CC BY
25УДК 623.459+577.15
Ферменты в технологии уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ
Е. Н. Ефременко, И. В. Лягин, В. В. Завьялов, С. Д. Варфоломеев, Н. В. Завьялова, В. И. Холстов
МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ФГУ «27 Научный центр Министерства обороны РФ» Федеральное агентство по промышленности
Для утилизации реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), одним из наиболее привлекательных представляется биотехнологический подход, основанный на применении ферментных технологий [1, 2]. Данный подход позволяет нейтрализовать остаточные концентрации ФОВ в составе реакционных масс, не требует использования высоких температур, избыточного давления, щелочной среды.
В результате поиска источников выделения ферментов, активных по отношению к ФОВ [3, 4] и пригодных с точки зрения возможности масштабирования их производства, выбор был остановлен на органо-фосфатгидролазе (ЕС 3.1.8.1) [5]. Этот фермент характеризуется широкой субстратной специфичностью и является единственным из всех известных ферментов, способным гидролизовать вещество типа Ух наряду с зарином, зоманом и другими субстратами, содержащими Р—Р связь.
Органофосфатгидролаза может найти применение на разных этапах работ по уничтожению ФОВ: для гидролиза остаточных ФОВ в составе реакционных масс и снижения уровня их токсичности; в составе индивидуальных самодегазирующихся средств защиты от воздействия ФОВ; в составе препаратов и средств, предназначенных для дегазации технического инвентаря, оборудования и помещений; как активный компонент биосенсорных систем для определения низких концентраций ФОВ.
Подходы к получению активной формы органофосфатгидролазы
Внедрение этого фермента в практику связано с решением двух основных проблем: с разработкой высокопродуктивных систем экспрессии гена, кодирующего синтез фермента, и с созданием основ технологии получения органофосфатгидролазы в активной растворимой форме.
Использование клеток бактерий Е.соН для экспрессии гена органофосфатгидролазы, выделенного из различных микробных источников, позволяет получать высокоактивный фермент с выходом целевого белка, существенно превышающим уровень его накопления в природных штаммах [6—8]. При этом реком-бинантный фермент проявляет каталитическую активность по отношению к различным ФОВ.
Помимо решения задачи получения суперпродуцентов рекомбинантной органофосфатгидролазы пред-
принимались попытки с помощью методов генной инженерии улучшить субстратную специфичность фермента по отношению к ФОВ. Наибольшего успеха здесь достигли американские исследователи [9]. Так, путем сайт-направленного мутагенеза активного центра фермента двойной заменой Н25411 и Н257Ь удалось повысить эффективность его действия по отношению к деметону С (прямому аналогу Ух) более, чем в 6,5 раз. Вместе с тем подобная замена привела к снижению эффективности действия фермента по отношению к диизопропилфторфосфату (ДФФ) (аналогу зарина и зомана) в 115 раз. Таким образом, положительные эффекты генетических манипуляций в отношении одного субстрата компенсировались отрицательными результатами в отношении других Р-Г-ео-держащих субстратов.
В другом случае удалось осуществить более удачную генетическую замену Ь136У [10], при которой эффективность действия фермента к деметону С увеличилась в 2,5 раза, а по отношению к ДФФ наблюдалось лишь ее незначительное снижение (на 4%) от исходного уровня. В этой же работе исследователи столкнулись с тем фактом, что результаты исследований с использованием аналогов ФОВ не дают адекватного ответа. Несмотря на выдающийся результат в отношении деметона С, улучшение каталитических характеристик фермента по отношению к веществу Ух составило всего 33%. Таким образом, можно заключить, что нет прямой зависимости между результатами, полученными при исследовании гидролиза ФОВ и их структурных аналогов, поэтому необходимо проводить исследования с применением реальных отравляющих веществ.
Наряду с генетическими манипуляциями путем сайт-направленного мутагенеза, популярность приобрел другой подход к модификации фермента, основанный на генетическом введении на Ы- или С-конец молекулы белка дополнительной аминокислотной последовательности. Этот подход позволяет, с одной стороны, упростить процедуру очистки фермента [11], а с другой — придать ферменту новые свойства, например, возможность визуализации белка при введении в его структуру гибридного партнера, обладающего флуоресценцией [12] или гидрофобностью [13]. Так, при введении гексагистидиновой последовательности на Ы-конец молекулы органофосфатгидролазы (ОФГ) [14] удалось не только упростить процесс получения очищенного фермента Шв^-ОФТ, но и существенно улучшить эффективность его каталитиче-
ского действия к ДФФ (в 140 раз), Ух (в 2,2 раза) и зарину (в 7 раз) при рН = 7,5 [15] по сравнению с немодифицированным ферментом даже при том, что рН-оптимум модифицированного фермента смещается в область щелочных значений рН [16]. К недостатку метода генетического модифицирования следует отнести снижение уровня синтеза получаемых производных органофосфатгидролазы в клетках по сравнению с синтезом немодифицированного фермента. Тем не менее достигаемое удешевление конечного продукта, получаемого методом генетического модифицирования, — существенный фактор для практического применения фермента.
Таким образом, в случае оптимизации условий получения рекомбинантных форм органофосфатгидролазы открывается возможность использования фермента в технологии детоксикации ФОВ.
Применение органофосфатгидролазы в технологии разложения фосфорорганических отравляющих веществ
Следует сказать, что все известные разработки относительно применения ферментных технологий для целей уничтожения ФОВ касаются исключительно разложения чистых отравляющих веществ ферментами разной степени очистки [17—22], а какая-либо открытая информация об исследованиях ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в составе сложных смесей, какими являются реакционные массы, получаемые по российской технологии уничтожения ФОВ, отсутствует.
Успешные результаты по применению Шв^-ОФГ для гидролиза чистых отравляющих веществ послужили основанием для проведения испытаний данного фермента в реакциях гидролиза ФОВ в составе реакционных масс [15]. Установлено, что в случае реакционных масс, содержащих 6 • 1СГ6 М зарина, основной токсичный компонент может быть полностью гидро-лизован за 0,5 ч с помощью как Шв^-ОФТ, так и немодифицированного фермента. При содержании 7 • 10~6 М вещества типа Ух за тот же интервал време-
ни степень конверсии основного токсичного вещества составила 93 и 81% при использовании Шв^-ОФГ и немодифицированного фермента, соответственно. На сегодняшний день данная разработка наиболее близко стоит к реализации ее в технологии разложения ФОВ.
Говоря о перспективах использования органофосфатгидролазы в технологии уничтожения ФОВ, отметим, что, бесспорно, наиболее привлекательными способами решения технологических задач представляются непрерывные технологии, основанные на применении проточных реакторов, заполненных иммобилизованными формами фермента. В настоящее время идет активный поиск путей стабилизации ферментов и их максимальной адаптации к практическому использованию [23, 24], создания промышленных биокатализаторов путем иммобилизации органофосфатгидролазы и ее генетических производных на различных носителях.
Иммобилизация органофосфатгидролазы позволяет существенным образом увеличить стабильность фермента к воздействию различных факторов: рН среды, повышенной температуры, высоких концентраций субстратов или продуктов реакции, к присутствию органических растворителей и т.д. [25, 26]. Кроме этого, использование иммобилизованных препаратов обеспечивает возможность их многократного применения, что существенно снижает стоимость технологии в целом.
Известно несколько вариантов реализации данного подхода к созданию биокатализаторов, которые гидро-лизуют ФОВ и их аналоги (табл. 1). Один из подходов — это ковалентное связывание фермента с матрицей носителя [25]. В качестве носителя в [25] были использованы различные формы нейлона: в виде порошка, гранул, мембран и трубок, поверхность которых предварительно активировали глутаровым альдегидом. Достоинством данного метода является отсутствие десорбции фермента с носителя, что позволяет проводить технологический процесс с высокими скоростями. К недостаткам метода следует отнести боль-
Таблица 1
Каталитические характеристики иммобилизованной органофосфатгидролазы в реакциях гидролиза фосфорорганических
отравляющих веществ и их структурных аналогов
Иммобилизация Носитель Субстрат Степень конверсии субстрата, % Ссылка
Препараты для т ехнологии разложен и я ФОВ
Ковалентное связывание с помощью глутаро- Нейлон ДФФ 20 [25]
вого альдегида
Физическая адсорбция Тритил-агароза ДФФ 22,5 [27]
Ковалентное связывание с помощью изоциа- Силикагель ДФФ 95 [29]
натпропилового спирта Полиуретан 45
Препараты для защитных материалов
Физическая абсорбция Латексная краска Зоман 62 [48, 49]
ДФФ 32
Ух 45
Ковалентное связывание с помощью глутаро- Хитозановый гель на ДФФ 100 [46]
вого альдегида тканевой подложке
Физическая абсорбция Акрилатный гель на Зоман 100 [45]
тканевой подложке Зарин
Ух
шие потери активности фермента при его иммобилизации (на два порядка и более).
В работе [27] был использован другой подход, а именно, физическая иммобилизация фермента в матрице трифенилметил-агарозы (тритил-агарозы). Преимущества этого метода заключаются в простоте его исполнения и отсутствии потерь активности фермента. Отрицательными же сторонами являются, во-первых, высокая стоимость и гидрофобность носителя, в результате чего возможна усиленная сорбция гидрофобного субстрата и локальное повышение его концентрации, что приводит в конечном счете к инги-бированию иммобилизованного фермента, во-вторых, данный носитель подвержен деформации и неспособен выдержать высокие скорости материальных потоков в промышленных условиях.
Несмотря на то, что существует много интересных разработок на основе иммобилизованной органофос-фатгидролазы и ее генетически модифицированных аналогов [12, 28—31], пока их испытания проводятся лишь на фосфорорганических пестицидах, как правило, параоксоне или в лучшем случае ДФФ, и говорить о каких-то реальных перспективах их применения в технологии уничтожения ФОВ еще рано. Вместе с этим нельзя не отметить тот факт, что применение микробных клеток, обладающих ОФГ-активностью наряду со способностью разрушать продукты гидролиза ФОВ, может оказаться эффективным в технологии уничтожения ФОВ. В этом случае может быть гарантировано получение конечного продукта с минимальной токсичностью и экологической нагрузкой на окружающую среду. Применение клеток микроорганизмов в иммобилизованном виде, согласно [26, 32, 33], должно способствовать увеличению их метаболической стабильности и жизнеспособности.
Наиболее эффективным носителем для подобной иммобилизации, как показала практика, является криогель поливинилового спирта. Причин тому несколько и, в частности, то, что этот полимер производится в крупных масштабах и он дешевый; образующийся из полимера криогель характеризуется наряду с высокой механической прочностью наличием макропористой структуры, обеспечивающей благоприятные условия для массопереноса, осуществляемого в результате метаболической активности клеток [34, 35]; носитель оказывает значительное стабилизирующее действие на целостность клеточных стенок и тем самым способствует увеличению резистентности клеток к негативному влиянию агрессивной среды. Стоит также отметить, что иммобилизованная биомасса более стабильна при хранении, а также за счет иммобилизации возможно достижение более высоких концентраций клеток в единице объема реактора.
Перспективы применения органофосфатгидролазы в качестве компонента средств защиты
Процесс ферментативного разложения ФОВ может быть использован для создания высокоэффективных средств защиты персонала, а также для проведения мероприятий по обработке помещений, оборудования и тары, задействованных в технологических процессах.
Наиболее эффективными в составе средств индивидуальной защиты являются материалы, обеспечивающие не только достаточно сильную сорбцию и
удержание отравляющих веществ, но и осуществляющие их разложение (дегазацию). Так, известны эффективные защитные материалы, в состав которых в качестве сорбентов и одновременно катализаторов разложения ФОВ входят оксиды металлов [36, 37] или комплексные соли металлов [38]. Такие защитные материалы при контакте их с веществом Ух или зома-ном в концентрации 10 г/м2 вызывают их разложение на 59 и 98%, соответственно, за 24 ч. Однако использование этих катализаторов приводит к колоссальному удорожанию самих защитных материалов, поскольку эффективный гидролиз достигается лишь при высоком содержании катализаторов (до 65% от массы сорбента) и высокой степени их измельчения (размер гранул до 250 мкм).
Альтернативу химическим катализаторам, вводимым в защитные фильтрующе-сорбирующие самодегазирующиеся материалы, могут составить ферменты, способные высокоспецифично катализировать гидролиз токсичных веществ. Преимущества фильтрующе-сорбирующих материалов на основе ферментов обусловлены тем, что скорости разложения ФОВ под действием, например, органофосфатгидролазы, превышают скорости реакций, катализируемых химическими реагентами [3], и при этом одинаковая степень конверсии ФОВ достигается при существенно меньших количествах ферментов, чем в реакциях с химическими катализаторами.
Очевидно, что наиболее целесообразно использование ферментов в иммобилизованной форме, которая обеспечивает длительное сохранение каталитической активности ферментов и упрощает процедуру их введения в структуру защитных материалов.
В США разработан фильтрующе-сорбирующий самодегазирующийся материал, представляющий собой полиуретановую губку, содержащую ковалентно иммобилизованную органофосфатгидролазу и частицы активного угля [39]. Включение активного угля в сорбент и иммобилизация фермента осуществляются непосредственно в процессе полимеризации и формирования полиуретанового носителя. Максимальная концентрация фермента в составе такого материала составляет 8 мг/см2. Данный материал предназначен для детоксикации зарина, зомана и вещества Ух в составе индивидуальных средств защиты [28], однако из открытой печати пока известны результаты его успешного применения только в отношении фосфор-органических пестицидов [40—43].
Другой разработанный фильтрующе-сорбирующий самодегазирующийся защитный материал состоит из трех слоев. Верхний слой выполнен из полипропилена, поликарбоната или бутилированного каучука. Этот слой, контактирующий в случае поражения с каплями токсичных веществ, предотвращает проникание жидкой фазы веществ во внутренние слои материала и обеспечивает равномерный подвод их паров к внутренним слоям материала. Средний слой предназначен для сорбции паров токсичных веществ и их дегазации. Он состоит из резины или вспененного пластика с импрегнированными частицами активного угля, ферментом фосфорилфосфатазой и иодбензойной кислотой [44]. Нижний слой, непосредственно прилегающий к кожному покрову, представляет собой целлю-лозосодержащий материал. Недостатком данного за-
щитного материала является ограничение его каталитических возможностей из-за наличия резины или вспененного пластика, что не способствует удерживанию в микроокружении фермента воды, необходимой для катализа.
В России также разработан ферментосодержащий материал, предназначенный для использования в составе средств индивидуальной защиты от ФОВ. Действие данного материала основано на одновременной сорбции и детоксикации (гидролизе) ФОВ под действием иммобилизованного фермента Шв^-ОФГ [45]. В качестве носителя для физической иммобилизации фермента используется сорбент на основе акрилата, который обладает колоссальной сорбционной емкостью и способен удерживать большие количества сорбируемых веществ. Такой фильтрующе-сорбирующий самодегазирующийся материал при нанесении на его поверхность вещества типа Vx, зомана или зарина в концентрации 10 г/м2 обеспечивает нейтрализацию их паров при температуре до 45 °С на 100% за 3—7 ч при рН = 7,8—10,5, гарантируя отсутствие паров токсичного химиката за слоем защитного материала на протяжении не менее 96 ч. Данный материал полностью сохраняет свои защитные свойства после хранения в герметичной упаковке до 12 месяцев.
Другим вариантом материала, содержащего органо-фосфатгидролазу и предназначенного для гидролиза следов фосфорорганических веществ после удаления их с различных твердых поверхностей, в том числе кожи, является ткань, покрытая хитозановыми гелями, обеспечивающими повышенную влагопоглощающую способность материала [46, 47]. Такая ткань может длительное время храниться без микробной контаминации во влажном состоянии в герметичных контейнерах и сохранять готовность к непосредственному применению.
Еще один тип защитных ферментосодержащих средств, разработанный компанией Reactive Surfaces Ltd. (США), — это биокаталитические латексные краски, включающие органофосфатгидролазу [48, 49], которые наносятся на защищаемую поверхность (стены помещений, реакторы и др.). Как показали исследования, степень конверсии ФОВ под действием биоактивных красок не достигает 100%, по-видимому, вследствие ограничения в количестве воды в микроокружении фермента, необходимой для каталитической реакции. В то же время установлено, что смачивание поверхности, покрытой биоактивной краской, активирует ферментативный катализ.
Детекция фосфорорганических отравляющих веществ с помощью органофосфатгидролазы в иммобилизованной форме
Способность органофосфатгидролазы гидролизо-вать ФОВ нашла свое применение в создании высокочувствительных средств детекции отравляющих веществ (табл. 2), которые могут быть использованы в системе аналитического мониторинга технологии уничтожения химического оружия.
Так, реакция разложения фторсодержащих фосфорорганических веществ под действием рекомбинантной органофосфатгидролазы положена в основу функционирования биосенсорной системы, в которой определение накапливающихся фторид-ионов — продуктов ферментативной реакции — осуществляется с помощью ион-селективного электрода [50]. Рабочий диапазон этого биосенсора известен только для вещества ДФФ.
Органофосфатгидролаза, иммобилизованная на углеродных нанотрубках, была использована при создании детектора на основе вольтамперометрии для определения тиолов, образующихся при разложении вещества Ух [51].
Совместное использование органофосфатгидролазы и бутирилхолинэстеразы в составе биосенсорной системы позволяет определять ФОВ в присутствии других ингибиторов холинэстераз в сложной смеси. Комбинация указанных ферментов с дополнительным введением в детекционную систему еще одного фермента — холиноксидазы — обеспечивает определение нано-количеств ФОВ [52].
Совместно иммобилизованные органофосфатгидролаза и ацетилхолинэстераза на силикагеле также позволяют определять ФОВ в смесях [53]. Присутствие в исследуемом растворе других веществ, в частности Ю-5 М карбаматов, не мешает анализу.
Для увеличения чувствительности биосенсорной системы на основе органофосфатгидролазы был использован фермент, химически модифицированный карбоксинафтолфлуоресцеином, спектр флуоресценции которого меняется в зависимости от рН. Поскольку при ферментативном гидролизе ФОВ происходит изменение рН реакционной среды, то данный метод оказался применим к широкому спектру анализируемых субстратов. С помощью такого биосенсора можно проводить количественный анализ ДФФ при концентрации в диапазоне 2—400 мкМ [54].
Помимо вышеперечисленных биосенсоров, известно большое количество разработок на основе органо-
Таблица 2
Методы определения структурных аналогов ФОВ с применением органофосфатгидролазы
Принцип детектирования Форма фермента Диапазон определяемых концентраций, мкМ Ссылка
Определение фторид-ионов с помощью Иммобилизованный фермент на 25-5000 для ДФФ [50]
ион-селективного электрода силикагеле
Ингибирование ацетилхолинэстеразы То же 0,001-10 для ДФФ Í53]
Ингибирование бутирилхолинэстеразы Растворимая форма от 0,0045 для ДФФ [52]
Определение тиоловых спиртов Иммобилизованный фермент на углеродных нанотрубках 1—85 для деметона С [51]
Флуоресценция Иммобилизованный фермент на полистироле 2-400 для ДФФ [54]
фосфатгидролазы, предназначенных для дискриминационного определения ФОВ, но пока все они апробированы лишь на отдаленных аналогах отравляющих веществ — пестицидах. Все эти работы можно разделить на две группы: в первой используются иммобилизованные клетки-продуценты органофосфатгидролазы [55, 56], а во второй — иммобилизованный фермент [57—60]. Можно также провести классификацию в зависимости от типа детекции ФОВ: с использованием амперометрических [55, 57], потенциометриче-ских [56, 58], спектрометрических [59], рН-чувствительных детекторов [60].
Оценивая общую ситуацию в развитии детекцион-ных систем на основе органофосфатгидролазы, следует отметить, что сегодня прослеживается, с одной стороны, усложнение биосенсоров по числу используемых компонентов, а с другой — увеличение точности и расширение диапазона определяемых концентраций аналогов ФОВ.
Заключение
Изучение возможности использования ферментов, способных осуществлять гидролиз ФОВ, является одним из главных направлений исследований в рамках проблемы детоксикации ФОВ. Наиболее интенсивно разработки в этой области проводятся в США [23, 61], России [57], Великобритании [62] и Австралии [24].
Совокупность современных достижений в химической энзимологии, биотехнологии и сенсорных технологиях позволила создать базу для развития нового ферментативного подхода к решению ключевых проблем в области разработки технологии уничтожения химического оружия и предложить ряд целесообразных и эффективных решений.
* * *
Работа выполнена при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (государственный контракт № 02.515.11.5002).
ЛИТЕРАТУРА
1.Raushel F.M. Curr. Opin. Microbiol., 2002, v. 5(3), p. 288295.
2. Kline B.J., Drevon G., Russell A.J. Enzymes in Action: Green Solutions for Chemical Problems. Ed. B. Zwanenburg e. a. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, p. 397—431.
3. Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. Успехи биол. химии, 2004, т. 44, с. 307-340.
4. Enzymes in Action: Green Solutions for Chemical Problems. Ed. B. Zwanenburg e. a. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 458 p.
5. Ефременко E., Сергеева В. Изв. АН. Сер. хим., 2001, № 10, с. 1743-1749.
6. Kolakowski J.Е., Defrank J.J., Harvey S.P., Szafraniec L.L., Beaudry W.T., Lai K, Wild J.R. Biocatal. Biotransfor., 1997, v. 15(4), p. 297-312.
7. DiSioudi B.D., Miller C.E., Lai K, Grimsley J.K., Wild J.R. Chem.-Biol. Interact., 1999, v. 119-120, p. 211-223.
8. Little J.S., Broomfleld C.A., Fox-Talbot M.K., Boucher L.J., Maclver В., Lenz D.E. Biochem. Pharmacol., 1989, v. 38(1), p. 23-29.
9. DiSioudi В., Grimsley J.K., Lai K., Wild J.R. Biochemistry, 1999, v. 38(10), p. 2866-2872.
10. Gopal S., Rastogi V., Ashman W., Mulbry W. Biochem. Bioph. Res. Com., 2000, v. 279(2), p. 516-519.
11. Efremenko E., Votchitseva Yu., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. Appl. Microbiol. Biot., 2006, v. 70(5), p. 558-563.
12. Wu C.-F., Cha H.J., Valdes J.J., Bentley W.E. Biotechnol. and Bioeng., 2002, v. 77(2), p. 212-218.
13. Shimazu M., Mulchandani A., Chen W. Biotechnol. Bioeng., 2003, v. 81(1), p. 74-79.
14. Патент РФ № 2255975, 2005.
15. Патентная заявка РФ на изобретение № 2005120422, 2005.
16. Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Агиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Биохимия, 2006, т. 71(2), с. 216-222.
17. Патент WO № 01/56380, 2001.
18. Патент США № 5589386, 1996.
19. Патент США № 5928927, 1999.
20. Патент США № 6080566, 2000.
21. Hoskin F.-C.G., Walker J.E., Dettbarn W.-D., Wild J.R. Biochem. Pharmacol., 1995, v. 49(5), p. 711-715.
22. Rastogi V.K, Defrank J.J., Cheng T.-C., Wild J.R. Biochem. Bioph. Res. Com., 1997, v. 241(2), p. 294-296.
23. Ghanem E., Raushel F.M. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2005, v. 207(2), Suppl/ 1, p. 459-470.
24. Singh B.K., Walker A. FEMS Microbiol. Rev., 2006, v. 30(3), p. 428-471.
25. Caldwell S.R., Raushel F.M. Appl. Biochem. Biotech., 1991, v. 31(1), p. 59-72.
26. Efremenko E.N., Lozinsky V.I., Sergeeva V.S., Plieva F.M., Makhlis T.A., Kazankov G.M., Gladilin A.K, Vatfolomeyev S.D. J. Biochem. Bioph. Meth., 2002, v. 51(2), p. 195-201.
27. Caldwell S.R., Raushel F.M. Biotechnol. and Bioeng., 1991, v. 37(2), p. 103-109.
28. LeJeune K.E., Dravis B.C., Yang F., Hetro A.D., Doctor B.P., Russell A.J. Ann. NY Acad. Sci., 1998, v. 864, p. 153-170.
29. Gill L, Ballesteros A. Biotechnol. and Bioeng., 2000, v. 70(4), p. 400-410.
30. Mansee A.H., Chen W., Mulchandani A. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2005, v. 32(11-12), p. 554-560.
31. Wang J., Bhattacharyya D., Bachas L.G. Biomacromolecules, 2001, v. 2(3), p. 700-705.
32. Efremenko E.N. Biocatalysis and Biocatalytic Technologies. Ed. G.E. Zaikov. N.-Y.: Nova Science Publishers Inc., 2006, p. 23-37.
33. Kim J.-W., Rainina E.I., Mulbry W.W., Engler C.R., Wild J.R. Biotechnology Progress, 2002, v. 18(3), p. 429—436.
34. Lozinsky V.I, Zubov A.L., Titova E.F. Enzyme Microb. Tech., 1996, v. 18(6), p. 561-569.
35. Лозинский В.И. Успехи химии, 2002, т. 71(6), с. 559—585.
36. Патент США № 5689038, 1997.
37. Патент США № 6403653, 2002.
38. Патент США № 6410603, 2002.
39. Патент США № 6642037, 2003.
40. LeJeune К.Е., Mesiano A.J., Bower S.B., Grimsley J.К., Wild J.R., Russell A.J. Biotechnol. and Bioeng., 1997, v. 54(2), p. 105-114.
41. LeJeune K.E., Wild JR., Russel A.J. Nature, 1998, v. 395(6697), p. 27-28.
42. Havens P.L., Rase H.F. Ind. Eng. Chem. Res., 1993, v. 32(10), p. 2254-2258.
43. LeJeune K.E., Russell A.J. Biotechnol. and Bioeng., 1999, v. 62(6), p. 659-665.
44. Патент США № 4781959, 1988.
45. Патентная заявка РФ на изобретение № 2007102061, 2007.
46. Efremenko Е., Peregudov A., Kildeeva N., Perminov P., Varfolomeyev S. Biocatal. Biotransfor., 2005, v. 23(2), p. 103— 108.
47. Патент РФ № 2261911, 2005.
48. Патент WO 2004/112482, 2004.
49. McDaniel C.S., McDaniel J, Wales M.E., Wild J.R. Prog. Org. Coat., 2006, v. 55(2), p. 182-188.
50. Simonian A.L., DiSioudi B.D., Wild J.R. Anal. Chim. Acta, 1999, v. 389(1-3), p. 189-196.
51. Kanchan A. J., Prouza M., Кит M., Wang J., Tang J., Haddon R, Chen W., Mulchandani A. Anal. Chem., 2006, v. 78(1), p. 331-336.
52. Еременко A.B., Курочкин И.Н., Сиголаева Л.В., Еремеев Н.Л., Бармин А.В., Морзунова Т.Г., Кондратов Ю.В., Райнина Е.И.,
Варфоломеев С.Д., Завьялова Н.В., Холстов В.И. Хим. и биол. безопасность, 2004, № 3—4(15—16), с. 26—35.
53. Simonian A.L., Efremenko E.N., Wild J.R. Anal. Chim. Acta, 2001, v. 444(2), p. 179-186.
54. Viveros L., Palmal S., McCrae D., Wild ./., Simonian A. Sen-sore Actuat. В - Chem., 2006, v. 115(1), p. 150-157.
55. Yu D., Volponi ./., Chhabra S., Brinke C.J., Mulchandani A., Singh A.K. Biosens. Bioelectron., 2005, v. 20(7), p. 1433— 1437.
56. Rainina E.I., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D., Simonian A.L., Wild J.R. Ibid., 1996, v. 11, p. 991-1000.
57. Varfolomeyev S., Kurochkin /., Eremenko A., Efremenko E. Pure Appl. Chem., 2002, v. 74(12), p. 2311-2316.
58 .Simonian A.L., Good T.A., Wang S.-S., Wild J.R. Anal. Chim. Acta, 2005, v. 534(1), p. 69-77.
59. White B.J., Harmon H.J. Biosens. Bioelectron., 2005, v. 20(10), p. 1977-1983.
60. Schöning M.J., Arzdorf M., Mulchandani P., Chen W., Muchandani A. Sensors, 2003, v. 3, p. 119—127.
61. Lei Y., Mulchandani A., Chen W. Biotechnol. Progr., 2005, v. 21(3), p. 678-681.
62. Briseo-Roa L., Hill J., Notman S., Sellers D., Smith A.P., Timperley C.M., Wetherell J., Williams N.H., Williams G.R., Ferscht A.R., Griffiths A.D. J. Med. Chem., 2006, v. 49(1), p. 246-255.
