CC BY
91
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 181-185.
УДК 577.13 : 582.623.2
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА SALIX (SALICACEAE) АЗИАТСКОЙ РОССИИ
© А.А. Петрук
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолинская,
101, Новосибирск, 630090 (Россия), e-mail: [email protected]
Определены состав и содержание фенольных соединений у 10 дикорастущих видов рода Salix из различных регионов Сибири и Дальнего Востока России, Показано, что изученные виды значительно различаются по количественному и качественному составу флавоноидов и дубильных веществ,
Ключевые слова: флавоноиды, дубильные вещества, кверцетин, кемпферол, лютеолин, апигенин, Salix,
Введение
Фенольные соединения являются основными компонентами многих лекарственных препаратов с широким диапазоном фармакологического действия. За последнее время вышло значительное количество работ, посвященных поиску растений, которые могут быть источником фенольных соединений, в частности, флавоноидов, обладающих различным биологическим действием, например, антимикробным, капилляроукрепляющим, гепатопротекторным и др. [1, 2].
Представители рода Ива (Salix L.) - одни из самых популярных древесных растений, которые используются как в народной, так и в традиционной медицине. Препараты на основе коры ивы обладают широким спектром биологической активности, проявляют прежде всего жаропонижающее, болеутоляющее, противоревматическое, противомалярийное действие, а также вяжущее, гемостатическое, диуретическое, антибактериальное и антигельминтное. В связи с этим представителей рода Salix активно исследуют на качественный состав и содержание фенольных соединений. Использование в качестве сырья коры, а не листьев или соцветий, объясняется содержанием в ней наибольшей концентрации фенольных соединений. Лечебные свойства ивы обусловлены наличием в сырье дубильных веществ, а также салицина, лютеолина, нарингенина, кверцетина, кемпферола, апигенина, рутина, триандрина, вималина и др. [3]. Основным активным соединением, благодаря которому ива стала столь популярной в медицине, является салицин. Это соединение фенольной природы, терапевтическое значение которого основано на окислении салицина в организме в салициловую кислоту. Производные салициловой кислоты используют как жаропонижающие, противоревматические, противовоспалительные и болеутоляющие средства [3, 4]. С появлением синтетически синтезированной салициловой кислоты применение ивовой коры ослабло. Однако на сегодняшний день во многих странах мира кора ивы является одним из компонентов противоревматических и противолихорадочных лекарственных препаратов. Наиболее используемые в качестве сырья виды - это довольно распространенные ива белая (S. alba L. ) и ива остролистная (S. acutifolia Willd.) [4].
Цель нашего исследования - изучение содержания и состава флавоноидов и дубильных веществ в листьях представителей рода Salix Азиатской России: Сибири и Дальнего Востока, уже нашедших свое применение в фармакологии, а также других видов ив, применяющихся только в народной медицине: S. acutifolia, S. berberifolia Pall., S. krylovii E. Wolf, S. myrtilloides L., S. nummularia Andersson, S. pyrolifolia Ledeb., S. recur-vigemmis A.K. Skvortsov, S. saxatilis Turcz. ex Ledeb., S. sphenophylla A.K. Skvortsov и S. vestita Pursh.
Экспериментальная часть
Материалом для работы послужили собственные сборы автора на территории Западной и Восточной Сибири (Алтайский край, Республика Бурятия, Иркутская область) и гербарные образцы из коллекции Гербария им. М.Г. Попова (NSK).
Количественное определение флавоноидов проводили по методике, основанной на способе В.В. Беликова, в котором использована реакция комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия [5]. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания флавоноидов в листьях осуществляем следующим образом. Точную навеску воздушно-сухого сырья (около 0,5 г), измельченного и просеянного через сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в колбу вместимостью 100 мл и исчерпывающе экстрагировали 70% этиловым спиртом, контролируя полноту экстракции реакцией с 5% раствором NaOH (до исчезновения желтой окраски), далее измеряли объем профильтрованного объединенного экстракта. Затем в мерную пробирку вносили 0,1 мл экстракта, приливали 0,2 мл 2% раствора AlCl3 в 96% этиловом спирте и доводили объем до 5 мл этанолом такой же концентрации. В контрольном варианте к 0,1 мл экстракта приливали 1-2 капли 30% уксусной кислоты и доводили объем до 5 мл. Растворы перемешивали и через 40 мин измеряли оптическую плотность с хлоридом алюминия на спектрофотометре СФ-26 при 415 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя для сравнения раствор с кислотой. Суммарное содержание флавоноидов (x, в процентах от массы воздушно-сухого сырья) определяли как:
Y х V х V х 100
x(%) =------------------,
M х V3 х 1000000
где Y - содержание флавоноидов в 1 мл испытываемого раствора, найденное по калибровочному графику, построенному по рутину, мкг; V1 - объем экстракта, мл; V2 - объем разведения, мл; V3 - объем экстракта, взятый для анализа, мл; М - масса воздушно-сухого сырья, г. Ошибка определения составляет ± 0,4%.
Количественное определение дубильных веществ проводили весовым способом по методу Левента-ля, путем окисления перманганатом калия в присутствии индигокармина. На реакцию брали 5 мл вытяжки, добавляли 10 мл индигокармина и доводили водой до 300 мл с последующим титрованием 0,01 н KMnO4. Расчет производили по формуле
_ (a - b) х 4,157 х V х 100 _ n X V X 1000 ,
где а - объем раствора KMnO4, израсходованного на титрование, мл; b - объем раствора KMnO4, израсходованного на титрование в контрольном опыте, мл; 4,157 - количество дубильных веществ, соответствующее 1 мл
0,01 н KMnO4, мг; V - общий объем извлечения, мл; n - масса сырья, мг; V1 - объем, взятый на титрование, мл.
Анализ агликонов, образующихся после кислотного гидролиза соответствующих гликозидов, осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на аналитической ВЭЖХ-системе, состоящей из жидкостного храмотографа «Agilent 1200» с диодноматричным детектором и системы для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation. Разделение проводили на колонке Zorbax SB-C1S размером 4,6^150 мм, с диаметром частиц 5 мкм, применив градиентный режим элюирования. В подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0,1%) изменялось от 50 до 52% за 1S мин. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура колонки 26 °С. Объем вводимой пробы 5 мкл. Детектирование осуществляли при X = 360 нм. Для приготовления подвижных фаз использовали метиловый спирт (ос. ч.), ортофосфорную кислоту (ос. ч.), бидистиллированную деионизированную воду. Для приготовления стандартных образцов применяли образцы кверцетина, апигенина, лютеолина и кемпферола производства фирмы «Fluka». Стандартные растворы готовили в концентрации 10 мкг/мл в этиловом спирте.
Для извлечения флавоноидов проводили исчерпывающую экстракцию 70% этанолом при нагревании на водяной бане. Кислотный гидролиз осуществляли следующим образом: к 0,5 мл водно-этанольного извлечения прибавляли 0,5 мл HCl (2 н) и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения гидролизат разбавляли бидистиллированной водой до объема 5 мл и пропускали через концентрирующий патрон Диапак С16 (ЗАО «БиоХимМак») для освобождения от примесей гидрофильной природы. Агликоны смывали 96% этанолом, измеряли объем элюата и пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Количественное определение индивидуальных агликонов в элюатах проводили по методу внешнего стандарта. Содержание индивидуальных компонентов (Сх) вычисляли по формуле (в %):
а = Сст
Sj X V X V2 X100
S2 X M X (100 - B)
где Сст - концентрация соответствующего раствора флавонола, мкг/мл; Si - площадь пика флавонола в анализируемой пробе, е.о.п.; V1 - объем элюата после вымывания флавонолов с концентрирующего патрона, мл; V2 - общий объем экстракта, мл; М - масса навески, мг; В - влажность сырья, %.
Подробное описание методики пробоподготовки, анализа и расчетов приведено в работе [6].
Обсуждениерезультатов
В таблице 1 представлены результаты определения содержания флавоноидов и дубильных веществ в образцах листьев представителей рода Salix, собранных в различных регионах Сибири и Дальнего Востока (Магаданская область).
Содержание флавоноидов в листьях исследованных видов находилось в пределах от 1,48 (S. pyrolifolia) до 6,33% (S. myrtilloides). Для шести видов из различных регионов Азиатской России определено содержание флавоноидов более 3%: S. acutifolia, S. vestita, S. myrtilloides, S. nummularia, S. saxatilis и S. sphenophylla. Низкое содержание фенольных соединений отмечено только у S. pyrolifolia из Иркутской области. Содержание дубильных веществ варьировало от 3,33 (S. acutifolia) до 19,95% (S. sphenophylla). Наибольшее количество дубильных веществ (более 10%) отмечено у растений четырех видов: S. myrtilloides, S. recurvigemmis, S. krylovii и S. sphenophylla. S. sphenophylla из Магаданской области и S. myrtilloides из Бурятии характеризуются наибольшей концентрацией как дубильных веществ, так и флавоноидов.
Таблица 1. Содержание флавоноидов и дубильных веществ в листьях растений некоторых видов рода Salix (% от абсолютно-сухой массы)
Вид Район, место и дата сбора Содержание флавоноидов Содержание дубильных веществ
Алтайский край
S. acutifolia Павловский район, с, Колыванское, закустаренный берег р. Волгарихи; 20,07,2009 3,4S 3,33
Республика Алтай
S. vestita Кош-Агачский район, Северо-Чуйский хребет, истоки р. Актуру, морена ледника Мал. Актру, высота 2131мн.у.м.; 17.08.2006 4,2S S,31
Республика Бурятия
S. berberifolia Окинский район, истоки р. Иркут, окрестности оз. Ильчир, каменистая мохово-лишайниковаятундра у ручья, высота 1977 мн.у.м.; 21.08.2007 2,1S 9,9S
S. myrtilloides Окинский район, истоки р. Иркут, окрестности оз. Ильчир, каменистолишайниковая тундра, на левом, закустаренном берегу реки, высота 1954 мн.у.м., 21.08.2007 6,33 14,97
S. nummularia Окинский район, истоки р. Иркут, окрестности озера Ильчир, на каменистом супесчаном берегу реки, высота 1959 м н.у.м.; 22.08.2007 3,60 S,31
S. recurvigemmis Окинский район, истоки р. Иркут, окрестности озера Ильчир, на закустаренном сухом склоне, высота 1977 мн.у.м., 21.08.2007 2,1S 10,S1
S. saxatilis Тункинский район, окрестности курорта Аршан, на левом, каменистом берегу р. Кынгарги, высота 926 м н.у.м.; 10.08.2007 4,9S 6,65
Иркутская область
S. krylovii Ольхонский район, Прибайкальский нац. парк, Байкальский хребет, долина р. Кочерикова, высота 1184 мн.у.м.; 22.08.2007 2,1S 11,64
S. pyrolifolia Ольхонский район, Прибайкальский нац. парк, Приморский хребет, долина р. Сарма, на закустаренном приречном лугу, высота 512 м н.у.м.; 15.07.2007 1,4S 7,4S
Магаданская область
S. sphenophylla Ольский район, окрестности мыса Нюкля, побережье Охотского моря, мохово-ерниковая тундра; 24.07.2008 4,2S 19,95
С помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) установили состав и содержание агликонов флавонолов - кверцетина и кемпферола и флавонов - лютеолина и апигенина. Апи-генин найден у двух видов - S. recurvigemmis и S. saxatilis, лютеолин - у шести: S. acutifolia, S. vestita, S. berberifolia, S. myrtilloides, S. saxatilis и S. pyrolifolia. Кемпферол присутствует только у S. recurvigemmis. Преобладающим или основным агликоном каждого вида был либо флавонол, либо флавон: у S. myrtilloides, S. nummularia, S. recurvigemmis и S. sphenophylla - кверцетин (рис. 1, 3), у - S. acutifolia (рис. 2, 3),
S. pyrolifolia, S. vestita, и S. saxatilis - лютеолин. Одновременное присутствие флавона и флавонола (кверцетина и лютеолина) характерно для четырех видов: S. myrtilloides, S. berberifolia и S. vestita. Только у одного вида, S. recurvigemmis, были обнаружены три агликона: кверцетин, кемпферол и апигенин.
Некоторые различия были и по содержанию агликонов флавоноидов (табл. 2). Содержание кверцетина находилось в пределах от 0,46 (S. berberifolia) до 1,S5% (S. nummularia), лютеолина - от 0,14 (S. myrtilloides) до 1,31% (S. berberifolia).
Таблица 2. Количественное содержание агликонов в листьях растений некоторых видов рода &аИх (% от абсолютно-сухой массы)
Кверцетин - 0,S3 0,46 0,53 1,S5 0,S4 - 0,15 - 1,46
Кемпферол - - - - - 0,51 - - - -
Флавоны
Лютеолин 0,24 0,S7 1,31 0,14 - - 0,41 - 0,9S -
Апигенин - - - - - 0,27 0,40 - - -
-----------------1----------1---------1----------1---------1----------1---------1---------1---------------1
п----------1--------1---------1--------1---------1--------1---------1--------1---------------- 8 10 min
4 6 8 min
Рис. 1. ВЭЖХ-хроматограмма гидролизата экстракта листьев & пишши1аг1а. По оси абцисс -время удерживания, по оси ординат - оптическая плотность. 1 - кверцетин (5,9 мин)
Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограмма гидролизата экстракта листьев S. acutifolia. По оси абцисс -время удерживания, по оси ординат - оптическая плотность. 1 - лютеолин (8,3 мин)
mAU 2 -
6 S 10 min
Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограмма гидролизата экстракта листьев & ЬетЬеп/оНа. По оси абцисс -время удерживания, по оси ординат - оптическая плотность. 1 - кверцетин (6,3 мин), 2 - лютеолин (8,5 мин)
Выводы
1. При анализе полученных результатов установлено, что по количественному и качественному составу флавоноидов и дубильных веществ, представители рода Salix, произрастающие в разных регионах Азиатской России, значительно различаются.
2. В составе флавоноидов обнаружены агликоны кемпферол, лютеолин, кверцетин, апигенин. Преобладающими из них являются кверцетин и лютеолин.
Список литературы
1, Биохимия фенольных соединений : пер. с англ. / под ред. Дж. Харборна М., 196S, 452 с.
2, Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях, М., 1994, 240 с.
3, Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование, Семейства Paeoniaceae-Thymelaeaceae / отв. ред. П.Д. Соколов, Л,, 19S6, 336 с.
4, Зузук Б.М., Куцик Р.В., Недоступ А.Т., Хоменец И.З., Пермяков В.В., Федущак Н.К Ива белая Salix alba L, Аналитический обзор // Провизор, 2005, №16, С. 27-29,
5, Беликов В.В. Методы анализа флавоноидных соединений // Фармация, 1970, №1, С. 6S,
6, Храмова Е.П., Комаревцева Е.К Изменчивость флавоноидного состава листьев Potentilla fruticosa (Rosaceae) разных возрастных состояний в условияхГорного Алтая // Растительные ресурсы, 200S, Т. 44, №3, С. 96-102,
Поступило в редакцию 23 сентября 2010 г.
