CC BY
65
Химия растительного сырья. 2017. №1. С. 71-75.
DOI: 10.14258/jcprm.2017011416
УДК 577.13
ФИТОЭКДИСТЕРОИДЫ КОРНЕЙ SILENE FRIVALDSZKYANA HAMPE
© Л.Н. Зибарева1', О.В. Волкова1, C.B. Морозов2, Е.И. Черняк2
1 Томский государственный университет, Сибирский ботанический сад, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия), e-mail: zibareva.lara@yandex.ru
2 Новосибирский институт органической химии СО РАН, пр. Лаврентьева, 9, Новосибирск, 630090 (Россия)
Из корней интродуцированных в Западную Сибирь Silene frivaldszkyana (Caryophyllaceae) выделены экдистероиды: 20-гидроксиэкдизон, полиподин B, интегристерон A, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, 20,26-дигидроксиэкдизон, 26-гидроксиполиподин В, 20-гидроксиэкдизон-25-Р^-глюкозид. Структуры идентифицированы с помощью методов ЯМР-, масс-спектрометрии, ВЭЖХ. Наличие 26-гидроксиинтегристерона А в корнях установлено при сравнительном ВЭЖХ-анализе с выделенным соединением из надземной части Silene frivaldszkyana. Показано, что исследуемый вид Silene синтезирует характерные для данного рода экдистероиды : 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, 20-гидроксиэкдизон, полиподин B, интегристерон A и является богатым источником их 26-гидрокси производных. Наряду с распространенными экдистероидами в видах рода Silene впервые в исследуемом виде выделен 20-гидроксиэкдизон-25-Р^-гликозид.
Сравнительный анализ состава экдистероидов в надземной и подземной частях показал, что корни содержат более богатый их состав, видимо, это связано с тем, что корни многолетних растений аккумулируют эти соединения. А 20-гидроксиэкдизон-25-Р^-глюкозид, вероятно, является запасным веществом мажорного компонента - 20-гидроксиэкдизона.
Ключевые слова: фитоэкдистероиды, идентификация, корни Silene frivaldszkyana.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РГНФ/РФФИ и администрации Томской области в рамках научного проекта № 16-44-700634.
Введение
Растения синтезируют множество стероидных соединений, присущих не только растительному, но и животному миру. Наиболее широко распространены в мировой флоре экдистероиды, которые являются аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых. Экдистероиды по химической природе принадлежат к полиоксистероидам с гидроксильными группами в стероидном ядре и боковой цепи, цис-сочленением между циклами А и В, содержащими 7-ен-6-он хромоформную группу, 14-ОН. В настоящее время известно о широком распространении этих стероидов в растениях семейства Caryophyllaceae (роды Lychnis, Silene, Petrocoptis и др.).
Silene frivaldszkyana Hampe. - один из перспективных видов по содержанию и составу фитоэкдисте-роидов, впервые рекомендованный в качестве источника этих БАВ [1, 2]. В процессе многолетнего изучения в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета (СБ С ТГУ) вида Silene
frivaldszkyana, являющегося эндемиком Балканского полуострова, показано, что растения способны успешно адаптироваться в Западной Сибири и произрастать на протяжении 17 лет. Растения проходят полный цикл развития, получен ряд поколений, сохраняющих способность синтезировать фитоэкдистероиды.
Установлено, что в надземной части Silene frivaldszkyana синтезируются 20-гидроксиэкдизон,
* Автор, с которым следует вести переписку.
Зибарева Лариса Николаевна - доктор химических наук,
заведующая лабораторией фитохимии,
e-mail: zibareva.lara@yandex.ru
Волкова Ольга Владимировна - старший лаборант,
e-mail: olgavolkova2510@rambler.ru
Морозов Сергей Владимирович - кандидат химических
наук, заведующий лабораторией,
e-mail: morozov@nioch.nsc.ru
Черняк Елена Ильинична - старший научный сотрудник, e-mail: chernyak@nioch.nsc.ru
72
Л.Н. Зибарева, O.B. Волкова, C.B. Морозов, Е.И. Черняк
полиподин В, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, интегристерон А, 26-гидроксиполиподин В, 20,26-гидроксиэкдизои, 26-гидроксиинтегристерои А [3, 4]. Последнее соединение является новым и впервые выделенным. Структуры выделенных соединений установлены с помощью ЯМР-, масс-спектрометрии, ВЭЖХ. Информация о выделенных экдистероидах и источнике включена в международную базу данных Ecdybase.org [5]. Отличительной особенностью состава этого вида является синтез ряда 26-оксипроизводных экдистероидов [3, 6]. Поскольку корни этого ценного вида отличаются высоким содержанием экдистероидов, важно было изучить их состав.
Цель настоящего исследования - изучение состава экдистероидов корней Silene frivaldszkyana, ин-тродуцированного в Сибирском ботаническом саду ТГУ.
Экспериментальная часть
Выделение экдистероидов проводили из подземной части растений, интродуцированных в СБ С ТГУ с 1994 г. Растительное сырье является вторым поколением от маточных растений, семена для которых получены из ботанического сада Галле (Германия).
Корни Silene frivaldszkyana (250 г) экстрагировали пятикратно 70% этиловым спиртом. Экстрагент отгоняли под вакуумом при температуре 50 °С с помощью вакуумного ротационного испарителя IKA HB 10 digital (Германия). Концентрированный экстракт разбавляли водой в соотношении 1 : 2, отфильтровывали. Фильтрат очищали от липофильных веществ н-гексаном. Сумму экдистероидов из очищенного фильтрата извлекали н-бутанолом. Бутанольную фракцию сконцентрировали до смолообразного состояния.
Затем полученную бутанольную смесь фракционировали системами растворителей хлороформ -этиловый спирт в соотношениях 7 : 1; 4 : 1; 2 : 1. Полученные фракции сконцентрировали на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Концентрированные фракции, обогащенные неполярными, средне полярными и полярными экдистероидами, подвергали многократному разделению на колонках с силикагелем марки КСК (Россия) с размером частиц 0,10-0,16 мм. В процессе хроматограграфирования в качестве элюентов использовали системы растворителей хлороформ - этанол: 1) 9 : 1; 2) 7 : 1; 3) 5 : 1; 4) 4 : 1; 5) 2 : 1; 6) 1 : 1. Контроль над разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ на пластинках TLC Silica gel 60 F254 Merk. Идентификацию выделенных экдистероидов Silene frivaldszkyana проводили с помощью методов ВЭЖХУУФ, ВЭЖХ/МС и ЯМР-спектроскопии.
ВЭЖХ/УФ-анализ выполнен на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с диодноматричным детектором. Хроматографическая колонка ZORBAX Eclipse XDB C8; 4,6*150 мм, размер зерна сорбента 5 мкм. Градиентное элюирование вели системой растворителей метанол - 0,1% трифторуксусная кислота от 0 до 100% метанола; скорость элюирования 0,8 мл/мин. Аналитическая длина волны Xmax = 254 нм для регистрации фитоэкди стероидов.
ВЭЖХ/МС-анализ проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 с диодно-матричным детектором и гибридным квадруполь-время пролетным масс-спектрометром micrOTOF-Q (фирма Bruker). Колонка: Zorbax XDB-C8, 2,1*50 mm. Элюент: H2O-ACN (линейный градиент содержания ACN от 5 до 40% с 0 до 20 мин). Скорость потока: 0,4 мл/мин. Рабочие параметры масс-детектирования: методы ионизации: химическая ионизация и электростатическое распыление при атмосферном давлении (APCI pos. и API-ES); сканирование положительных и отрицательных ионов в диапазоне m/z = 200-800; поток газа-осушителя (азот): 4 л/мин, температура 240 °С, температура на распылителе - 390 °C. Спектры ЯМР зарегистрированы на приборах «Bruker AV 400».
Обсуждениерезультатов
ВЭЖХ/УФ бутанольной фракции, выделенной из корней S. frivaldszkyana, свидетельствует о более богатом составе экдистероидов, чем в надземной части, идентификация которых была осуществлена в лаборатории профессора Р. Лафона (университет П. и М. Кюри, Париж) [3]. В бутанольной фракции надземной части Silene frivaldszkyana обнаружено 10 экдистероидов, тогда как в бутанольной фракции экстракта корней Silene frivaldszkyana - 14 экдистероидов.
В результате адсорбционной хроматографии на колонках и препаративной ВЭЖХ выделено 8 соединений. Мажорным компонентом экдистероидной суммы исследуемого вида является соединение со временем удерживания 9,727 мин, имеющее характерный для экдистероидов УФ-спектр (А, = 248 нм) и масс-спектр c характерной фрагментацией (М+ 481), что соответствует структуре 20-гидроксиэкдизона (I). Это подтвер^да-
фитоэкдистероиды корней SILENE FRIVALDSZKYANA Hampe
73
ется и спектром ПМР (CD3OD, 5, м.д.): 0,884 (3Н, с, СН3-18), 0,964 (3Н, с, СН3-19), 1,202 (3Н, с, СН3-21), 1,190 (3Н, с, СН3-26, 27), 1,753 (2Н, д, Н-1), 5,822 (1Н, д, Н-7), 1,295 (2Н, д, Н-23), 3,843 (1Н, т, Н-2), 3,873 (1Н, т, Н-3), 1,786 (2Н, т, Н-4), 2,386 (1Н, т, Н-5, H-17), 3,149 (1Н, т, Н-9), 1,425 (2Н, т, Н-24).
Полиподин B (II), mp. 215-217 °C. 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, ppm): 5 0,73 (3H, s, CH3-18), 0,76 (3H, s, CH3-19), 1,06 (3H, s, CH3-21), 1,09 (6H, s, CH3-26 and CH3-27), 2,19 (1H, t-like, J = 8,4 Hz, H-17), 2,99 (1H, t-like, J = 8,1 Hz, H-9), 3,22 (1H, m, H-22), 3,76 (1H, m, H-2), 3,85 (1H, br s, H-3), 5,79 (1H, s, H-7).
Интегристерон A (III), 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, ppm): 5 0,81 (3H, s, CH3-18), 1,05 (3H, s, CH3-19), 1,12 (3H, s, CH3-21), 1,15 (6H, s, CH3-26 and CH3-27), 2,26 (1H, t-like, J = 7,7 Hz, H-17), 2,55 (1H, m, H-5), 2,93 (1H, m, H-9), 3,30 (1H, m, H-22), 3,82 (2H, m, H-1 and H-2), 4,02 (1H, br s, H-3), 5,79 (1H, s, H-7). ESMS (-ve): m/z (% rel. intensity) 495,9 [M-Hf (100).
2-Дезокси-20-гидроксиэкдизон (IV), 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, ppm): 8 0,79 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-19), 1,13 (3H, s, CH3-21), 1,16 (6H, s, CH3-26 and CH3-27), 2,27 (1H, t-like, J = 8,4 Hz, H-17), 2,37 (1H, dd, J = 3,9, 12,1 Hz, H-5), 3,05 (1H, m, H-9), 3,33 (1H, m, H-22), 3,97 (1H, br s, H-3), 5,78 (1H, s, H-7). ESMS (+ve): m/z (% rel. intensity) 465,2 [M+H]+ (100).
На ВЭЖХ этот компонент экдистероидной суммы имеет время удерживания 15,303 мин, максимум поглощения X = 248 нм, в масс-спектре характерную фрагментацию (М+ 464) и идентифицирован с 2-дезокси-20-гидроксиэкдизоном.
20,26-дигидроксиэкдизон (V). Соединение со временем удерживания 8,652 мин, имеющее свойственный экдистероидам УФ-спектр (X = 248 нм) и масс-спектр c характерной фрагментацией (М+ 496), соответствует структуре 20,26-дигидроксиэкдизона. Это подтверждается спектром ПМР (CD3OD, 5, м.д.): 0,930 (3Н, с, СН3-18), 1,109 (3Н, с, СН3-19), 1,222 (3Н, с, СН3-21), 1,222 (3Н, с, СН3-27), 5,877 (1Н, д., Н-7), 2,607 (1Н, дд., Н-5), 3,114 (1Н, т., Н-9), 2,415 (1Н, т., Н-17), 3,345 (CH2-OH, дд).
Компонент экдистероидной суммы со временем удерживания 9,298 мин, имеющий характерный для экдистероидов УФ-спектр (X = 248 нм) и масс-спектр, свойственный для экдистероида с М+ 512, соответствует структуре 26-гидроксиполиподина В (VI).
Соединение со временем удерживания 16,401 мин, имеющий в УФ-спектре X = 248 нм и масс-спектр c характерной фрагментацией (М+ 416), что соответствует структуре 2-дезоксиэкдизона (VII).
20-гидроксиэкдизон-25-р-Э-гликозид (VIII), имеет УФ-спектр (X = 248 нм) и масс-спектр c характерной фрагментацией (М+ 643). Спектр ПМР (ДМСО, 5, м.д.): 0,752 (3Н, с, СН3-18), 0,851 (3Н, с, СН3-19), 1,069 (3Н, с, СН3-21), 1,045 (3Н, с, СН3-26), 1,054 (3Н, с, СН3-27), 1,468 (1Н, д., Н-1), 5,642 (1Н, д., Н-7), 2,150 (1Н, дд., Н-5), 1,494 (2Н, т., Н-4), 2,980 (1Н, т., Н-9), 1,707 (2Н, т., Н-15), 1,633 (2Н, дд., Н-16), 2,244 (1Н, т., Н-17), 4,636 (1Н, д., glu - H1), 3,115 (1Н, glu - H2), 3,523 (1Н, т., glu - H3), 3,485 (1Н, glu - H4), 4,413 (2Н, дд., glu - H6). По данным хроматографического (ВЭЖХ/МС) и спектрального (ЯМР) анализа это соединение можно идентифицировать как 20-гидроксиэкдизон-25-р-Э-гликозид [5]. Данное соединение из корней Silene frivaldszkyana было выделено впервые. Ранее экдистероид VIII был обнаружен в Pfaffia iresinoides (Amaranthaceae) [7] и Silene otites (Caryophyllaceae) [8].
26-гидроксиинтегристерон A (IX) в бутанольном экстракте корней Silene frivaldszkyana идентифицирован ВЭЖХ на основании времени удерживания искомого соединения, выделенного из надземной части [3].
он
OH
он
OH
о
'OH
O
VIII
IX
Структуры некоторых экдистероидов, выделенных из корней Silene frivaldszkyana: VIII - 20-гидроксиэкдизон-25-р-Э-глюкозид; IX - 26-гидроксиинтегристерон А
74
Л.Н. Зибарева, О.В. Волкова, С.В. Морозов, Е.И. Черняк
Сравнение состава выделенных экдистероидов из надземной и подземной частей Silene frivaldszky-ana показало, что корни как запасающий орган аккумулируют дополнительно глюкозид 20-гидроксиэкдизона, по всей вероятности, являющийся запасной формой экдистероидов зимой в корнях многолетних растений и предшественником 20-гидроксиэкдизона и всех других экдистероидов в процессе начала биосинтеза весной в листьях и других органах надземной части Silene frivaldszkyana.
Выводы
1. В корнях Silene frivaldszkyana, интродуцированной в Западной Сибири, обнаружено методом ВЭЖХ/МС больше экдистероидов, чем в надземной части.
2. Выделено и идентифицировано из корней Silene frivaldszkyana 9 экдистероидов: 20-гидрокси-экдизон, полиподин В, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 2-дезоксиэкдизон, интегристерон А, 26-гидрокси-полиподин В, 20,26-дигидроксиэвдизон, 20-гидроксиэкдизон-25-р-Б-гликозид, 26-гидроксиинтегристерон А.
Список литературы
1. Зибарева Л.Н, Еремина В.И., Иванова Н.А. Новые экдистероидоносные виды рода Silene L. и динамика содержания вних экдистерона // Растительные ресурсы. 1997. Т. 33, вып. 3. С. 73-76.
2. Zibareva L. Distribution and levels of phytoecdysteroids in plants of genus Silene during development // Archives of insect biochemistry and physiology. 2000. Vol. 43. Pp. 1-8.
3. Zibareva L., Yeriomina V. I., Munkhjargal N., Girault J.-P., Dinan L.,. Lafont R. The Phytoecdysteroid Profiles of 7 Species of Silene (Caryophyllaceae) // Archives of insect biochemistry and physiology. 2009. Vol. 72. N4. Pp. 234-248.
4. Патент № 2445110 (РФ). Способ получения 26-интегристерона А из растительного сырья / Л.Н. Зибарева, О.В. Волкова / 07.12.2010.
5. Ecdybase [Electronic resource]. URL: http://www.ecdybase.org
6. Зибарева Л.Н., Волкова О.В., Лафон Р. Виды рода Silene - продуценты 26-гидроксиэкдистероидов // Теоретическая и прикладная экология. 2012. №1. С. 66-72.
7. Nishimoto N., Shiobara Y., Inoue S., Fujino M. Three ecdysteroid glycosides from Pfaffia iresinoides // Phytochemis-try. 1988. Vol. 27. Pp. 1665-1668.
8. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei K., Lafont R. Isolation and identification of new ecdysteroids from the Caryophyllaceae // J. of Natural Products. 1990. Vol. 53. Pp. 279-293.
Поступило в редакцию 19 июля 2016 г.
®ht03kflhctep0h^m kopheh SlLENE FRIVALDSZKYANA Hampe
75
Zibareva L.N.1*, Volkova O.V.1, Morozov S.V.2, Chernayk E.I.2 PHYTOECDYSTEROIDS OF ROOT SILENE FRIVALDSZKYANA HAMPE
1 Tomsk State University, Siberian Botanical Garden, pr. Lenina, 36, Tomsk, 634050 (Russia),
e-mail: zibareva.lara@yandex.ru
2 Novosibirskij Institute of organic chemistry of SB RAS, pr.Lavrenteva 9, Novosibirsk, 630090 (Russia)
Ecdysteroids were isolated from roots of Silene frivaldszkyana (Caryophyllaceae) introduced into culture in Western Siberia: 20-hydroxyecdysone, polypodine B, integristerone A, 2-deoxy-20-hydroxyecdysone, 2-deoxyecdysone, 20,26-dihydroxyecdysone, 26-hydroxypolypodine B, 26-hydroxyintegristerone A, 20-hydroxyecdysone-25-P-D-glucoside. Structures are installed using NMR, mass spectroscopy, HPLC. The presence of 26-hydroxyintegristerone A in the roots established by comparative HPLC analysis with compound isolated from overground part of plants.
It is shown that this Silene species synthesizes characteristic for this genus of ecdysteroids: 2-deoxy-20-hydroxyecdysone, 2-deoxyecdysone, 20-hydroxyecdysone, polypodine B, integristerone A, and is a rich source of their 26-hydroxy derivatives. Among the common ecdysteroids of the genus Silene 20-hydroxyecdysone-25-P-D-glycoside was isolated for the first from roots of S. frivaldszkyana.
Comparative analysis of ecdysteroids in aboveground and underground parts showed that the roots contain a richer composition of them that is likely so that the roots of perennial plants accumulate these compounds. And 20-hydroxyecdysone-25-P-D-glycoside is a spare substance of major component 20-hydroxyecdysone.
Keywords: Phytoecdysteroids, identification, roots of Silene frivaldszkyana
References
1. Zibareva L.N., Eremina V.I., Ivanova N.A. Rastitel'nye resursy, 1997, vol. 33, no. 3, pp. 73-76. (in Russ.).
2. Zibareva L. Archives of insect biochemistry and physiology, 2000, vol. 43, pp. 1-8.
3. Zibareva L., Yeriomina V. I., Munkhjargal N., Girault J.-P., Dinan L.,. Lafont R. Archives of insect biochemistry and physiology, 2009, vol. 72, no. 4, pp. 234-248.
4. Patent 2445110 (RU). 07.12.2010. (in Russ.).
5. Ecdybase [Electronic resource]. URL: http://www.ecdybase.org
6. Zibareva L.N., Volkova O.V., Lafon R. Teoreticheskaia iprikladnaia ekologiia, 2012, no. 1, pp. 66-72. (in Russ.).
7. Nishimoto N., Shiobara Y., Inoue S., Fujino M. Phytochemistry, 1988, vol. 27, pp. 1665-1668.
8. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei K., Lafont R. J. of Natural Products, 1990, vol. 53, pp. 279-293.
Received July 19, 2016
* Corresponding author.
