CC BY
56
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ ВИРУСОВ МОСКИТНЫХ ЛИХОРАДОК, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ АФГАНИСТАНА
И.С. Клименко, Н.В. Хуторецкая
ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН ул. Гамалеи, 16, Москва, Россия, 123098
Т.В. Гребенникова
Медицинский факультет Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, Россия, 117198
Проведено молекулярно-генетическое исследование штаммов вирусов москитных лихорадок, выделенных на территории Афганистана в 1986—1987 гг. С помощью универсальных праймеров была проведена ОТ-ПЦР и секвенирование фрагментов S сегмента генома изучаемых вирусов. Полученные нуклеотидные последовательности длиной 379 н.о. были использованы для филогенетического анализа афганских штаммов. Установлено, что афганский штамм Аф-1008 является представителем неаполитанского серокомплекса, а штамм Аф-1028 — сицилийского.
Вирусы москитных лихорадок (МЛ), относящиеся к роду Phlebovirus (Bunya-viridae), были впервые выделены А.В. Sabin из крови больных в период эпидемии среди американских солдат в 1943—1944 гг. в Италии: вирус сицилийской москитной лихорадки (СМЛ) — в Палермо (Сицилия), вирус неаполитанской москитной лихорадки (НМЛ) — в Неаполе [6]. Вирусы МЛ вызывают заболевания человека с клиническими синдромами, варьирующими от классической лихорадки до менингоэнцефалита [1, 2]. Вирусы в Старом свете циркулируют в пределах обитания москитов, среди которых основными переносчиками являются Phlebo-tomus papatasii. Это территория Восточного полушария между 20 и 40 градусами с.ш.: Азия (Иран, Узбекистан, Таджикистан, Туркменистан), Восточная Европа (Югославия, Молдавия, Израиль, юг европейской части России и Украины), средиземноморские страны (Африка, Южная Европа) [1, 7, 6].
В мае—августе 1986—1987 гг. во время военных действий в Афганистане от советских военнослужащих с признаками лихорадки были выделены новые штаммы вирусов москитных лихорадок, представленные, согласно серологическим данным, вариантом неаполитанского серокомплекса (Аф-1008) и сицилийского серокомплекса (Аф-1028) [10].
Геном флебовирусов состоит из трех кольцевых одноцепочечных сегментов РНК отрицательной полярности (большой L, средний М и малый S), каждый из которых ответственен за синтез определенных вирусных белков. В течение последних лет определены полноразмерные нуклеотидные последовательности или участки сегментов генома флебовирусов, на основе которых проводится филогенетический анализ [3].
Цель настоящего исследования — проведение филогенетического анализа штаммов вирусов МЛ из коллекции лаборатории биологии и индикации арбови-русов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, выделенных на территории Афганистана, на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов S-сегмента генома, полученных методом ОТ-ПЦР.
Материалы и методы. В работе использовались штаммы вирусов москитных лихорадок из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (табл. 1). Все вирусы пассировались на двухдневных мышах-сосунках.
Таблица 1
Штаммы вирусов москитных лихорадок, используемые в работе
Серокомплекс Штамм Место выделения Источник выделения Год выделения
Неаполитанская москитная лихорадка Sabin Неаполь, Италия человек 1944
1008 Афганистан человек 1986—1987
Сицилийская москитная лихорадка Sabin Сицилия, Италия человек 1943
1028 Афганистан человек 1986—1987
Тоскана ISS Phl 3 Тоскана, Италия Phlebotomus perniciosus 1971
Каримабад !-58 R-12928 Каримабад, Иран Phlebotomus papatasi 1972
Выделение вирусной РНК из 10% мозговой суспензии мышей-сосунков проводили с использованием «Тризола» (Trizol Reagent, Life Technology, США) по методике производителя. Мозговые суспензии получали путем внутримозгового заражения двухдневных мышей-сосунков.
Конструирование праймеров. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности S-сегмента генома вирусов МЛ, представленные в базе данных NCBI GenBank, были выровнены с помощью программы CLUSTAL W. Последовательности специфических олигонуклеотидов разрабатывали в программе DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США) на основе усредненной последовательности S-сегмента вирусов МЛ (табл. 2).
ОТ-ПЦР и секвенирование. ОТ-ПЦР на матрице РНК вирусов МЛ проводили в конечном объеме 65 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл нуклеиновых кислот, 2 мкл каждого праймера, 2,5 мкл dNTP, 0,25 мкл Taq-полимеразы, 0,125 мкл MMLV-ревертазы, 4 мкл буфера для ПЦР и 11,125 мкл DEPC-воды. Реакцию проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для проведения ОТ-ПЦР использовали следующие температурные режимы: 50° — 30 мин., 94° — 5 мин. и 35 циклов амплификации: 94° — 30 сек., 57° — 30 сек., 72° — 30 сек.
Таблица 2
Праймеры, использованные для проведения ОТ-ПЦР фрагментов S-сегмента генома вирусов москитных лихорадок
Праймер Назначение Длина (н.о.) Нуклеотидная последовательность 5'—3'
Unique FS ПЦР, секвенирование 20 GCGAAGCTAGGGTGCATCAT
Unique R_S ПЦР, секвенирование 20 TTTGCTTACCAGGGGTTTGA
Анализ фрагментов ДНК после ПЦР проводили методом электрофореза в ага-розном геле (2%). Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор, в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.
Праймеры для секвенирования были те же, что и для ОТ-ПЦР. Определение первичной нуклеотидной последовательности осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.
Филогенетический анализ. Полученные последовательности штаммов, указанных в табл. 1, использовались в BLASTX программы DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США) для поиска гомологичных последовательностей в GenBank. Все нукле-отидные последовательности амплифицированных штаммов вирусов и доступные последовательности из GenBank были выровнены с помощью CLUSTAL W в программе DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетической дендрограммы осуществляли на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М.Кимуры в программе MEGA 3.1.
Результаты. Для конструирования праймеров последовательности S-сегмента флебовирусов (СМЛ, НМЛ, Тоскана и Каримабад), представленные в базе данных NCBI GenBank, были выровнены, как описано выше. На усредненной нук-леотидной и аминокислотной последовательностях были определены наиболее консервативные участки для расположения специфических олигонуклеотидов. Выбранные нами праймеры Unique F_S и Unique R_S амплифицировали все используемые в работе штаммы вирусов МЛ, указанных в табл. 1. Методом ОТ-ПЦР получили фрагменты S-сегмента генома изучаемых нами штаммов длиной 379 н.о. Определили их первичную нуклеотидную последовательность.
Далее был выполнен филогенетический анализ полученных последовательностей фрагмента S-сегмента генома исследуемых штаммов в сравнении с ранее опубликованными последовательностями флебовирусов.
На рис. 1 показана филогенетическая дендрограмма. Исследуемые штаммы четко разделились на две группы, обозначенные на рисунке цифрами I и II и соответствующие неаполитанскому и сицилийскому серокомплексу. Вирус Карима-бад, как видно из рис. 1, не был включен ни в одну из них. Афганский штамм Аф-1008 вошел в состав группы I, а Аф-1028 — группы II.
Обсуждение. L, M и S сегменты генома флебовирусов играют различную роль в вирусном патогенезе. РНК малого сегмента проявляет двойную кодирующую стратегию и содержит две открытые рамки считывания.
Одна из них кодирует нуклеокапсидный белок N, а другая — неструктурный белок NSs [5]. Известно, что N белок проявляет комплементсвязывающую активность [10]. Согласно большинству недавних исследований, S-сегмент флебовирусов наиболее консервативен по сравнению с М-сегментом генома [4, 8]. Имеющиеся в коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского афганские штаммы вирусов МЛ (1008 и 1028) были охарактеризованы лишь серологически. На основании результатов серологической идентификации в РСК в составе серокомплекса НМЛ были выделены три антигенные группы: 1 — вирусы НМЛ, Тоскана и Тегеран, 2 — афганские штаммы
Аф-130, Аф-1038, Аф-1008. Вирус Каримабад оказался по данным этого теста полностью изолированным от серокомплекса. Афганские штаммы Аф-83 и Аф-1028 по результатам исследований оказались идентичными друг другу и прототипному штамму СМЛ. В то же время они не вступали в перекрестные взаимодействия с представителями неаполитанского серокомплекса [9, 10]. Для того, чтобы дать генетическую характеристику штаммам Аф-1008 и Аф-1028, мы решили амплифи-цировать, а затем секвенировать участок S-сегмента генома этих вирусов. Мы попытались найти универсальную пару праймеров, которая амплифицировала один и тот же участок сегмента у нескольких вирусов. Как видно из рис. 1, распределение изучаемых вирусов четко соответствует их серологической группировке. Группу I составили вирусы неаполитанского серокомплекса, который разделился на две ветки: вирус нмл^ып) и НМЛ-подобные вирусы, вирус Тоскана и Тоскана-подобные вирусы. Группу II образовали вирус СМЛ и его различные штаммы. Вирус Каримабад оказался обособлен от вышеперечисленных групп.
Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма вирусов москитных лихорадок на основе участка S-сегмента длиной 379 н.о.
Штаммы, обозначенные «коллекция», были секвенированы нами. Последовательности остальных штаммов, указанных в дендрограмме, были взяты из NCBI GenBank
Нуклеотидная последовательность участка S сегмента прототипного штамма НМЛ, секвенированного нами, оказалась идентичной (100%) таковой, опубликованной в базе данных GenBank. То же можно сказать и про прототипный штамм вируса Тоскана (100%). Афганский штамм Аф-1008 вошел в состав неаполитанского серокомплекса, а наиболее близким ему оказался штамм НМЛ индийского происхождения (Р-7101795) — 93%.
Исследуемый нами афганский штамм Аф-1028, согласно полученным данным, относится к сицилийскому серокомплексу. Причем наиболее близким ему филогенетически оказался индийский штамм СМЛ (I 701735) — 97%.
Таким образом, нами впервые секвенированы афганские штаммы вирусов неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок и были установлены данные о систематическом положении изученных штаммов вирусов внутри антигенной группы.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Bartelloni P.J., Tesh R.B. Clinical and serological responses of volunteers infected with phle-botomus fever virus (Sicilian type) // Am. J. Med. Hyg. — 1976. — N 25. — P. 456—462.
[2] Braito A., Ciufolini M.G., Pippi L., Corbisiero R., Fiorentini C., Gistri A., Toscano L. Phle-botomus-transmitted Toscana virus infection of the central nervous system: a seven-year experience in Tuscany // Scand. J. Infect. Dis. — 1998. — N 30. — P. 505—508.
[3] Giorgi C., AccardiL., Nicoleti L., Gro M.C., Takehara K., Hilditch C., Morikawa S., Bishop D.H. Sequences ahd coding strategies of the S RNAs of Toscana and Rift Valley fever viruses compared to those of Punta Toro, Sicilian Sandfly fever, and Uukuniemi viruses // Virology. — 1991. — N 180. — P. 738—753.
[4] Liu D.Y., Tesh R.B., Travassos Da Rosa A.P., Peters C.J., Yang Z., Guzman H., Xiao S.Y. Phy-logenetic relationships among members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae) based on partial M segment sequence analyses // J. Gen. Virol. — 2003. — N 84. — P. 465—473.
[5] Nichol S.T., Beaty B.J., Elliot R.M., Goldbach R., Plyusnin A., Schmaljohn C.S., Tesh R.B. Genus Phlebovirus. In Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. — 2005 — P. 709—711.
[6] Tesh R.B., Saidi S., Gajdamovich S.J., Rodhain F., Vesenjak-Hirjan J. Serological studies on the epidemiology of sandfly fever in the Old World // Bull WHO. — N 54. — P. 663—674.
[7] Vesenjak-Hirjan J., Punda-Polic V., Dobe M. Goegraphical distribution of arboviruses in Yugoslavia // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. — 1991. — Vol. 35. — N 2. — P. 129—140.
[8] Xu F., Chen H., Travassos da Rosa A.P., Tesh R.B., Xiao S.Y. Phylogenetic relationships among sandfly fever group viruses (Phlebovirus: Bunyaviridae) based on the small genome segment // J. Gen. Virol. — 2007. — N 88. — P. 2312—2319.
[9] Белан Э.Б. Биологические и антигенные свойства штаммов вирусов сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок, выделенных в Афганистане в 1986—1987 гг.: Диса ... канд. мед. наук. — М., 1994.
[10] Гайдамович С.Я., Хуторецкая Н.В., Мельникова Е.Е. и др. Вирусологическое исследование случаев москитных лихорадок в Афганистане // Вопросы вирусологии. — 1990. — N 35(1). — C. 45—47.
PHYLOGENETIC ANALYSES OF THE STRAINS OF SANDFLY FEVER VIRUSES ISOLATED IN AFGHANISTAN
I.S. Klimenko, N.V. Khutoreckaya
D.I. Ivanovsky Institute of virology, RAMSci, Gamaleya str., 16, Moscow, Russia, 123098
T.V. Grebennikova
Medical faculty Peoples' Friendship University of Russia
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
Molecular-biological examination of the strains of sandfly fever viruses isolated in Afghanistan in 1986—1987 years was carried out. It was make by RT-PCR and sequenation of fragment of S-segment of genome studied viruses with universal primers. Received nucleotide sequences of the length 379 p.n. have been used for phylogenetic analyses Afghanistan strains. It was established that Afghanistan strain Af-1008 is member of Naples serogroup and strain Af-1028 is member of Sicilian serogroup.
ФАКТИЧЕСКОЕ ПИТАНИЕ КОРЕННОГО МАЛОЧИСЛЕННОГО НАСЕЛЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ САХА (ЯКУТИЯ)
Т.М. Климова, М.Е. Балтахинова, В.И. Федорова, В.Г. Кривошапкин
ФГНУ «Институт здоровья» Сергеляхское шоссе 4 км, корпус С-2, Якутск, Россия, 67010
Изучение среднесуточного потребления белков, жиров, углеводов, основных минеральных веществ и витаминов среди коренного малочисленного населения Республики Саха (Якутия). Эпидемиологическое исследование проведено среди населения 3 районов Республики Саха (Якутия), в местах компактного проживания коренных малочисленных народов. Исследование фактического питания проведено методом 24-часового воспроизведения. В исследовании приняли участие 696 человек в возрасте 20—79 лет (отклик 85%).
Результаты исследования и выводы. Выявлена несбалансированность рациона питания: избыточное потребление простых углеводов, глубокий дефицит минеральных веществ и витаминов.
Ключевые слова: питание, витамины, минеральные вещества.
