CC BY
42УДК 619:616-001.17:616-08 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-3-19-23
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ E. COLI, ИНДУЦИРОВАННАЯ
Y-ЛУЧАМИ 60Co
М.Ю. Галлямова, К.Н. Вагин - кандидат биологических наук, Р.Н. Низамов - доктор ветеринарных
наук, профессор, Т.Р. Гайнутдинов - кандидат биологических наук, Н.М. Василевский - доктор ветеринарных наук, профессор, А.М. Идрисов - кандидат ветеринарных наук, Г.И. Рахматуллина - кандидат биологических наук.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru
Используя малые дозы гамма-излучения или же постепенно возрастающие, можно повысить исходную радиорезистентность микроорганизмов. Направленная бактериальная эволюция может служить как инструмент при определении молекулярных основ адаптации к стрессу или новым факторам окружающей среды. В эксперименте использовано многократное облучение постепенно увеличивающимися дозами ионизирующего излучения, так как данный тип воздействия обычно сопровождается индукцией фенотипических изменений метаболизма. Радиоиндуцирование радиорезистентности сопровождается увеличением нуклеотидов, содержания ДНК, антиокислительных ферментов и серосодержащих аминокислот (цистеин), которые обладают радиозащитными свойствами, что может быть использовано в дальнейшем при конструировании радиозащитных средств. Исходя из этого, был проведен опыт по искусственному повышению радиационной устойчивости у бактерии E. coli штамм «ПЛ-6», а также изучение культуральных, морфологических и ферментативных свойств у исходного и полученного радиомодифицированного микроорганизмов. В результате получен радиоустойчивый штамм кишечной палочки, способный выдержать гамма-облучение в дозе 30 кГр.
Ключевые слова: ионизирующее облучение, кишечная палочка, культура клеток, микроорганизмы, радиация.
Введение. Микроорганизмы являя-ются удобным объектом для изучения и анализа изменчивости в отличии от высших организмов. Для микробов характерны короткий цикл жизни, быстрое размножение, а также способность давать многочисленное потомство. Кроме вышеперечисленного, микроорганизмам свойственна выраженная морфология, изучение которой можно проводить визуально с помощью светового микроскопа. Микробы обладают биохимической активностью, что нетрудно учитывать при применении специализированных питательных сред.
Умение микроорганизмов изменять свои свойства под воздействием разных стресс-совых факторов окружающей среды (темпе-ратура, рентгеновское и ультрафиолетовое излучение, антибиотики, химиические фак-торы и др.) дает возможность обширно приме-нять их в качестве модели в исследованиях изменчивости.
Адаптация микроорганизмов к экстремальной среде обитания всегда проходит в сопровождении изменения биологических особенностей, что проявляется в неустойчивости
формы, размеров клеток, условий культивирования на питательных средах и ферментации. Под действием разных стрессоров микроорганизмы способны приобрести признаки, по которым и будут различаться новое модифицированное поколение от предшествующего. Это явление было названо «изменчивостью». Изучение проблемы приспособляемости и изменчивости различных видов микроорганизмов остается одной из основных в биологии, поэтому рассмотрение данного воп-роса имеет широкую теоретическую и практи-ческую значимость. Вышеописанные изме-нения могут возникнуть и в естественной среде обитания микробов, но также могут быть спровоцированы и искусственно.
Модификация микроорганизмов - это способ приспособления микробных клеток к условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться. Приобретенные свойства не являются наследст-вен-ными, так как не несут значения для эволюции, а играют роль в основном для выживания популяций микроорганизмов в условиях
стрессса [5, 7]. При возвращении к оптимальным «нестрессовым» условиям внешней среды свойства, появившиеся как адаптивная реакция на внешние раздражители, за ненадобностью исчезают. Модификация может затрагивать различные свойства микробных сообществ - морфологические, культуральные, биохимические и др.
Изменения в морфологии проявляются в преобразовании формы и размера бактериальных клеток. Например, при добавлении в питательную среду пенициллина происходит удлинение клеток некоторых бактерий. Нехватка в среде солей кальция при культивировании сибирской язвы вызывает повышенное спорообразование. При увеличении концентрации солей кальция способность к образованию спор исчезает и т.д. При продолжительном росте микробов на одной и той же питательной среде можно наблюдать явление полиморфизма, объясняемого воздействием накопленных в среде продуктов микробной жизнедеятельности.
Перемена культуральных свойств бактерий зависит и происходит при изменениях в составе питательной среды. Например, при недостатке кислорода у стафилококка пропадает свойство образования пигмента.
Модификация биохимических свойств заключается в том, что бактерии каждого вида имеют конкретный набор ферментов, с помощью которых происходит усвоение питательных веществ. Данные ферменты могут вырабатываться на строго определенных питательных субстратах и предопределены генотипом микроорганизмов.
Устойчивость к радиационному облучению, или радиорезистентность, микро-организмов формируется благодаря возмож-ности клетки регенерировать полученные радиации-онные повреждения [6]. По степени чувствительности к действию облучения виды существующих микроорганизмов находятся в следующей последовательности, начиная с САмых чувствительных: бактерии, плесени, дрожжи, споры и вирусы. Но данный порядок условный, так как согласно литературным данным, существуют виды бактерий, имеющие радиорезистентность выше, чем вирусы или споры.
Самое раннее сообщение о том, что рентгеновские лучи оказывают бактерицидное действие, появилось в начале XX века. В связи с последующими успехами в ядерной физике повысился интерес к действию ионизирующей радиации на живую клетку, включая и культуры клеток микроорганизмов.
Представители растительного и животного мира по-разному реагируют на ионизи-
рующее излучение, поэтому и их восприимчивость находится на неодинаковом уровне и значительно различается. Микроорганизмы являются более радиоустойчивыми, чем животные и растения. Средние летальные дозы для микробов выше в 1-2 раза средних летальных доз у животных. Если указанные дозы для животных находятся в пределах 4-5 Гр, то для обитателей микромира они возрастают до 50500 Гр и выше. Во многих случаях стерилизующий эффект для культуры клеток бактерий возможно достигнуть только при проведении гамма-облучения в дозах, равных 10-20 кГр.
Все известные виды микроорганизмов можно условно распределить по степени их радиочувствительности: начиная с самых чувствительных - бактерии, после которых в порядке возрастания устойчивости следуют плесени, дрожжи, споры бактерий, и заканчивая, самыми устойчивыми к действию излучений, вирусами. Как сказано выше, данное распределение является условным, так как в литературе имеются данные о некоторых видах бактерий, которые являются более стойкими к действию радиации, чем вирусы или споры.
Степень радиочувствительности микроорганизмов зависит от ряда факторов: условия при облучении, генетическая детерминированность бактериальной клетки, также на восприимчивость радиации клеткой ока-зывают влияние факторы окружающей среды: температура, наличие кислорода или других газов, качественный состав среды, в которой производится облучение. Изменение перечисленных факторов можно произвести как до самого процесса облучения, так и во время облучения, и после.
Радиорезистентность обеспечивается клеточными механизмами, которые подразделяются на 2 большие группы. К первой группе относятся такие системы, которые предотвращают образование повреждений в клетках. Вторая группа включает механизмы, восстанавливающие (репарирующие) повреждения в ДНК, вызванные облучением.
В экспериментах по повышению радиоустойчивости микроорганизмов иониизиру-ющее излучение может оказывать воздействие как индуцирующий или как селективный агент, поэтому понять вызвано ли возникновение радиорезистентных штаммов применением воздействующих доз облучения или же вышеуказанные штаммы получены в следствие отбора среди самопроизвольных мутированных клеток, которые присутствовали в культуре еще до ее радиообработки.
Известно, что грамотрицательные микроорганизмы являются более чувствительными. По литературным данным, полная инактивация культуры микроорганизма кишечной палочки штамма «ПЛ-6» наступает при облучении в дозе 25 кГр [2].
Цель работы - подбор оптимальных доз для получения радиомодификантов E. coli и изучение культуральных и ферментативных свойств.
Материалы и методы. Работа по повышению радиационной устойчивости микроорганизма была проведена в лаборатории радиационного контроля и техники ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Для проведения опытов был использован производственный штамм (Escherichia coli шт. «ПЛ-6», №1154115 эшерихиозной диареи поросят), полученный из коллекции музея штаммов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Воздействие ионизирующей радиации было произведено с помощью стации-онарной гамма-установки «Исследователь» с источником излучения Co.
Биомассу изучаемых бактерий получали методом смыва с поверхности мясопеп-тонного агара (МПА) 0,95 %-ным физиологическим раствором хлористого натрия в стерильных условиях. После получения био-массы, культуру клеток подвергали облуче-нию, затем производили посев на плотную питательную среду МПА. Культивирование производили в условиях термостата при тем-пературе 37 °С в течение 48 ч. Через первые 18 ч после
посева проводили оценку роста микроорганизма. По прохождении 48 ч снова повторяли схему опыта (смыв - облучение -посев), соблюдая условие: каждая следующая доза облучения была выше предыдущей.
Вторым этапом исследований было изучение макроморфологических, ферментативных свойств используемого штамма и полученного радиоустойчивого варианта. Для изучения ферментативных свойств исходной культуры и полученного модифицированного штамма производили посев на среду с 4 % лактозой, среду Гиса с глюкозой, маннитом, сахарозой, пробирку с индолом для определения индола, среду Олькеницкого для определения сероводо-рода, желатина и среду Симмонса. Культиви-рование микроорганизмов производили в термостате при 370 в течение 72 часов. Для определения гемолитических свойств E. coli высевали на 5 % мясопептонный кровяной агар (МПКА).
Результаты исследований. Установили, что постоянное последовательное повышение уровня дозы ионизирующего излучения, действующего на культуры клеток
E. coli шт. «ПЛ-6», привело к увеличению их радиорезистентности, о чем свидетельствует наличие роста культуры на питательных средах при многократном облучении. В результате был получен радиоустойчивый вариант исход-ного микроорганизма.
Материнская культура E. coli была подвергнута гамма-облучению 20 раз, начи-ная с первой дозы облучения 3,5 кГр и закан-чивая предпоследней дозой, при которой наблюдался рост единичных микробных колоний, 30 кГр. Путем многократного пассирования единичных колоний, выросших при дозе 30 кГр, получена культура, дающая сплошной рост колоний на МПА, что свидетельствует о развитии у тест-микроба радиорезистентности к гамма-лучам 60Co.
На каждом этапе облучения проводили микроскопирование мазков, окрашенных по Граму, определяли структурные изменения или же их отсутствие. Было выявлено, что характерным признаком при многократном облучении является изменение размера и формы бактерий - происходит их увеличение. Подобные изменения наблюдаются у большинства клеток культуры.
Клетки культуры полученного радиорезистентного штамма E. coli, так же, как и исходного необлученного, представляли собой грамотрицательные, не спорообразующие палочки, располагающиеся в мазках одиночно.
На жидкой питательной среде - мясо-пептонном бульоне (МПБ) оба варианта кишечной палочки вызывали интенсивное помутнение среды, а на МПА образовывали сочные, блестящие, вогнутые, гладкие с ровными краями колонии круглой формы.
При изучении ферментативных свойств установлено, что исходная и радиорезис-тентная культуры E. coli штамм «ПЛ-6» обладают выраженной ферментативной ак-тивностью: в первые сутки с образованием кислоты и газа разлагают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, не образуют сероводород, не разжижают желатин, не синтезируют цитраты.
При посеве на 5 %-ный МПКА было установлено, что оба варианта культуры имеют способность продуцировать фермент ß-гемо-лизин, чем объясняются появившиеся зоны просветления вокруг колоний микроба.
Заключение. Полученные результаты экспериментов дают право заключить, что устойчивость к действию ионизирующей радиации у микроорганизма E. coli «ПЛ-6» можно произвести искусственно, при воздействии гамма-излучения на исходную
культуру клеток, постепенно
ув еличивая дозу.
У радиомодифицированного варианта микроорганизма E. coli «ПЛ-6» наблюдался рост единичных колоний при дозе гамма-облучения 30 кГр.
Путем последовательного многократного радиационного воздействия на
исходный штамм E. coli «ПЛ-6» гамма-лучами в возрастающих дозах получен радио-орезистентный вариант E. coli «ПЛ-6», обладающий способностью синтезировать клюю-чевые ферменты антирадикальной защиты (каталазу, супероксиддисмутазу).
Список использованной литературы.
1. Вагин, К.Н. «Конструирование радиозащитных препаратов на основе веществ микробного, животного и неорганического происхождения» / К.Н. Вагин, Ру.Н. Низамов, М.Ю. Галлямова, К.Т. Ишмухаметов, Ра.Н. Низамов, Н.М. Василевский // Сборник статей «Доклады ТСХА» - Москва: Изд. РГАУ - МСХА, 2020. - Вып. 292. Ч. IV. - С. 199.
2. Гайнутдинов, Т.Р. «Определение устойчивости возбудителей колибактериоза к воздействию ионизирующей радиации» / Т.Р. Гайнутдинов, В.П. Шашкаров, А.М. Идрисов, Я.М. Курбангалеев, Г.Н. Спиридонов, В.А. Гурьянова // Сборник докладов международной научно-практической конференции «Ядерно-физические исследования и технологии в сельском хозяйстве» (к 50-летию со дня образования ФГБНУ ВНИИ радиологии и агроэкологии). - Обнинск, 2020. - С. 46.
3. Галлямова, М.Ю. «Радиозащитное воздействие композиционного аписогенно-монтмориллонитового препарата» / М.Ю. Галлямова, К.Т. Ишмухаметов, А.В. Фролов, А.М. Идрисов, Н.М. Василевский // Сборник «Зыкинские чтения. Материалы национальной научно-практической конференции, посвященной памяти доктора медицинских наук, профессора Л.Ф. Зыкина». Под редакцией О.С. Ларионовой, И.А. Сазоновой. - Саратов, 2020. - С. 54.
4. Иванов, А.В. Радиовакцины: проблемы и перспективы / А.В. Иванов, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов. - Казань: Изд-во Казанск. гос. ун-та, 2008. - 499 с. - ISBN 978-5-98180-580-6.
5. Иванов, А.В. Радиоэкотоксикологическая микробиология / А.В. Иванов, Р.Н. Низамов, Э.М. Плотникова, И.К. Абдрахманов. - М.: Колос, 2009. - 680 с. - ISBN 978-5-10-003961-7.
6. Конюхов, Г.В. Биотехнология и ее значение в создании радиозащитных препаратов / Г.В. Конюхов, Р.Н. Низамов, Н.Б. Тарасова, К.Н. Вагин, Р.Р. Гайзатуллин // Ветеринарный врач. -2011. -N 6. - С. 24-28.
7. Москалев, А.А. Генетические исследования влияния ионизирующей радиации в малых дозах на продолжительность жизни / А.А. Москалев // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48. -N 2. - С. 139-145.
8. Низамов, Р.Н. Использование препаратов природного и микробного происхождения в качестве радиозащитных средств / Р.Н. Низамов, В.П. Шашкаров, Т.Р. Гайнутдинов, В.А. Гурьянова, А.М. Идрисов, Д.Н. Мингалеев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2020. - Т. 243. - N 3. - С. 182.
9. Sadykov, N.S. Features of isolation of the anthrax pathogen depending on the type of nutrient medium / N.S. Sadykov, R.N. Nizamov, E.N. Mustafina, M.Yu. Gallyamova, T.R. Mustafin, A. K. Galiullin, I.I. Zadorina, S.Yu. Smolentsev // International journal of research in pharmaceutical sciences. -2020. - N 11(3). - P. 4318.
10. Nikitin, A.I. Study of radioprotective properties of E. coli metabolites / A.I. Nikitin, R.R. Gaizatullin, G.V. Koniukhov, R.N. Nizamov, N.B. Tarasova, K.N. Vagin // International Journal of Pharmacy and Technology. - 2016. - T. 8. - N 2. - P. 14338.
E. COLI PHENOTYPIC VARIABILITY INDUCED BY GAMMA RAYS 60CO
M. Yu. Gallyamova, K. N. Vagin - Candidate of Biological Sciences, R. N. Nizamov - Doctor of Veterinary Sciences, Professor, T. R. Gainutdinov - Candidate of Biological Sciences, N. M. Vasilevsky -Doctor of Veterinary Sciences, Professor, A.M. Idrisov - Candidate of Veterinary Sciences, G.I. Rakhmatullina
- Candidate of Biological Sciences
FSBNU "Federal Center for Toxicological, radiation and biological safety, " 420075, Kazan, Scientific town-2, e-mail: vnivi@mail.ru
Using small doses of gamma radiation or gradually increasing, it is possible to increase the initial radioresistance of microorganisms. Directed bacterial evolution can serve as a tool in determining the
molecular basis of adaptation to stress or new environmental factors. In the experiment, we used repeated exposure to gradually increasing doses of ionizing radiation, since this type of exposure is usually accompanied by the induction of phenotypic changes in metabolism. Radioinducing radioresistance is accompanied by an increase in nucleotides, DNA content, antioxidant enzymes and sulfur-containing amino acids (cysteine), which have radioprotective properties, which can be used in the future in the design of radioprotective agents. Based on this, we conducted an experiment on artificially increasing radiation resistance in the E. coli strain "PL-6", as well as studying the cultural, morphological and enzymatic properties of the original and the resulting radio-modified microorganisms. As a result, a radiation-resistant strain of Escherichia coli was obtained, which can withstand gamma radiation at a dose of 30 kGy.
Keywords: ionizing radiation, E. coli, cell culture, microorganisms, radiation.
References
1. Vagin, K.N. Design of radioprotective preparations based on substances of microbial, animal and inorganic origin / K.N. Vagin, Ru.N. Nizamov, M.Yu. Gallyamova, K.T. Ishmuhametov, Ra.N. Nizamov, N.M. Vasilevskij // Doklady TSKHA: Sbornik statej. Vypusk 292. N IV. - Moskva: Izd. RGAU - MSKHA, 2020. -P. 199.
2. Gainutdinov, T.R. Determination of the resistance of colibacteriosis pathogens to ionizing radiation / T.R. Gajnutdinov, V.P. SHashkarov, A.M. Idrisov, Ya.M. Kurbangaleev, G.N. Spiridonov, V.A. Gur'yanova // YAderno-fizicheskie issledovaniya i tekhnologii v sel'skom hozyajstve (k 50-letiyu so dnya obrazovaniya FGBNU VNII radiologii i agroekologii): sbornik dokladov mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii. Obninsk, 2020. - P. 46.
3. Gallyamova, M.Yu. Radioprotective effect of composite apisogenic-montmorillonite preparation / M.Yu. Gallyamova, K.T. Ishmuhametov, A.V. Frolov, A.M.I drisov, N.M. Vasilevskij // V sbornike: Zykinskie chteniya. Materialy nacional'noj nauchno-prakticheskoj konferencii, posvyashchennoj pamyati doktora medicinskih nauk, professora L.F. Zykina. Pod redakciej O.S. Larionovoj, I.A. Sazonovoj. Saratov, 2020. -P. 54.
4. Ivanov, A.V. Radio vaccines: problems and prospects / A.V. Ivanov, R.N. Nizamov, G.V. Konyuhov // Kazan: Izd-vo Kazansk. gos. un-ta, 2008. - 499 p.
5. Ivanov, A.V. Radioecotoxicological microbiology / A.V. Ivanov, R.N. Nizamov, E.M. Plotnikova, I.K. Abdrahmanov // M.: Kolos. 2009. - 680 p.
6. Konyuhov, G.V. Biotechnology and its significance in the development of radioprotective drugs / G.V. Konyuhov, R.N. Nizamov, N.B. Tarasova, K.N. Vagin, R.R. Gajzatullin // Veterinarian. - 2011. - № 6. -P. 24.
7. Moskalev, A.A. Genetic studies of the effect of low-dose ionizing radiation on life expectancy / A.A. Moskalev // Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya. 2008. - T. 48. - №2. - P. 139.
8. Nizamov, R.N. Use of preparations of natural and microbial origin as radioprotective agents / R.N. Nizamov, V.P. SHashkarov, T.R. Gajnutdinov, V.A. Gur'yanova, A.M. Idrisov, D.N. Mingaleev // Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akademii veterinarnoj mediciny im. N.E. Baumana. 2020. - T. 243. - №3. - P. 182.
9. Nariman S. Sadykov, Ramzi N. Nizamov, Elmira N. Mustafina, Marina Yu. Gallyamova, Timur R. Mustafin, Albert K. Galiullin, Iva I. Zadorina, Sergey Yu. Smolentsev. Features of isolation of the anthrax pathogen depending on the type of nutrient medium. International journal of research in pharmaceutical sciences, 2020, 11(3), 4318.
10. Nikitin, A.I. Study of radioprotective properties of E. coli metabolites / A.I. Nikitin, R.R. Gaizatullin, G.V. Koniukhov, R.N. Nizamov, N.B. Tarasova, K.N. Vagin // International Journal of Pharmacy and Technology. 2016. - T. 8. - №2. - P. 14338.
