CC BY
48
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 615.012/.014
ФИТОМАССА НАЯДЫ МЕЛКОЗУБЧАТОЙ В ДООЧИСТКЕ ФЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ВОД ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
Г.С. Быкова, И.Ф. Шаталаев, А.В. Воронин,
ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Быкова Галина Сергеевна - e-mail: [email protected]
В работе проведено исследование способности фитомассы наяды мелкозубчатой (Najas micro-don) удалять соединения класса фенолов из модельных образцов загрязненных вод фармацевтических производств. Исследованы состав и активность молекулярных форм малатдегидрогеназы наяды мелкозубчатой в процессе очистки воды от фенола и пирокатехина. Показана возможность и целесообразность использования наяды мелкозубчатой для проведения доочистки загрязненных вод.
Ключевые слова: водный макрофит, наяда мелкозубчатая, загрязнение,
фенолы, вода, малатдегидрогеназа.
In the work it is carried out research of ability Najas microdon phytomass to delete phenolic compounds from modeling samples of the polluted waters by pharmaceutical productions. The structure and activity of molecular forms Najas microdon malatdehydrogenase in the process of water purification from phenol and pyrocatechin are investigated. The opportunity and expediency of use of Najas microdon for carrying out the additional cleaning of polluted waters is shown.
Key words: aquatic macrophyte, Najas microdon, pollution, phenols,
water, malatdehydrogenase.
Введение
Уровень загрязнения водных объектов окружающей среды органическими соединениями антропогенного происхождения, обладающими высокой канцерогенной и мутагенной активностью, достаточно высок. В настоящее время распространенными загрязнителями становятся лекарственные вещества. Среди основных источников загрязнения необходимо отметить загрязненные воды химико-фармацевтических предприятий, бытовые стоки, а также стоки животноводческих комплексов. Лекарственные вещества в составе загрязненных вод поступают на очистные сооружения, как в неизменной, так и в метаболизированной формах.
В числе лекарственных препаратов, наиболее часто упоминающихся в научных публикациях, антибиотики, анальгетики, регуляторы липидного обмена, антибактериальные и стероидные препараты. Их избыточные количества в воде отрицательно сказываются на деятельности различных систем организма [1, 2].
Технологическая вода фармацевтических производств может содержать не только сами лекарственные вещества, но и исходные вещества, и полупродукты органического синтеза. Фенолы и их производные являются одними из ключевых компонентов сточных вод фармацевтических предприятий и относятся к высокоопасным веществам (II класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76). В медицинской практике в качестве лекарственных субстанций применяются такие соединения как фенол, тимол, резорцин. Одноатомные и многоатомные фенолы, нафтолы и их производные (салициловая кислота, и-аминофенол, ж-аминофенол и др.) широко представлены в технологии синтеза фармацевтических препаратов. В частности, из салициловой кислоты получают ацетилсалициловую кислоту, которая сегодня используется в количествах больших, чем любое другое лекарственное средство [3].
Традиционные биологические методы очистки загрязненных вод при высоких концентрациях органических токсикантов часто не позволяют осуществлять адекватную очистку. В настоящее время для доочистки загрязненных вод используются высшие водные растения. В литературных источниках отмечают перспективы использования для этой цели фитомассы наяды мелкозубчатой (\ajas т1сгос1оп), которая относится к числу полностью погруженных водных макрофитов.
В ходе процесса биологической очистки для оценки физиологического и функционального состояния водных макрофитов используют показатели активности и структурной организации тех или иных ключевых ферментов метаболизма. Малатдегидрогеназа (МДГ, 1_-малат: НАД-оксидоредуктаза; К.Ф.1.1.1.37) - широко распространенный фермент животных, растений и микроорганизмов. МДГ катализирует окисление (дегидрирование) яблочной кислоты (_ малата) до щавелевоуксусной (оксалоацетата) в присутствии кофактора НАД+, является одним из ключевых ферментов цикла Кребса [4].
Таким образом, данные об изменении состава и активности молекулярных форм МДГ могут служить характеристикой функционального состояния биологического объекта, применяемого для очистки загрязненных вод.
Цель работы: определить способность фитомассы наяды мелкозубчатой поглощать из водных растворов некоторые органические вещества класса фенолов. Исследовать состав и активность молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой в процессе очистки модельных образцов загрязненных вод с различными концентрациями фенола и пирокатехина.
Материал и методы
Объектом исследования являлась фитомасса наяды мелкозубчатой (\ajas ткгоСоп), культивированной в лабораторных условиях.
Из числа наиболее распространенных компонентов загрязненных вод в эксперименте нами были выбраны фенол, о-крезол, ж-аминофенол, тимол, пирокатехин, резорцин, гидрохинон, 1 и 2 нафтол.
При моделировании процесса доочистки воды фитомассу наяды мелкозубчатой в количестве 5,0 г на 1 дм3 раствора (сырой вес) промывали дистиллированной водой и помещали в водные растворы указанных веществ с концентрацией 50 мг/дм3. Отбор проб воды проводили в течение нескольких суток с интервалом 24 часа.
Количественное определение содержания фенолов в модельных образцах загрязненных вод осуществляли фотометрическим методом, основанным на образовании окрашенных соединений фенола, его производных и гомологов с 4 аминоантипирином в присутствии калия гексацианоферрата (III) в щелочной среде [5].
Параллельно проводили анализ проб воды контрольных растворов фенолов (без фитомассы наяды мелкозубчатой) с аналогичными концентрациями, учитывая уменьшение содержания фенолов вследствие аутоокисления. Интенсивность изъятия органического вещества определяли как разность между концентрациями вещества в контрольном и опытном растворах, рассчитанную на 1,0 г фитомассы наяды мелкозубчатой.
Для исследования состава и относительной активности молекулярных форм МДГ 5,0 г фитомассы наяды мелкозубчатой промывали дистиллированной водой и помещали в 1 дм3 водных растворов фенола и пирокатехина с концентрациями 10, 30 и 50 мг/дм3. В качестве контроля использовали фитомассу наяды без инкубации в растворах фенола и пирокатехина. Отбор проб фитомассы проводили в течение нескольких суток с интервалом 24 часа.
Выделение ферментов из фитомассы наяды мелкозубчатой осуществляли следующим образом: фитомассу промывали дистиллированной водой для удаления фоновых загрязнений, высушивали с помощью бумажного фильтра, взвешивали 0,3 г фитомассы, дезинтегрировали в фарфоровой ступке с 0,5 см3 охлажденного до 4°С 1/15 М фосфатного буфера pH 7,2 в течение 5 мин. Далее дезинте-грат количественно переносили в колбу, добавляли 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера pH 7,2 и тритон Х100 в конечной концентрации 20 мг/см3. Колбу помещали на магнитную мешалку для солюбилизации фермента на 1 час. Гомогенат центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Полученные образцы хранили в замороженном виде не более 6 суток. В супернатанте определяли молекулярные формы МДГ методом электрофореза в плоских блоках 7,5% полиакриламидного геля. Анализируемые образцы смешивали с 40% раствором сахарозы в соотношении 2:1,
0,5 см3 полученной смеси наносили на линию старта. В качестве электродного буфера использовали 1 М трис-ЭДТА-боратный буфер с pH 9,2. Электрофорез проводили при величине тока 5,0 мА/см в начальные 30 мин., а затем 10 мА/см до окончания электрофореза.
Детектирование молекулярных форм МДГ проводили с помощью феназинметасульфат-тетразолиевой реакции в инкубационной среде следующего состава: НАД водный раствор (1 мг/см3) - 30 см3; нитросиний тетразолиевый водный раствор (1 мг/см3) - 22,2 см3; натрия малат водный раствор (1М) pH 7,0 - 21 см3; феназинметасульфат водный
раствор (1 мг/см3) - 5,1 см3; 0,2 М трис-НС1 буфер pH 7,1 -21 см3; вода дистиллированная - 70,2 см3. Гелевые блоки заливали инкубационным раствором в чашках Петри, инкубировали при 37°С в течение 12 часов. Молекулярные формы МДГ выявлялись в виде темно-синих зон. Относительную активность каждой зоны в образцах определяли методом прямой денситометрии на анализаторе фореграмм АФ 1 (ПО «Львовприбор»).
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования динамики изъятия фенолов из модельных образцов загрязненных вод фитомассой наяды представлены на рис. 1 и 2. Очевидно, что двухатомные фенолы (пирокатехин, гидрохинон, резорцин) адсорбируются быстрее, чем одноатомные - фенол и о-крезол (о-метилфенол). Интенсивность изъятия нафтолов фитомассой наяды несколько ниже, чем двухатомных фенолов. Интенсивность изъятия фитомассой м аминофенола и тимола (2 изопропил-5 метилфенола) менее выражена.
О 2 4 6 8 10 12
Время, сутки
РИС. 1.
Динамика изъятия одноатомных фенолов фитомассой наяды мелкозубчатой.
РИС. 2.
Динамика изъятия двухатомных фенолов и нафтолов фитомассой наяды мелкозубчатой.
Установлено также, что уменьшение концентрации фенолов в растворах с фитомассой наяды мелкозубчатой происходит значительно быстрее, чем в контрольных растворах без растения. Так, в модельных образцах загрязненных вод с фитомассой наяды в течение 11 суток содержание фенола снизилось на 34%, о-крезола - на 41%. В контрольных растворах без фитомассы наблюдали следующие закономерности: концентрация фенола осталась без изменения, концентрация о-крезола уменьшилась на 10%.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Уменьшение концентрации пирокатехина, гидрохинона, резорцина составило соответственно 77%, 49% и 39%, тогда как аутоокисление контрольных растворов двухатомных фенолов составило 10-15%. В модельных образцах загрязненных вод с фитомассой, содержащих 1-нафтол и 2-нафтол, произошло уменьшение концентрации на 86% и 69% соответственно, в контроле - на 39% и 11%. Концентрация тимола снижалась на 23%, а при аутоокислении на 19%, для л-аминофенола это соотношение составило 6% и 2%.
Эксперименты показали, что при окислении пирокатехина 1-нафтола и 2-нафтола с участием ферментных систем наяды мелкозубчатой образуются окрашенные соединения. Логично предположить образование смеси различных продуктов окисления или конденсации фенолов и хинонов. Экспонирование фитомассы наяды в модельных образцах загрязненных вод, содержащих 1-нафтол и 2-нафтол, на 10-е сутки привело к появлению начальных признаков хлороза. После эксперимента фитомасса не восстанавливалась и погибала примерно на 14-е сутки. При экспонировании фитомассы наяды в загрязненной воде с пирокатехином на 9-е сутки наблюдали изменение внешнего вида растения: появились признаки нежизнеспособности, ярко-зеленая окраска сменилась на бурую, растение выглядело «обожженным».
Вышеуказанные результаты позволяют сделать заключение, что пирокатехин, 1- и 2-нафтолы в концентрации 50 мг/дм3 оказывают отрицательное действие на фитомассу наяды мелкозубчатой, что необходимо учитывать при залповых сбросах загрязненных вод, содержащих названные соединения.
В модельных образцах вод, загрязненных другими фенольными соединениями, изменений внешнего вида наяды мелкозубчатой не наблюдали.
В сериях экспериментов по исследованию состава молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой при инкубации в модельных образцах загрязненных вод, содержащих фенол и пирокатехин с концентрациями 10, 30 и 50 мг/дм3, установлено, что фермент выявляется в виде двух активных зон с относительной электрофоретической подвижностью 0,83 (МДГ-1) и 0,67 (МДГ-2). Основная активность фермента локализована в области МДГ-2, активность МДГ 1 менее выражена.
В таблицах 1 и 2 представлены результаты определения относительной активности молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой в процессе изъятия фитомассой фенола и пирокатехина в разные периоды инкубации при различных концентрациях загрязнителя. Состав и активность молекулярных форм МДГ представлены на рис. 3, где отражены электрофореграммы малатдегидрогеназы ферментных образцов наяды мелкозубчатой, экспонированной в модельных образцах загрязненных вод с концентрацией пирокатехина 10 мг/дм3.
Малатдегидрогеназа относится к числу довольно хорошо изученных ферментов. По литературным данным у большинства исследованных высших растений обнаружено две формы МДГ: митохондриальная и цитоплазматическая. Первая функционирует в рамках цикла Кребса, а вторая (растворимая) может играть роль челночного механизма среди субклеточных компонентов, участвовать в автотрофной фиксации С02 у высших растений, в кислот-
ном метаболизме в тканях растений и других метаболических путях. В растительных тканях МДГ найдена также в глиоксисомах, пероксисомах и микросомах [4, 6]. Поскольку изоферменты являются носителями определенных функций в метаболизме, то они могут быть факторами идентификации этих функций.
РИС. 3.
Электрофореграммы молекулярных форм малатдегидрогеназы наяды мелкозубчатой в контроле (а) и при инкубации в модельных образцах загрязненных вод с содержанием пирокатехина 10 мг/дм3 через 1сутки (б), 2 суток (в), 3 суток (г) и 6 суток (д). Концентрирующий (А) и разделяющий (В) гели;
1, 2 - зоны активности МДГ-1 и МДГ-2.
ТАБЛИЦА 1.
Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой при инкубации в модельных образцах вод, загрязненных фенолом
Время инкубации, сутки Относительная активность, %
10 мг/дм3 30 мг/дм3 50 мг/дм3
МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2
Контроль 2,3 97,7 2,3 97,7 2,3 97,7
1 1,2 98,8 8,1 91,9 1,1 98,9
2 1,3 98,7 4,2 95,8 5,5 94,5
3 2,3 97,8 2,3 97,7 7,5 92,5
6 1,3 98,7 6,5 93,5 17 83
ТАБЛИЦА 2.
Динамика относительной активности молекулярных форм МДГ наяды мелкозубчатой при инкубации в модельных образцах вод, загрязненных пирокатехином
Время инкубации, сутки Относительная активность, %
10 мг/дм3 30 мг/дм3 50 мг/дм3
МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2 МДГ-1 МДГ-2
Контроль 3,8 96,2 3,8 96,2 3,8 96,2
1 1,3 98,7 4,5 95,5 4,5 95,5
2 11,3 88,7 4,0 96,0 2,6 97,4
3 9,5 90,5 1,3 98,7 12,3 87,7
6 17,3 82,7 12,8 87,2 9,5 90,5
Из проведенных экспериментов видно, что растительная клетка тонко реагирует на изменение концентрации и продолжительности воздействия токсиканта. При инкубации фитомассы наяды мелкозубчатой в модельных образцах загрязненных вод с концентрацией фенола 10 мг/дм3 наблюдали минимальную активность МДГ-1 по сравнению с МДГ-2 в течение всех 6 суток, за исключением третьих суток, когда был отмечен небольшой подъем активности МДГ-1 до уровня таковой в контрольном образце.
При концентрации фенола 30 мг/дм3 наблюдали более чем трехкратное увеличение активности МДГ-1 в первые сутки по сравнению с контрольным опытом, затем плавное снижение до контрольной отметки к третьим суткам и рост таковой к шестому дню эксперимента до уровня, превышающего контрольный в три раза. При экспонировании фитомассы наяды в модельных образцах загрязненных вод с концентрацией фенола 50 мг/дм3 отмечен стабильный рост относительной активности МДГ-1 до максимального значения, превышающего на шестые сутки более чем в семь раз относительную активность МДГ-1 контрольного образца.
Инкубация в модельных образцах загрязненных вод с содержанием пирокатехина 10 мг/дм3, более токсичного для фитомассы наяды, чем одноатомный фенол, привело к увеличению относительной активности МДГ-1 с минимального значения в первые сутки до пятикратного увеличения по сравнению с контролем на шестой день эксперимента. При повышении содержания пирокатехина до 30 и 50 мг/ дм3 наблюдали увеличение активности МДГ-1 уже в первые сутки, при этом максимум активности установлен на шестой день при 30 мг/дм3 и на третий день - при 50 мг/дм3.
Выводы
1. В результате проведенных исследований показана способность фитомассы наяды мелкозубчатой поглощать фенолы и нафтолы из модельных образцов загрязненных вод с конценрацией вышеуказанных веществ 50 мг/дм3. Наиболее эффективно фитомасса наяды мелкозубчатой поглощает фенол, о-крезол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, 1- и 2-нафтолы.
2. Установлено, что пирокатехин, 1- и 2-нафтолы в концентрации 50 мг/дм3 оказывают отрицательное действие
на фитомассу наяды мелкозубчатой, что необходимо учитывать при залповых сбросах загрязненных вод, содержащих названные соединения.
3. Малатдегидрогеназа наяды мелкозубчатой представлена в составе двух молекулярных форм - МДГ-1 и МДГ-2. Увеличение активности молекулярных форм МДГ в процессе очистки загрязненных вод, содержащих соединения класса фенолов, указывает на мобилизацию цикла Кребса в ключевом фрагменте.
4. Полученные результаты подтверждают возможность и целесообразность использования фитомассы наяды мелкозубчатой в системе доочистки фенолсодержащих загрязненных вод фармацевтических производств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Voigt K., Bruggemann R. Water contamination with pharmaceuticals: Data availability and evaluation approach with hasse diagram technique and METEOR // MATCH: Commun. Math. and Comput. Chem. 2005. Vol. 54. № 3. P. 671-689.
2. Gobel A., Thomsen A., Mcardell C.S., Joss A., Giger W. Occurence and sorption behavior of sulfonamides, macrolides, and trimethoprim in activated sludge treatment. Environ. Sci. and Technol. 2005. Vol. 39. № 11. P. 3981-3989.
3. Вартанян Р.С. Синтез основных лекарственных средств. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. 845 с.
Vartanyan R.S. Sintez osnovnyh lekarstvennyh sredstv. M.: Medicinskoe informacionnoe agenstvo, 2004. 845 s.
4. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. 1120 с.
Dikson M., Ue’bb E. Fermenty. M.: Mir, 1982. 1120 s.
5. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленный сточных вод. М.: Химия, 1984. 448 с.
Lur’e Yu.Yu. Analiticheskaya himiya promyshlennyh stochnyh vod. M.: Himiya, 1984. 448 s.
6. Юдина Р.С. Генетика и феногенетика малатдегидрогеназы растений. Вестник ВОГиС. 2010. Т. 14. № 2. С. 243-254.
Yudina R.S. Genetika i filogenetika malatdegidrogenazy rastenij. Vestnik VOGiS. 2010. T. 14. № 2. S. 243-254.
