CC BY
19
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ В ПРОЦЕССЕ БИОРЕМЕДИАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ
РОДА ACINETOBACTER
Белоусова Елена Васильевна
кандидат биологических наук, ассистент, Воронежский государственный университет, г. Воронеж
Грабович Маргарита Юрьевна
доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет, г. Воронеж
Данг Тху Тхюи
кандидат биологических наук, заведующая кафедрой, BaRia - Vung Tau University, Vung Tau, Вьетнам
ENZYMATIC ACTIVITY OF OIL-POLLUTED SOIL BIOREMEDIATION DURING THE USE OF THE CONSORTIUM MICROORGANISMS OF THE GENUS ACINETOBACTER
Belousova Elena, candidate of sciences, assistant, Voronezh State University, Voronezh Grabovich Margarita, doctor of sciences, professor, Voronezh State University, Voronezh АННОТАЦИЯ
Ключевые слова: полифенолоксидаза, пероксидаза, биоремедиация, гумусообразование Key words: polyphenol oxidase, peroxidase, bioremediation, humification АННОТАЦИЯ
В ходе работы показано, что после интродукции в нефтезагрязненную почву живой культуры консорциума бактерий, состоящего из Acinetobacter calcoaceticus B-3780, A. radioresistens B-2838 и В-5064, наблюдается уменьшение снижения коэффициента гумификации на 20%, что свидетельствует о положительной направленности гумусообразования, способствующего повышению плодородия почвы. ABSTRACT
The work shows that after the introduction the bacterial consortium consisting of Acinetobacter calcoaceticus B-3780, A. radioresistens B-2838 and B-5064 into the oil-polluted soil, a decrease in the rate of humification reduce by 20%, reflecting the positive trend of humus to help improve soil fertility.
Нефть и нефтепродукты являются одними из основных загрязнителей окружающей среды и в первую очередь почвы [2]. В связи с этим разработка способов очистки нефтезагрязненных почв - одна из важнейших задач при решении проблемы антропогенного воздействия на окружающую среду [1]. Микробиологическая ре-медиация (биорекультивация) является наиболее экономически выгодной и экологически безопасной по сравнению с остальными способами рекультивации (выжигание, взрывной способ, засыпка чистым грунтом) [3]. Под биорекультивацией подразумевается активизация аборигенной почвенной микрофлоры, сформировавшейся в условиях нефтяного разлива, а также внесение специально разработанных биопрепаратов. Разложение нефти и нефтепродуктов в почве в естественных условиях - процесс биохимический. Интенсивность деградации нефти находится в прямой зависимости от биологической (ферментативной) активности почвы, общего количества почвенной микрофлоры и ее физиологической активности. Внутри почвенного профиля главная роль в окислении нефти и нефтепродуктов принадлежит биологическому окислению, которое осуществляется в результате ферментативных реакций. Ферменты почвенных микроорганизмов участвуют в сохранении биохимического равновесия в почве при ее различных загрязнениях. Поэтому для определения изменения биологической активности почвы в процессе биоремедиации часто используют показатели пероксидазной (ПО) и полифенолоксидазной (ПФО) активности. Низкие дозы загрязнения углеводородами активизируют эти ферменты, средние и высокие дозы оказывают ингибирующее действие. Увеличение активности ПО объясняется включением фермента в процесс детоксика-ции, а ПФО - трансформацией продуктов нефтяного разложения в компоненты гумуса.
Исследования по изучению ферментативных свойств нефтезагрязнгенной почвы мы проводили в условиях микрополевого опыта с использованием нового консорциума микроорганизмов-нефтедеструкторов, в состав которго входили штаммы Acinetobacter calcoaceticus B-3780, A. radioresistens B-2838 и В-5064 [4].
В микрополевом масштабе ремедиация осуществлялась на специально оборудованной площадке в естественных условиях. Эксперимент проводили при 13-30 °С, регулярной агротехнической обработке: рыхление один раз в неделю и увлажнение почвы. Схема микрополевого опыта:
1. Незагрязненная почва (контроль);
2. Загрязненная отработанным маслом почва (без бактерий);
3. Загрязненная отработанным маслом почва + бактерии;
4. Загрязненная отработанным маслом почва + опилки;
5. Загрязненная отработанным маслом почва + опилки + бактерии.
В данном опыте почву однократно загрязняли отработанным машинным маслом в дозе 10 г/кг почвы в слое 0-20 см. Общая площадь делянки (1х4) м, учетная -(1Х0,8) м. Бактериальную культуру вносили дважды в начале эксперимента и спустя четыре недели. Раз в неделю производился отбор образцов и выполнены в двукратной повторности следующие виды анализов: содержание нефтепродуктов методом ИК-спектрометрии; количественный учет клеток; анализ ферментативной активности почвы.
Активность полифенолоксидазы определяли по образованию пурпурогаллина из пирогаллола. В качестве стандарта использовали раствор бихромата калия. 0,75 г K2Cr2O7 растворяли в 1 дм3 0,5 M HCl (оптическая
Х=430 нм и толщине кюветы 1 см. Для измерения активности пероксидазы помимо пирогаллола добавляли 1 мл 0,5% Н2О2. Активность пероксидазы выражали в миллиграммах пурпурогаллина на 1 г почвы за 24 часа [5].
В первые 15 дней наблюдалось увеличение активности пероксидазы и полифенолоксидазы, а в последу -ющие дни активность пероксидазы начала стабилизироваться, а активность полифенолоксидазы стала снижаться (табл.1).
Таблица 1
Динамика пероксидазной и полифенолоксидазной активности в процессе ремедиации в микрополевом эксперименте
плотность этого раствора соответствует таковой раствора, содержащего 0,1 мг пурпурогаллина в 1 мл). Для измерения активности полифенолоксидазы 5 г образца почвы помещали в 100 мл воды и добавляли 5 капель толуола, 20 минут вращали на шейкере, после чего фильтровали через фильтр «синяя лента». Для измерения к 10 мл фильтрата добавляли 5 мл 1% пирогаллола и инкубировали 24 часа. Измеряли на спектрофотометре при
Участки Ферменты Активность (мг пурпургаллина /г почвы за 24 часа)
Время (сут.)
7 14 21 35
Почва ПО 0,75 0,99 1,05 0,99
ПФО 0,81 1,26 1,05 0,63
Падение коэффициента гумификации,% - 0 7 42
Масло ПО 0,27 0,9 1,2 1,26
ПФО 0,51 1,11 1,08 0,63
Падение коэффициента гумификации,% - 35 52 74
Почва+масло+ бактерии ПО 0,3 1,11 1,05 1,2
ПФО 0,39 1,08 1,05 0,75
Падение коэффициента гумификации,% - 25 27 55
Почва+масло+ опилки ПО 0,24 0,66 0,72 1,41
ПФО 0,51 0,78 0,87 0,63
Падение коэффициента гумификации,% - 44 43 79
Почва+масло+ опилки+бактерии ПО 0,63 0,78 1,08 0,75
ПФО 0,42 0,93 0,99 0,6
Падение коэффициента гумификации,% - 0 0 0
Примечание: при расчете падения коэффициента гумификации за 100% брали коэффициент гумификации через 7 дней опыта.
Коэффициент гумификации - это величина выражающая отношение активности ПФО к активности ПО и позволяющая судить о преобладании катализируемых процессов. В системе «почва+отработанное масло» и «почва+масло+опилки» наблюдалось резкое уменьшение коэффициента гумификации, что свидетельствует о преобладании процесса окисления гумусовых веществ над процессом гумификации почвы и о снижении качества почвы в связи с ее загрязнением. В системе «почва +масло +бактерии» падение коэффициента гумификации замедлялось после внесения живой культуры углеводородраз-лагающих бактерий, но по мере отмирания клеток падение коэффициента гумификации возобновлялось в связи с присутствием в почве остаточных нефтепродуктов, тогда как в системе «почва+масло+опилки +бактерии» за 35 суток нам не удалось обнаружить падение коэффициента гумификации.
Таким образом, нами было показано, что после интродукции в нефтезагрязненную почву живой культуры исследуемого консорциума наблюдается уменьшение снижения коэффициента гумификации на 20%, что свидетельствует о положительной направленности гумусообра-зования, способствующего повышению плодородия почвы. Таким образом, применение консорциума трех исследуемых штаммов в составе биопрепарата позволит
повысить эффективность процесса биоремедиации нефте-загрязненных почв.
Список литературы
1. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах: Автореф. дис. докт. биол. наук: 03.02.01 / СПб., 1996. - 25 с.
2. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде/ Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. -Т. 32, № 6. - С. 579-585.
3. Оборин А.А. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таёжной зоны / А.А. Оборин, И.Г. Калачникова, Т.А. Масливец и др. // Восст. нефтезаг. почв. экос. - М.: Наука. -1988. - С. 140-159.
4. Перспективы использования штаммовВ-3780, В-2838, В-5064 бактерий родаАсшейЬаСег для деградации почвенных нефтяных загрязнений / Т.Т. Данг, О.О. Логинова, Е.В. Белоусова и др. // Проблемы региональной экологии. - 2011. -№ 4. - С. 202-208.
5. Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимологии. -М.: Наука, 2005. - 252 с.
