валентина Дмитриевна, доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники Пермская государственная фармацевтическая академия
ORCID: 0000-0001-8414-4367 614990, Пермь, ул. Полевая, 2; belonogova@pfa.ru; (342)2384338
Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических
наук, профессор, академик РАН, зав. лабораторией
алканотрофных микроорганизмов
ФГБУН Институт экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН
ORCID: 0000-0003-2558-4789
614081, Пермь, ул. Голева, 13; ivshina@iegm.ru;
(342)2808114
профессор кафедры микробиологии и иммунологии
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
About the authors
Korotaev Mikhail Yur'evich, postgraduate, Analytical Chemistry department Perm State Pharmaceutical Academy ORCID: 0000-0002-6376-1435 2, Polevaya str., Perm, Russia, 614990; mikhail5555@mail.ru; +7(342)2825856
Vikhareva Elena Vladimirovna, Doctor of pharmacy, Professor, Head of Analytical Chemistry department
Perm State Pharmaceutical Academy ORCID: 0000-0002-0219-5214 2, Polevaya str., Perm, Russia, 614990; vikhareva@pfa.ru; +7(342)2825856
Belonogova Valentina Dmitrievna, Doctor of
pharmacy, Professor, Head of Pharmacognosy with
botany course department
Perm State Pharmaceutical Academy
ORCID: 0000-0001-8414-4367
2, Polevaya str., Perm, Russia, 614990;
belonogova@pfa.ru; +7(342)2384338
Ivshina Irina Borisovna, Doctor of Microbiology, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of Alkanotrophic Microorganism Laboratory Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS ORCID: 0000-0003-2558-4789 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; ivshina@iegm.ru; (342)2808114
Professor of the department Microbiology and Immunology
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
