Фенотипический и молекулярно-генетический мониторинг Neisseria gonorrhoeae, циркулирующих на западном Урале

Румянцева Мария Андреевна; Коломойцев Александр Владимирович; Карпунина Тамара Исаковна; Елькин Владимир Дмитриевич

БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

УДК 6l6.9:579.86l.1]-036.22-076575.21](470.5)

ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ NEISSERIA GONORRHOEAE, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ЗАПАДНОМ УРАЛЕ

М.А. Румянцева12*, А.В. Каламайцев12, Т.И. Карпунина2, В.Д. Елькин2

1Пермский краевой кожно-венерологический диспансер, 2Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера, Россия

PHENOTYPICAL AND MOLECULAR-GENETIC MONITORING OF NEISSERIA GONORRHOEAE, CIRCULATING IN WESTERN URAL

M.A. Rumyantseva12, A.V. Kolomoitsev12, T.I. Karpunina2, V.D. Elkin2

1Perm Regional Dermatovenerologic Dispensary,

''Academician Ye.A. Vagner Perm State Medical University, Russian Federation

Цель. Изучить биологические особенности штаммов N. gonorrhoeae, изолированных от больных, проживающих в Пермском крае.

Материалы и методы. Представлен анализ заболеваемости гонококковой инфекцией за 2010-2015 гг. по Пермскому краю с применением интенсивных показателей. В работе использовано 60 клинических штаммов N. gonorrhoeae. Первичная идентификация культур проведена в ККВД бактериоскопиче-ским и бактериологическим методами в соответствии со стандартными операционными процедурами. Для подтверждения видовой принадлежности изолированных культур применяли метод ПЦР в режиме реального времени.

Результаты. Приближенное значение среднегодового темпа прироста равнялось 5,85 %. Показано, что привлечение молекулярно-генетического анализа существенно дополняет фенотипи-

[Румянцева М.А. (*контактное лицо) - аспирант кафедры дерматовенерологии; Коломойцев А.В. - кандидат медицинских наук, доцент кафедры дерматовенерологии; Карпунина Т.И. - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики; Елькин В.Д. - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой дерматовенерологии].

ческий мониторинг N. gonorrhoeae, что позволяет оценить генетическое разнообразие и механизмы устойчивости к антибактериальным препаратам штаммов, циркулирующих на административной территории.

Выводы. Первый опыт подобных исследований показал генетическое разнообразие N. gonorrhoeae, циркулирующих в Пермском крае, и выявил ряд особенностей распространенности генов, детерминирующих их чувствительность/резистентность к АМП.

Ключевые слова. Мониторинг, N. gonorrhoeae, фенотипические и молекулярно-генетические методы анализа.

Aim. To study the biological peculiarities of N.gonorrhoeae strains, isolated from patients of Perm Krai. Materials and methods. Gonococcal infection sickness rate for 2010-2015 in Perm Krai was analyzed using intensive indices. Sixty clinical N.gonorrhoeae strains were used in this work. Primary identification of cultures was carried out at Regional Venereologic Dispensary using bacterioscopic and bacteriological methods with standard surgical procedures. To confirm the species belonging of isolated cultures, PCR method in real-time mode was applied.

Results. An approximate value of the average annual increase was 5,85 %. It was shown that use of molecular-genetic analysis essentially adds to phenotypical monitoring of N.gonorrhoeae that permits to assess genetic variety and mechanisms of resistance to antibacterial agents of the strains, circulating throughout the administrative territory.

Conclusions. The first experience of such studies showed genetic variety of N.gonorrhoeae, circulating in Perm Krai, and revealed a number of peculiarities of gene prevalence, determining their sensibility/resistance to antimicrobial drugs.

Key words. Monitoring, N.gonorrhoeae, phenotypical and molecular-genetic methods of analysis.

Введение

Гонококковая инфекция (ГИ) с ее доминирующей манифестной формой - острой генитальной гонореей - одна из самых распространенных бактериальных инфекций, передаваемых половым путем, заболеваемость которой, несмотря на использование эффективных противогонококковых препаратов, остается трудно контролируемой. На ее эпидемиологию влияют многочисленные факторы: демографические, социально-экономические, сексуальное поведение и культура населения. Однако «неуправляемость» ГИ определяется в первую очередь свойствами ее возбудителя, важнейшее из которых - постоянная изменчивость антиген-

ных детерминант микроорганизма, а также быстрое изменение его чувствительности к антибактериальным препаратам [1]. Антигенная изменчивость Neisseria gonorrhoeae ведет к тому, что перенесенная инфекция не оставляет после себя иммунологической защиты и делает пока невозможным создание вакцинных препаратов, весьма успешно работающих при инфекциях с широким распространением. Невозможность эффективного воздействия на третье звено эпидемического процесса вынуждает исследователей к совершенствованию старых и поиску новых путей, оказывающих влияние на распространение этой инфекции. В свете охарактеризованных выше аспектов анализируемой проблемы становится очевидной значимость микробиологиче-

ского мониторинга штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих в отдельных субъектах Российской Федерации, с учетом рационального использования современных методов бактериологического анализа.

Цель работы - изучение биологических особенностей штаммов N. gonorrhoeae, изолированных от больных в Пермском крае.

Материалы и методы

ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовано 60 клинических штаммов N. gonorrhoeae. Первичная идентификация культур проведена в ККВД бакте-риоскопическим и бактериологическим методами в соответствии со стандартными операционными процедурами «Проведение видовой идентификации возбудителя гонореи» (СОП № 003/02 ГОН, СОП № 004/02 ГОН, СОП № 005/02 ГОН). Выделение ДНК осуществляли методом R. Boom et al. (1990). Для подтверждения видовой принадлежности изолированных культур применяли метод ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческой тест-системы производства АО «Вектор-Бест» (кат. № D-4498, РУ № ФСР 2016/4015) на детектирующем амплификаторе CFX 96 (BioRad, США). Режимы термостатирования и параметры оценки результатов задавались автоматически согласно рекомендуемому производителем программному обеспечению «Реал Бест Диагностика. Версия 4.1» («Вектор-Бест», Россия). Предварительная оценка генетического разнообразия N. gonorrhoeae выполнена с помощью RAPD-ПЦР с праймерами D11344 и D8635, адаптированными для ти-пирования гонококков [4]. Для амплифика-

ции фрагментов генов, имеющих прогностическую ценность при оценке антибиоти-корезистентности N. gonorrhoeae (bla, tet(M), ermB, mefA), использовали праймеры, рекомендованные В.А. Верещагиным [2]*.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лабораторная диагностика гонореи в Пермском крае, как и в целом по России, базируется на двух основных методах исследования: бактериоскопическом и бактериологическом. Выявление гонококка в препаратах, окрашенных метиленовым синим и по методу Грама, возможно лишь при наличии в патологическом отделяемом типичных форм возбудителя и при правильной его окраске. Однако в препаратах нередко встречаются гонококки с измененными морфологическими и тинкториальными свойствами. Кроме того, при вялотекущих формах гонореи диагностика осложняется либо обилием сопутствующей микрофлоры, затрудняющей поиск гонококка, либо малым количеством возбудителя гонореи в патологическом материале.

Предпринятое нами изучение 38 штаммов, изолированных от мужчин, и 22 -от женщин, позволило установить следующее. Бактериоскопическое исследование оказалось результативным в 100 % случаев

* Авторы выражают искреннюю признательность за помощь в проведении и анализе результатов моле-кулярно-генетических исследований доктору медицинских наук, старшему научному сотруднику Лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН М.В. Кузнецовой и кандидату медицинских наук, заведующему лабораторией иммуногенети-ки ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора А.В. Кривцову.

изучения «мужских» мазков с выявлением типичных морфотипов с преимущественно внутриклеточной локализацией возбудителя (рис. 1, а).

Только в 12 из 22 образцов вагинально-го/цервикального отделяемого были обнаружены грамотрицательные диплококки бобовидной формы (рис. 1, б). Важно подчеркнуть,

б

Рис. 1. Микроскопическая картина в образцах отделяемого уретры (а) и вагинально-цервикальной слизи (б) мужчин и женщин, больных острой гонореей (*100)

что в препаратах отмечены различия в размерах клеток, образующих пару. Внутриклеточную локализацию возбудителей регистрировали спорадически, напротив, в полях зрения преобладали гонококки, адгезированные на эпителиальных клетках. Микроскопическая картина при этом характеризовалась

пестротой с обилием цитологических вариантов, отражающих особенности, в том числе различную степень выраженности патологического процесса. В составе эпителиальных пластов присутствовали клетки разной степени дифференцировки: от представителей ба-зального и парабазального слоев (их большинство) до поверхностных (рис. 2, а).

б

Рис. 2 Цитологический «пейзаж» образцов вагинально-цервикальной слизи женщин, больных острой гонореей (Ч100)

В значительном количестве мазков регистрировали обилие лимфоцитов, что указывало на длительное течение заболевания. Хотя признаки воспалительной реакции были налицо, цитологическая картина отличалась пестротой клеточных морфотипов, за которыми, зачастую, не удавалось увидеть не только диплококки бобовидной формы, но и про-

чую вагинально-цервикальную микрофлору. Нередко встречали «усыпанные» бактериями эпителиальные клетки, напоминающие «ключевые», встречающиеся при бактериальном вагинозе. Однако в подобных случаях дифференцировать таксономическую принадлежность бактерий с помощью обычного светового микроскопа, как правило, не представлялось возможным (рис. 2, б).

Посев биологического материала на неселективные питательные среды позволил обнаружить колонии, «подозрительные» на гонококки (положительный оксидазный тест), во всех «мужских» образцах и лишь в 40,9 % «женских». Посевы отделяемого из уретры мужчин характеризовались типичным единообразием сформировавшихся колоний: от 1 до 3 мм в диаметре, округлые, выпуклые, с ровным краем, бесцветные, чаще непрозрачные или слегка мутные, с блестящей поверхностью. При культивировании образцов вагинально-цервикальной слизи внешний вид колоний отличало значительное разнообразие. Морфометрические показатели колебались в пределах от 0,6 до 4,7 мм в диаметре. Более того, если формирование колоний в первом случае происходило в течение 24-48 часов, то во втором - появление вновь образовавшихся колоний отмечали до 5-6-х суток. К концу периода наблюдения появлялись особенно мелкие колонии, напоминающие капли росы. Микроскопическое исследование материала из колоний, окрашенного по Граму, в определенном смысле дополнило информацию, полученную при микроскопии нативного материала. В «мужских» мазках регистрировалась однотипная картина: компактно упакованные, особенно в центральной части, скопления грамотрицательных дипло-

кокков, что косвенно указывает на наличие у бактерий пилей и/или Ора-белка. В то же время в колониях, сформировавшихся при посевах вагинально-цервикальной слизи, отмечали выраженный полиморфизм кокков как по форме, так и по размерам. В мазках обнаруживали полиморфную флору, в том числе округлые грамотрицательные бактерии, по размерам - от мелких до гигантских. Интенсивность окраски клеток также варьировалась в широких пределах. Зачастую гонококки находились в ассоциации с грамотри-цательными палочками, притом, что на чашках колонии выглядели однородно, и попытки разобщить («рассеять») представителей разных таксонов не приносили желаемого результата. В колониях, появившихся на 5-6-е сутки, отмечали очень мелкие разрозненные полиморфные бактерии, что характерно для ауксотрофных вариантов.

Как показали наши исследования [3], в Пермском крае фенотипическая чувствительность/резистентность к антибактериальным препаратам изученных штаммов N. gonorrhoeae, изолированных от мужчин и женщин, не имела достоверной разницы. Установлена высокая чувствительность возбудителей инфекции к цефтриаксону, спек-тиномицину, что коррелирует с общероссийскими данными, при этом клиническая эффективность цефалоспоринов оказалась выше при лечении мужчин. Более 80 % штаммов N. gonorrhoeae проявляли устойчивость к ампициллину, доксициклину и азит-ромицину, что, в соответствии с критериями ВОЗ, делает нецелесообразным их использование для лечения гонореи в Пермском крае.

В соответствии с задачей совершенствования микробиологической диагностики и

мониторинга гонококковой инфекции нами впервые была предпринята попытка изучения и анализа молекулярно-генетических особенностей штаммов N. gonorrhoeae, циркулирующих на территории субъекта. Для формирования коллекции образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae было отобрано 27 культур, видовая принадлежность которых подтверждена методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческой тест-системы про-

изводства АО «Вектор-Бест». Предварительная оценка генетического разнообразия N. gonorrhoeae выполнена с помощью RAPD-ПЦР с праймерами D11344 и D8635, которые, согласно M. Van Looveren et al. [4], имели достаточную дискриминирующую способность (ДИ = 0,849) для региональных исследований. По результатам RAPD-типи-рования отобрано 25 штаммов N. gonorr-hoeae, имеющих индивидуальный генетический профиль (рис. 3).

D8635 (типирование)

JV1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 J4 15 J6 17 18 19 Е 21 22 23 24 а а 27

п

Tet 1 Tet2 (436 кн.)

Рис. 3. Электрофореграммы продуктов RAPD-ПЦР клинических изолятов N. gonorrhoeae: а - с праймером D8635; б - пример продуктов амплификации гена tet (M - маркер молекулярных масс 100 bp)

Полное совпадение результатов в образцах 1 и 3, а также 6 и 7 (рис. 3, а), очевидно, связано с тем, что эти образцы были изолированы от контактных больных. При сравнении профиля чувствительности к антимикробным препаратам (АМП) с частотами обнаружения соответствующих генетических мар-

керов устойчивости установлено, что по данным тестов на чувствительность к пенициллину, тетрациклину и макролидам в исследованной группе 22 (88 %), 3 (12 %) и 7 (28 %) штаммов относились к категории резистентных. Частота обнаружения генетических маркеров устойчивости составила:

а

ЫаиМЛ - 4 % (1 из 25), ¡вЩ) - 36 % (9 из 25), егшБ - 20 % (5 из 25), шв/А - 4 % (1 из 25 штаммов). У 4 штаммов выявлено сочетание ?е?(М)+ешД у одного Ь1а1ШЛ+ ?е?(М)+ше/А Отсутствие выбранных маркеров резистентности наблюдалось в 60 % случаев (15 штаммов). Таким образом, несмотря на высокую устойчивость нейссерий к бета-лактамным антибиотикам и тетрациклину, ЫаГЕМЛ детектировали только в одном случае. Плазмидный ген ¡в1(М), продукт которого защищает малую субъединицу рибосомы, -у 9 штаммов (рис. 3, б). Устойчивость к макролидам в большей степени обеспечена метилированием рибосом, чем с эффлюксом.

Результаты мониторинга антибиотико-резистентности N. %от>ггЪовае показали, что при отсутствии значимых региональных отличий в антибиотикоустойчивости с гонококками, изолированными на других территориях Российской Федерации, следует отметить, что в Пермском крае более высокий процент культур N. ^опоггЪовае, несущих генетические детерминанты 1е1М и егшБ.

Выводы

Одним из способов устранения сохраняющихся проблем по контролю над распространением генитальной гонореи может стать внедрение в медицинскую практику молекулярно-генетических методов диагностики. Первый опыт подобных исследований показал генетическое разнообразие N. go-

norrhoeae, циркулирующих в Пермском крае, и выявил ряд особенностей распространенности генов, детерминирующих их чувствительность/резистентность к АМП.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Администрации Пермского края в рамках научного проекта

«р_а 17-44-590404».

Библиографический список

1. Костюкова Н.Н., Бехало В.А Эпидемический процесс гонококковой инфекции -анализ и современные тенденции. Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2012; 62 (1): 40-48.

2. Верещагин В.А Молекулярное типи-рование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М. 2006; 29.

3. Румянцева М.А., Елькин В.Д. Сравнительная оценка чувствительности клинических изолятов Neisseria gonorrhoeae к антибактериальным препаратам. Пермский медицинский журнал 2015; 32 (1): 51-55.

4. Van Looveren M., Ison C.A., Ieven M. Evaluation of the discriminatory power of typing methods for Neisseria gonorrhoeae. Clin Microbiol 1999; 37 (7): 2183-2188.

Материал поступил в редакцию 25.05.2017

PHENOTYPICAL AND MOLECULAR-GENETIC MONITORING OF NEISSERIA GONORRHOEAE, CIRCULATING IN WESTERN URAL

Текст научной работы на тему «Фенотипический и молекулярно-генетический мониторинг Neisseria gonorrhoeae, циркулирующих на западном Урале»