CC BY
8
Н. М. Поверенный, В. В. Аникин. Филогенетический анализ скорпионов рода Mesobuthus
Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2023. Т. 23, вып. 3. С. 331-336 Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology, 2023, vol. 23, iss. 3, pp. 331-336
https://ichbe.sgu.ru https://doi.org/10.18500/1816-9775-2023-23-3-331-336, EDN: AREZLW
Научная статья УДК 595.461
Филогенетический анализ скорпионов рода Mesobuthus (Vachon, 1950), обитающих на территории Казахстана, на основании анализа фрагментов митохондриальных и ядерных генов
Н. М. Поверенный н, В. В. Аникин
Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, Россия, 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83
Поверенный Никита Максимович, аспирант кафедры морфологии и экологии животных, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-9958-9342
Аникин Василий Викторович, доктор биологических наук, профессор кафедры морфологии и экологии животных, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-8575-5418
Аннотация. Систематика скорпионов рода Mesobuthus в недавнем прошлом, претерпела ряд существенных корректировок. Изначально на основании особенностей морфологических признаков учёные выделили и описали значительное число подвидов у разных видов этого рода. В последнее десятилетие современные учёные на основе результатов генетических и морфологических анализов «пересмотрели» видовое разнообразие рода и сформировали новые отдельные видовые комплексы. Так, был выделен видовой комплекс - «Mesobuthus caucasicus», который в 2019 г. был восстановлен Франтишеком Коварджик до рода Olivierus. На текущий момент род насчитывает 18 видов, 7 из которых обитают на территории Средней Азии. Ареалы обитания большинства среднеазиатских видов рода Olivierus пересекаются с ареалами обитания видов рода Mesobuthus. В частности, на территории республики Казахстан встречается вид Olivierusgorelovi, чей ареал обитания совпадает с ареалом обитания вида Mesobuthus thersites. Поскольку видовой статус некоторых популяций скорпионов, обитающих на территории республики Казахстан, до сих пор остается неопределённым и слабоизученным, авторами предпринята попытка определить филогенетические связи особей из разных популяций, используя данные полученных результатов молекулярно-генетического баркодинга. Анализ проводился по трём ядерным и одному митохондриальному фрагментам генов у скорпионов, обитающих на территориях Жамбылской, Карагандинской, Атырауской, Туркестанской, Абайской, Алматинской областей. Полученные результаты свидетельствуют, что скорпионы рода Olivierus обитают на территориях Атырауской, Алматинской, Карагандинской и Туркестанской областей, а скорпионы рода Mesobuthus обитают на территориях Жамбылской, Карагандинской и Абайской областей. Данная работа вносит непосредственный вклад в изучение биоразнообразия скорпионофауны Средней Азии. Ключевые слова: фауна, скорпионы, Mesobuthus, Olivierus, протеинкиназа, секвенирование, филогеография, Средняя Азия Благодарности. Авторы выражают благодарность Сергею Вячеславовичу Малярову (г. Темиртау, Республика Казахстан) за возможность использовать собранный материал для исследования.
Для цитирования: Поверенный Н. М., Аникин В. В. Филогенетический анализ скорпионов рода Mesobuthus (Vachon, 1950), обитающих на территории Казахстана, на основании анализа фрагментов митохондриальных и ядерных генов // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2023. Т. 23, вып. 3. С. 331-336. https://doi.org/10.18500/1816-9775-2023-23-3-331-336, EDN: AREZLW
Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0) Article
Phylogenetic analysis of scorpions of the genus Mesobuthus (Vachon, 1950), inhabiting the territory of Kazakhstan, based on the analysis of fragments of mitochondrial and nuclear genes.
N. M. Poverenniy H, V. V. Anikin
Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia
Nikita M. Poverenniy, [email protected], https://orcid.org/0000- 0001-9958-9342 Vasily V. Anikin, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-8575-5418
Abstract. The taxonomy of scorpions belonging to the genus Mesobuthus has undergone significant revisions in recent times. Initially, based on the morphological characteristics, scientists identified and described a considerable number of subspecies within different species of this
genus. However, in the last decade, modern researchers have "revised" the species diversity of the genus based on the results of genetic and morphological analyses, forming new separate species complexes. As a result, a species complex called "Mesobuthus caucasicus" was identified, which was later reassigned to the genus Olivierus by Frantisek Kovarfk in 2019. Currently, the genus Olivierus comprises 18 species, with 7 of them inhabiting the territory of Central Asia. The distribution ranges of most Central Asian species of the genus Olivierus overlap with those of the genus Mesobuthus. Specifically, in the territory of the Republic of Kazakhstan, the species Olivierusgorelovi occurs, whose distribution range coincides with that of Mesobuthus thersites. Due to this overlap, the taxonomic status of some scorpion populations inhabiting the territory of the Republic of Kazakhstan remains uncertain and poorly studied. The authors of this study attempted to determine the phylogenetic relationships among individuals from different populations using data obtained from molecular genetic barcoding. The analysis was conducted on three nuclear and one mitochondrial gene fragments of scorpions inhabiting the regions of Zhambyl, Karaganda, Atyrau, Turkestan, Abay, and Almaty. The obtained results indicate that scorpions of the genus Olivierus inhabit the territories of Atyrau, Almaty, Karaganda, and Turkestan regions, while scorpions of the genus Mesobuthus inhabit the territories of Zhambyl, Karaganda, and Abay regions. This study makes a direct contribution to the study of scorpion fauna biodiversity in Central Asia. Key words: Mesobuthus, protein kinase, sequencing, Olivierus, scorpion
Acknowledgements. The authors are grateful to Sergey V. Malyarov (the city of Temirtau, Kazakhstan) for the opportunity to collect the material used for the study.
For citation: Poverenniy N. M., Anikin V. V. Phylogenetic analysis of scorpions of the genus Mesobuthus (Vachon, 1950), inhabiting the territory of Kazakhstan, based on the analysis of fragments of mitochondrial and nuclear genes. Izvestiya of Saratov University. Chemistry. Biology. Ecology, 2023, vol. 23, iss. 3, pp. 331-336 (in Russian). https://doi.org/10.18500/1816-9775-2023-23-3-331-336, EDN: AREZLW This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC-BY 4.0)
Введение
Род МезоЪиИиз был недавно пересмотрен и на данный момент насчитывает 29 видов [1]. Центром видового разнообразия скорпионов рода МезоЪиИиз является территория Ирана. В Средней Азии обитают всего семь видов из этого рода, но эти виды широко распространены в регионе. В Казахстане массово распространен вид МезоЪиИиз ИтзИез. Недавние молекулярно-генетические данные авторов продемонстрировали, что сборы из Казахстана относились исключительно к этому виду, но в анализ не были введены последовательности фрагментов генов скорпионов рода 01Мегиз [2]. Недавние научные таксономические события, а именно восстановление рода 0И^1егиз [3] и выделение трёх новых видов из Узбекистана и Казахстана этого рода [4], актуализировали использование данных молекулярно-гене-тического анализа по видам данного рода. Были привнесены в анализ расшифрованные нуклеиновые последовательности представителей скорпионов рода 0И^1егиз при исследовании результатов баркодинга скорпионов рода МезоЪмИиз. Известно, что в южной части Казахстана обитают скорпионы вида 0И^1егиз доге1оу\, ареал которых совпадает с ареалом вида МезоЪиИиз Легзкез [1]. В связи с этим целью работы было проведение филогенетического анализа различных таксонов скорпионов по современным образцам (сборам) из различных мест обитания на территории Казахстана (Жамбылской, Карагандинской, Атырауской,
Туркестанской, Абайской и Алматинской областях) с определением таксономического статуса скорпионов из этих регионов республики.
Материалы и методы
Сбор скорпионов проводился с июня по август 2020-2021 гг. Коллектирование скорпионов было произведено на территориях в окрестностях села Шокай (Жамбылская область), посёлка Доссор (Атырауская область), города Саптаев, города Балхаш (Карагандинская область), береговой линии озера Алаколь (Абайская область), берега Шардаринского водохранилища (Туркестанская область), города Капчагай (ныне Конаев) (Алматинская область) (рис. 1).
Выполнение работ по пробоподготовке материала, выделение ДНК, амплификация, секвенирование и анализ полученных данных осуществлялся на базе учебно-молекулярной лаборатории биологического факультета и кафедре морфологии и экологии животных Саратовского национального исследовательского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского.
Результаты и их обсуждение
Для проведения молекулярно-генетических исследований был взят митохондриальный ген цитохром-ц-оксидазы первый субъединицы (COI) [6,7], а также ядерные гены: тиоредок-син-1 (Trxrl), дефенсин (4kD) и протеинкиназа [8]. Для амплификации и секвенирования были выбраны специфичные праймеры:
Рис. 1. Места сбора скорпионов, обитающих на территории Казахстана. Чёрными точками отмечены места сборов: 1 - село Шокай (Жамбылская область), 2 - посёлок Доссор (Атырауская область), 3 - окрестности города Саптаев (Карагандинская область), 4 - озёра Алаколь (Абайская область), 5 - Балхаш (Карагандинская область), 6 - берег Шардаринского водохранилища (Туркестанская область), 7 - окрестности города Капчагай (ныне Конаев) (Алма-
тинская область) [5]
Fig. 1. Places of collection of scorpions living on the territory of Kazakhstan. Black dots mark collection sites: 1 - Shokai village (Zhambyl region), 2 - Dossor village (Atyrau region), 3 - neighborhood of the city of Saptaev (Karaganda region), 4 - Alakol lakes (Abai region), 5 - Balkhash (Karaganda region), 6 - shore of the Shardara reservoir. (Turkestan region), 7 - neighborhood of the city of Kapchagay (now Konaev) (Almaty region) [5]
Цитохром-ц-оксидаза 1 субъединица:
5'-GGTCAACAAATCATCATAAAGATATTGG-3',
5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3';
протеинкиназа: 5'-TCTGATGTATGGCAGATGGCAATG-3',
5'-CGAACTCAAGATCCACTCCTGTACTCG-3';
дефенсин: 5'-GCCATGAAAGCCGTTGCTATTCT-3'
5'-ACGACACAAATACAGGTGA-3';
тиоредоксин-1: 5'-TAACTTGACCATTTACCTAGAATGTCAC-3' 5'-CATGTACTGACGCTGGCATTGCC-3'.
Для нашего исследования ДНК была выделена из заднебрюшья скорпионов, в некоторых случаях использовалось переднебрьюшье, но без многолопастной печени, так как она токсична и может повлиять на выход чистой ДНК. ДНК была выделена с помощью набора DNA mini kit (Qiagen, США). Размер ДНК оценивался с помощью метода гель-электрофореза. Для окрашивания ДНК использовался 6-кратный DNA Gel Loading Dye (Thermo Fisher Scientific, США). Для постановки использовался 1% агарозный гель, однократный трис-боратный буфер. Напряжение составляло 120 В, для сравнительной оценки использовался маркер GenRuler 100bp plus. Процедуру проводили в течение 15 мин. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали следующий амплификацион-ный профиль: 1-й шаг - 1 мин 96°С (1 шаг -
цикл), 2-й шаг - 20 с 96°С, 3-й шаг - 30 с 64°С, 4-й шаг - 40 с 72°С (2-4-е шаги - 24 цикла).
В реакцию было добавлено: 6 мкл 10-кратного Tersus-буфера, 1 мкл Tersus-полимеразы, 0,5 мкл 50-кратной смеси dNTP, 5 п/моль каждого праймера и 50 нг ДНК. Реакция по Сэнгеру, очистка ее продуктов и секвенирование проводилось по соответствующим протоколам.
Филогенетическое древо построено с использованием модели максимального правдоподобия, модель Джукса-Кантора использовалась в качестве модели замещения [9]. Для того чтобы оценить генетическое расхождение между образцами, мы применили метод bootstrap с использованием 2000 репликаций. Для построения дендрограммы использовали программный пакет Mega X. Выравнивание расшифрованных нуклеотидных последовательностей выполнено вручную.
Для анализа, кроме наших собственных образцов из Казахстана, были введены последовательности из базы данных NCBI. Использовались последовательности скорпионов МезоЪиИиз еиреиз и 0И^1егиз доге1о^1, обитающих на территории Туркменистана, Узбекистана, Казахстана. Кроме того, в анализ были
введены последовательности, полученные в ходе работы авторов по определению видового статуса популяций скорпионов из Нижнего Поволжья (Саратовская, Волгоградская, Астраханская области) [2]. Полученные результаты по разным генам представлены на кладограммах I и II (рис. 2).
I
г: £
■gorelovi VF3012TUR GANGALY ■gorelovi VF3018TUR CHAGALY -gorelovi VF3021 TUR EROILANDUZ -gorelovi VF3017TUR KEPELYA -gorelovi VF3010 TUR KAZARMA -gorelovi TUk2 TUR GEKDEPE ■gorelovi VF3014 TUR ZAKHMET •gorelovi VF3023 TUR REPETEK •gorelovi VF3Q31 UZB NAVUMETAN •gorelovi VF3034 UZB MUBAREK •gorelovi VF3022 TUR OKTYABRSKII ■gorelovi UZj1 UZB BESHARYK goreloviUZe2 UZB BESHARYK gorelovi VF3006 KAZ CHARDARA goreloviVF3030 UZB KOKUSHTUVAIS goreloviUZd UZBYAZYAVAN 2_Dossor_Aty_KZ 7_Kapchgay__Alm_KZ
100 1-gorelovi VF30Q7 KAZ KHANTAU
gorelovi VF30Q5 KAZ BALKHASH thersites isolate Me 1035 thersites isolate Me 1032 thersites isolate Me 1040 thersites isolate Me 1039 thersites isolate Me 1033 gorelovi VF 3020 TUR SERKETABAD 1 ShokayZhaKZ Mesobuthus volgensis Volgograd 11 Mesobuthus volgerisis Saratov Mesobuthus volgensis Volgograd 8 Mesobuthus volgensis Volgograd 7 Mesobuthus volgensis Saratov 3 Mesobuthus volgensis astrahan
-C
а I-q
ej-*
I-h
Olivierus gorelovi
Mesobuthus thersites
II
2_Dossor_ATY_KZ_4 7_Kapchgay_ALM _KZ_9 5_Belhash_KAR_KZ_7 6_S h a rd a r y_T U R_K Z_3 3_Zhezkazgan_ULY_KZ_5 1_Shokay_ZHA_KZ_3 4_Alakol_ABA_KZ_6 MgiPlb
Olivierus gorelovi
Mesobuthus thersites
Рис. 2. Дендрограммы, построенные на основе анализа расшифрованных ну-клеотидных последовательностей фрагментов генов: COI (I), дефенсина, про-теинкиназы и тиоредоксина (II) скорпионов, обитающих в Нижнем Поволжье (Саратовская, Волгоградская, Астраханская области), а также Туркменистана,
Узбекистана, Казахстана Fig. 2. Dendrograms built on the basis of the analysis of the decoded nucleotide sequences of gene fragments: COI (I), defensin, protein kinase and thioredoxin (II) of scorpions living in the Lower Volga region (Saratov, Volgograd, Astrakhan regions), as well as Turkmenistan, Uzbekistan, Kazakhstan
Н. М. Поверенный, В. В. Аникин. Филогенетический анализ скорпионов рода Mesobuthus
Первичный анализ фрагментов генов COI показал наличие двух кластеров, первый из которых включает в себя 2 клады, одна из которых состоит из сборной группы туркменских, узбекских и казахских популяций. Вторая клада включает в себя сиквенсы наших образцов из Казахстана (Доссор (Атырауская область), Капчагай (ныне Конаев) (Алматинская область)) и образцов казахско-узбекских популяций Olivierus gorelovi. Второй кластер также представлен двумя кладами. Первая состоит в большинстве из казахских популяций Mesobuthus thersites. Вторая клада представлена сиквен-сами скорпионов Саратовской, Волгоградской и Астраханской областей. Внутри клады, но отдельной ветвью, обособленно находится образец, собранный в окрестностях села Шокай (Жамбылская область).
Вторичный анализ, основанный на сравнении комплекса ядерных генов (дефенсин, тиоредоксин-1, протеинкиназа), показал наличие двух кластеров. Первый кластер состоит из представителей скорпионов Атырауской, Алматинской, Карагандинской, Туркестанской областей. Второй кластер представлен сборной группой представителей популяций Жамбыл-ской, Карагандинской, Абайской областей.
Заключение
Исходя из полученных данных по первичному анализу, можно предположить, что скорпионы, обитающие на территориях Аты-рауской и Алматинской области, относятся к виду Olivierus gorelovi. Также следует, что скорпионы, обитающие на территории села Шокай Жамбылской области относятся к роду Mesobuthus, а именно, вероятнее всего, являются близкородственными к узбекским популяциям скорпионов вида Mesobuthus barszczevskii. Близ-кородственность между этими узбекскими и нижневолжскими популяциями была установлена в недавней ревизии рода [1]. Вторичный анализ данных по комплексу ядерных генов частично подтверждает полученные результаты по гену COI, что скорпионы Olivierus gorelovi обитают на территориях в окрестностях посёлка Доссор (Атырауская область), города Капчагай (ныне Конаев) (Алматинская область), города Балхаш (Карагандинская область), береговой линии Шардаринского водохранилища (Туркестанская область). Скорпионы, обитающие на территориях в окрестностях села Шокай (Жамбылская область), города Саптаев (Кара-
гандинская область), озера Алаколь (Абайская область), относятся к виду Mesobuthus thersites. Таким образом, благодаря полученным результатам удалось установить таксономический статус скорпионов из разных популяций, обитающих в схожих ландшафтах и биотопах Казахстана, и ответить на вопрос о присутствии близкородственных видов скорпионофауны в данном регионе.
Список литературы
1. Kovarik F., Fet V., Gantenbein B., Graham M. R., Yagmur E. A., St'ahlavsky F., Poverennyi N. M., Novruzov N. E. A revision of the genus Mesobuthus Vachon, 1950, with a description of 14 new species (Scorpiones: Buthidae) // Euscorpius. 2022. № 348. P. 1-189.
2. Поверенный Н. М., Аникин В. В. Филогенетические связи скорпиона Mesobutus eupeus volgensis (Birula, 1925) из Нижнего Поволжья с близкородственными видами скорпионов Центральной Азии на основе анализа ДНК по гену COI // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. 2020. Вып. 17. С. 12-16.
3. Kovarik F. Taxonomic reassessment of the genera Lychas, Mesobuthus, and Olivierus, with descriptions of four new genera (Scorpiones: Buthidae) // Euscorpius. 2019. № 288. P. 1-27.
4. Fet V., Kovarik F., Gantenbein B., Graham M. R. Three new species of Olivierus (Scorpiones: Buthidae) from Kazakhstan and Uzbekistan // Zootaxa. 2021. Vol. 5006, № 1:29 Jul. P. 54-72. https://doi.org/10.11646/ ZOOTAXA.5006.1.9
5. Карта - Сервис Google Планета Земля. URL: https:// www.google.ru/intl/ru/earth/ (дата обращения: 27.05.23).
6. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial Cytochrome C oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates // Molecular Marine Biology and Biotechnology. 1994. Vol. 3, № 5. Р. 294-299.
7. Raharimalala F. N., Ravaomanarivo L. H., Ravelonan-dro P., Rafarasoa L. S., Zouache K., Tran-Van V. Biogeography of the two major arbovirus mosquito vectors, Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera, Culicidae), in Madagascar // Parasites and Vectors. 2012. № 5. Article number 56. P. 5-10. https://doi. org/10.1186/1756-3305-5-56
8. Gantenbein B., Keightley P. D. Rates of molecular evolution in nuclear genes of east Mediterranean scorpions // Evolution. 2004. Vol. 58, iss. 11. P. 2490. PMID: 15612292.
9. Chor B., Tuller T. Maximum likelihood of evolutionary trees: Hardness and approximation // Bioinformat-ics. 2005. Vol. 21. Suppl. 1. P. i97-i106. https://doi. org/10.1093/bioinformatics/bti1027
References
1. Kova rik F., Fet V., Gantenbein B., Graham M. R., Ya gmur E. A., Stahlavsky F., Poverennyi N. M., Novru-zov N. E. A revision of the genus Mesobuthus Vachon, 1950, with a description of 14 new species (Scorpiones: Buthidae). Euscorpius, 2022, no. 348, pp. 1-189.
2. Poverenniy N. M., Anikin V. V. The phylogenetic relations of scorpio - Mesobutus eupeus volgensis (Birula, 1925) from the Lower Volga Region with closely related species from Central Asia on the base of DNA analysis by gene COI. Entomological andparasitological investigations in Volga Region, 2020, iss. 17, pp. 12-16 (in Russian).
3. Kovarik F. Taxonomic reassessment of the genera Ly-chas, Mesobuthus, and Olivierus, with descriptions of four new genera (Scorpiones: Buthidae). Euscorpius, 2019, no. 288, pp. 1-27.
4. Fet V., Kovarik F., Gantenbein B., Graham M. R. Three new species of Olivierus (Scorpiones: Buthidae) from Kazakhstan and Uzbekistan. Zootaxa, 2021, vol. 5006, no. 1:29 Jul., pp. 54-72. https://doi.org/ 10.11646/Z00TAXA.5006.1.9
5. Karta - Servis Google Planeta Zemlja (Map - Google Earth Service). Available at: https://www.google.ru/intl/ ru/earth/ (accessed May 27, 2023).
6. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial Cytochrome C oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1994, vol. 3, no. 5, pp. 294-299.
7. Raharimalala F. N., Ravaomanarivo L. H., Ravelonan-dro P., Rafarasoa L. S., Zouache K., Tran-Van V. Bioge-ography of the two major arbovirus mosquito vectors, Aedes aegypti and Aedes albopictus (Diptera, Culicidae), in Madagascar. Parasites and Vectors, 2012, no. 5, article no. 56, pp. 5-10. https://doi.org/10.1186/1756-3305-5-56
8. Gantenbein B., Keightley P. D. Rates of molecular evolution in nuclear genes of east Mediterranean scorpions. Evolution, 2004, vol. 58, iss. 11, pp. 2490, PMID: 15612292.
9. Chor B., Tuller T. Maximum likelihood of evolutionary trees: Hardness and approximation. Bioinforma-tics, 2005, vol. 21, suppl. 1, pp. i97-i106. https://doi. org/10.1093/bioinformatics/bti1027
Поступила в редакцию 13.05.2023; одобрена после рецензирования 14.05.2023; принята к публикации 20.05.2023 The article was submitted 13.05.2023; approved after reviewing 14.05.2023; accepted for publication 20.05.2023
