CC BY
25
DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-89-96
УДК 616.932(470)
д.А. левченко, В.д. кругликов, н.Е. Гаевская, А.с. Водопьянов, н.Б. непомнящая
фено- и генотипические особенности нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения, изолированных на территории россии
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону, Российская Федерация
цель. Анализ фенотипической характеристики и выявление особенностей генотипической организации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, имеющих различное происхождение и изолированных на территории России. материалы и методы. Использована выборка из 548 нетоксигенных штаммов, полученная с помощью авторской пополняемой ГИС «Холера 1989-2014». ПЦР-генотипирование проводили в соответствии со «Способом идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы с помощью ПЦР для выделения генетических детерминант». Кластерный анализ проводили с использованием метода UPGMA. Построение дендрограммы осуществляли с помощью программы MEGA 5. результаты и обсуждение. Показана типичность штаммов V. cholerae по культурально-морфологическим, серологическим и биохимическим свойствам. Выявлена изменчивость изучаемых штаммов по признаку фаголизабельности. Определены уникальные фаготипы, ранее не встречавшиеся на территории России. Популяция нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы была генетически однородной в отличие от изолятов V. cholerae O1 El Tor и имела идентичные ПЦР-генотипы. Показана универсальность метода ПЦР-генотипирования по 14 генам-мишеням, позволяющего дифференцировать изученные штаммы V. cholerae 01 и O139, а также выявлять различия среди штаммов 0139, выделенных в различных географических регионах страны.
Ключевые слова: холерный вибрион, фено- и генотип, нетоксигенные штаммы, объекты окружающей среды.
Корреспондирующий автор: Левченко Дарья Александровна, e-mail: levchenko_da@antiplague.ru.
Для цитирования: Левченко Д.А., Кругликов В.Д., Гаевская Н.Е., Водопьянов А.С., Непомнящая Н.Б. Фено- и генотипические особенности нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения, изолированных на территории России. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 3:89-96. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-89-96
Поступила 20.11.19. Отправлена на доработку 27.01.20. Принята к публ. 25.03.20.
D.A. Levchen^, V.D. Kruglikov, N.E. Gaevskaya, A.S. Vodop'yanov, N.B. Nepomnyashchaya
Pheno- and Genotypical Features of Non-Toxigenic Strains of Cholera Vibrios of Different Origins, Isolated in the Territory of Russia
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation
Abstract. Aim. Analysis of the phenotypic characteristics and identification of peculiarities of the genotypic organization in non-toxigenic strains of cholera vibrios having different origin, isolated in Russia. Materials and methods. A sample of 548 non-toxigenic strains obtained using the author's updated GIS "Cholera 1989-2014" was used. PCR genotyping was carried out in accordance with the patented "Method for the identification of non-toxigenic strains of cholera vibrio O1 serogroup using PCR to isolate genetic determinants." Cluster analysis was performed applying the UPGMA method. The dendrogram was constructed using MEGA 5 software package. Results and discussion. Representative cultural-morphological, serological and biochemical properties of V. cholerae strains have been specified. The variability of the studied strains on the basis of phagolizability has been revealed. Unique phage-types not previously encountered in Russia have been identified. The population of non-toxigenic strains of cholera vibrio O139 serogroup is genetically homogeneous in contrast to V. cholerae O1 El Tor isolates and has identical PCR genotypes. The universality of the PCR genotyping by 14 target genes has been shown to differentiate the studied strains of V. cholerae O1 and O139, as well as to identify disparities among O139 strains isolated in different geographical regions of the country.
Key words: Vibrio cholerae, pheno- and genotype, non-toxigenic strains, environmental objects.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Dar'ya А. Levchento, e-mail: levchenko_da@antiplague.ru.
Citation: Levchento D.A., Kruglikov V.D., Gaevskaya N.E., Vodop'yanov A.S., Nepomnyashchaya N.B. Pheno- and Genotypical Features of Non-Toxigenic Strains of Cholera Vibrios of Different Origins, Isolated in the Territory of Russia. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; 3:89-96 (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2020-3-89-96
Received 20.11.19. Revised 27.01.20. Accepted 25.03.20.
Levchento D.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5073-2918
Kruglikov V.D., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4749-3837
Gaevskaya N.E., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0762-3628
Vodop'yanov A.S., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8884-9681
Nepomnyashchaya N.B., ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0868-6791
Территория Российской Федерации (РФ) не яв- водными экосистемами, такими как реки Волга, Обь, ляется эндемичной по холере. В ряде субъектов с Амур, Дон, Нева, Таганрогский залив и др., обнару-
живались единичные токсигенные штаммы V. chole-rae 01 (заносы) и периодически регистрировалось выделение нетоксигенных штаммов V. cholerae 01 и 0139, а также отмечалось их переживание на протяжении летнего периода, что указывает на необходимость выявления потенциальных и реальных рисков контаминации холерными вибрионами данных серо-групп водных объектов окружающей среды (00С) [1]. В связи с этим прогноз по холере на 2020 г. для России определяют как неблагоприятный, что обусловлено потенциальными рисками завоза болезни, связанными с посещением стран, неблагополучных по холере [2].
Установлено, что штаммы V. cholerae, выделяемые из 00С в РФ, могут рассматриваться как резервуар генов факторов патогенности [3]. Отмечено появление в окружающей среде клонов, не имеющих полного кластера коровой области СТХф, но содержащих остров патогенности VPI-1. Считается, что штаммы, имеющие ген tcpA, могут явиться этиологическим фактором спорадических случаев или вспышек острых кишечных инфекций (ОКИ). Так, в различных регионах РФ зарегистрированы случаи выделения нетоксигенных штаммов V. cholerae 01 биовара El Tor от людей, в том числе содержащих ген токсин-корегулируемых пилей (TCP), обеспечивающих колонизацию тонкого кишечника [4, 5].
Помимо токсинов, холерные вибрионы продуцируют множество других факторов, связанных с па-тогенностью или персистенцией вне организма хозяина. Это, прежде всего, пили адгезии и ферменты патогенности, такие, например, как нейраминидаза и ген (nanH), который находится в центральной части острова патогенности VPI-2 [6, 16].
в конце прошлого и в нынешнем веке на территориях различных субъектов России установлены случаи контаминации нетоксигенными штаммами V. cholerae 0139 поверхностных водоемов, используемых в качестве источников водоснабжения и водопользования. Штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы разного происхождения отличались по своим генетическим свойствам. Изоляты, полученные от больных, характеризовались полным набором генов патогенности (ctxAB, zot, ace, tcpA, toxT и toxR), в то же время штаммы, выделенные из 00С, не имели генов токсигенности, но содержали регу-ляторный ген (toxR) и ген гемагглютинин-протеазы hap [7].
0дной из задач эпидемиологического анализа является выявление генетических связей между штаммами V. cholerae со сходными фенотипически-ми свойствами, имеющими различное происхождение, методом молекулярного типирования, который позволит в кротчайшие сроки выявить различия сравниваемых штаммов холерных вибрионов.
Цель исследования состояла в изучении фено-типической характеристики и выявлении особенностей генотипической организации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, имеющих различ-
ное происхождение, изолированных на территории России.
Материалы и методы
Для осуществления сравнительного анализа использовали выборку из 548 нетоксигенных штаммов, из которых 538 штаммов V. cholerae 01 и 0139 выделены из 00С, а 10 культур холерных вибрионов 01 изолированы от людей. Комплексная информация о фено- и генотипической организации водных штаммов (с привязкой к территории) получена с помощью авторской пополняемой ГИС «Холера 19892014». При отборе клинических штаммов использовались первичные документы (паспорта штаммов). идентификацию микроорганизмов осуществляли в соответствии с МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры». ПЦР-генотипирование проводили в соответствии со «способом идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы с помощью пцр для выделения генетических детерминант» (Патент на изобретение № 2665542). Кластерный анализ, отражающий филогенетические связи штаммов по распределению ПЦР-генотипов, проводили с использованием метода UPGMA. Построение дендрограммы осуществляли с помощью программы MEGA 5 [8, 9].
Результаты и обсуждение
В результате проведенного исследования установлено, что культуры V. cholerae O1 в основном являлись типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам. К се-ровару Ogawa принадлежали 272 штамма (51,7 %), к серовару Inaba - 243 штамма (46,2 %), к серовару Hikojima - 2 штамма (0,4 %), а к R-варианту относились 9 штаммов (1,7 %). У 22 штаммов V. cholerae (4,1 %) выявлена принадлежность к 0139 серогруп-пе. К биовару El Tor отнесены 526 (96,0 %) штаммов по ряду тестов, а именно: по возможности образовывать ацетилметилкарбинол в реакции Фогеса -Проскауэра, а также по определению биовароспеци-фичных маркеров методом ПЦР (ctxB, rtxC, cas3).
В последние годы регистрируется высокая устойчивость выделяемых штаммов холерных вибрионов к холерному диагностическому бактериофагу эльтор. Атипичность по признаку фаголиза-бельности определена у 455 штаммов (83,0 %). В ряде публикаций показано, что вероятными причинами изменения фагочувствительности холерных вибрионов к диагностическим бактериофагам являются генетические изменения штаммов V. cholerae El Tor [10-12].
По результатам фаготипирования штаммов холерных вибрионов установлены 14 различных фаго-типов. В ходе проведенного анализа удалось установить принадлежность к определенному фаготипу у 82 (15,0 %) штаммов V. cholerae 01 El Tor. При анализе
82 штаммов с установленным фаготипом выявлено, что наибольшее количество культур принадлежало к фаготипу 13 (28 штаммов - 34,6 %). Так, фаготип 13 встречался на территориях Ростовской области (2002, 2007, 2011 гг.), Республики Калмыкия (2003, 2011, 2012, 2013, 2015 гг.), Хабаровского края (2013 г.), Ленинградской (2002 г.) и Новгородской (2002 г.) областей. Наряду с этим выявлены уникальные фаготи-пы, ранее не встречавшиеся на территории России: фаготип 7 (Приморский край, 2017 г.), фаготип 8 (Хабаровский край, 2016 г.), фаготип 14 (Ростовская область, 2007 г.), фаготип 18 (Забайкальский край, 2018 г.) и фаготип 20 (Кировская область, 2018 г.).
Дальнейший этап работы заключался в анализе результатов ПЦР-генотипирования нетоксиген-ных штаммов холерных вибрионов (по 14 генам-мишеням). В результате определены кластеры/генотипы исследуемых штаммов. при исследовании 548 нетоксигенных штаммов V. cholerae выявлено 105 генотипов, объединенных в 13 кластеров (таблица).
Особый интерес представляли нетоксигенные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы с генетической характеристикой ctxA-tcpA+. В ряде публикаций установлена филогенетическая связь между штаммами V. cholerae ctxA-tcpA+ и ctxA-tcpA~ на основе SNP-типирования [13, 14]. Однако в исследованиях Н.И. Смирновой и соавт. показано, что нетоксигенные штаммы ctxA-tcpA+VSP- и ctxA-tcpA-VSP~ относятся к двум филогенетически обособленным группам [15].
по результатам данного исследования выявлено, что нетоксигенные штаммы V. cholerae ctxA-tcpA+ об-
разовали две количественно схожие группы. Первая группа, состоящая из 37 изолятов (54,4 %), включала 20 генотипов, объединенных в шесть кластеров ф, Е, F, G, Н и I), и была представлена только штаммами V. cholerae 01 с генетической характеристикой ctxA-tcpA+. Изоляты этой группы характеризовались различным набором генов, причем у шести штаммов (8,8 %) выявлен редко встречающийся ген термостабильного токсина (stn/sto). Особенностью данной группы явилось наличие генов системы секреции шестого типа T6SS (acd-vgrG1, pbd-vgrG3, vasK) у 95,0 %, а также генов rtxC - активатора MARTX и активного домена MARTX (acd-rtxA) у 43,2 % штаммов холерных вибрионов. Вторую группу составил 31 штамм (45,6 %), все штаммы данной группы состояли из семи генотипов (два кластера - А и С) и входили в общие кластеры с культурами ctxA-tcpA~. Наибольший интерес вызвали штаммы V. chole-rae О1, образовавшие кластер С (27 штаммов). Отличительной чертой изолятов данного кластера явилась их гетерогенность. Однако у всех штаммов холерных вибрионов выявлен структурный ген системы секреции шестого типа T6SS (vasK); у 77,8 % (21 штамм) обнаружен ген маннозочувствительных пилей адгезии (mshA); у 29,6 % (восемь штаммов) присутствовали гены кластера системы секреции третьего типа T3SS (vcsN2, vspD). У этих штаммов не выявлены гены rtxC - активатора MARTX и активного домена MARTX (acd-rtxA), ген rstA (RS1-элемента), а также ген термостабильного токсина (stn/sto). Остальные гены представлены различным сочетанием (рис. 1).
Генотипическая характеристика штаммов V. cholerae, выделенных на территории Российской Федерации Genotypic characteristics of V. cholerae strains isolated in the territory of the Russian Federation
Кластер Cluster RS1, RS2 VPI-I VPI-2 MARTX T6SS T3SS mshA stn/sto Кол-во штаммов Number of strains
Ген Gene ПЦР-кластер""--. (генотип) PCR cluster (genotype)4--.. rstA tcpAelt int nanH vce rtxC acd-rtxA acd-vgrG1 pbd-vgrG3 vasK vcsN2 vspD
А (A1-A41) - +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- + - - +/- +/- 193
В (B1-B7) - - +/- +/- - +/- +/- - - +/- +/- - + - 128
С (C1-C9) - +/- + + +/- + +/- +/- - + +/- +/- +/- - 40
D (D1) - + + - + + - - - + - - - + 1
E (E1-E7) +/- + + + +/- +/- + + + + - - +/- - 20
F(F1-F3) - + +/- +/- - + + + + + - - + +/- 3
G (G1) + + - + - + + + - + - - - - 1
H (H1-H6) +/- + + + +/- + + + + + + + +/- +/- 10
I(I1-I2) - + +/- + + + + + + + + + - + 2
J (J1) - - - + + + - + - + + + - - 1
K (K1-K15) +/- - +/- +/- +/- + +/- +/- +/- + + + +/- +/- 90
L (L1-L11) - - + +/- +/- +/- +/- +/- +/- + + + +/- +/- 58
M (M1) - - + + - - + - - - + + - - 1
Итого: Total: 548
Рис. 1. Дендрограмма ПЦР-генотипов штаммов холерных вибрионов, выделенных из ООС и от людей на территории России:
серым цветом выделены нетоксигенные штаммы V. cholerae O1 El Tor ctxA-tcpA+; черным цветом - нетоксигенные штаммы с генетической характеристикой как ctxA-tcpA+, так и ctxA-tcpA~; темно-серым цветом -штаммы с генетической характеристикой ctxA-tcpA-
Fig. 1. Dendrogram of PCR genotypes of cholera vibrio strains isolated from environmental objects and from people in Russia:
the first group of strains is highlighted in gray (non-toxigenic strains of V. cholerae O1 El Tor ctxA-tcpA+). Black color indicates the second group of non-toxigenic strains of cholera vibrios with a genetic characteristic of both, ctxA-tcpA+ and ctxA-tcpA~. Dark gray color indicates strains with the genetic characteristic ctxA-tcpA-
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что выявленные штаммы холерных вибрионов 01 серогруппы с генетической характеристикой ctxA-tcpA+ и ctxA-tcpA- на различных территориях РФ, по всей видимости, способны к сохранению в водной среде в течение продолжительного времени и, возможно, имеют заносное происхождение.
К числу факторов патогенности холерных вибрионов относят нейраминидазу, которая может
играть определенную роль в развитии легкой формы инфекции или кратковременного носительства [6]. Так, при отсутствии заболеваемости холерой отмечается разнообразие структуры генома по наличию гена nanH среди холерных вибрионов, выделенных из ООС. NanH-положительными оказались 77,5 % (417 из 548) исследуемых штаммов. Важно отметить, что, по данным полногеномного секвенирования, ну-клеотидная последовательность этого гена у многих нетоксигенных штаммов V. cholerae O1, выделенных из ООС на территории в России, изменена [15].
Присутствие генов фермента нейраминидазы в геноме штаммов холерных вибрионов разного происхождения, возможно, связано с тем, что продукт этого гена необходим вибриону не только во время инфекционного процесса, но и при адаптации микроорганизма к условиям среды обитания. при этом способность части вибрионов из поверхностных водоемов продуцировать нейраминидазу, возможно, дает им определенные преимущества в процессе выживания в стрессовых условиях водной среды [6, 14-17].
На рис. 2 показано, что среди нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 Эль Тор самым распространенным оказался кластер К (90 штаммов - 16,4 %), генотипы (15) которого выявлены на территории 29 субъектов всех федеральных округов. Остальные кластеры состояли из различного количества генотипов. Так, кластер А включал 41 генотип (193 штаммов - 35,2 %), L - 11 генотипов (58 штаммов - 10,6 %), С - 9 генотипов (40 штаммов - 7,3 %), B - 7 генотипов (128 штаммов - 23,4 %), Е - 7 генотипов (21 штамм - 3,8 %), H - 6 генотипов (девять штаммов - 1,6 %), F - 3 генотипа (три штамма - 0,5 %), I - 2 генотипа (два штамма - 0,4 %), D, G, J и M - по одному генотипу (по одному штамму -0,2 %).
Обращает на себя внимание широкое распространение в ООС в россии генотипа к6, включающего 29 нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 эль Тор и представленного следующим набором генов: int, nanH (гены сайта интеграции и нейраминидазы острова патогенности VPI-2); rtxC - активатора MARTX и активного домена MARTX (acd-rtxA); vasK (структурный ген кластера системы секреции шестого типа T6SS); гены кластера системы секреции третьего типа T3SS (vcsN2, vspD) и маннозочувствитель-ных пилей адгезии (mshA). Данный генотип обнаружен в поверхностных водоемах 22 административных территорий России семи ФО: Южный, Крымский, Северо-Западный, Центральный, Приволжский, Сибирский и Северо-Кавказский. По данным литературы, кластер MARTX тесно связан с CTX-профагом, а ген rtxA присутствует в геноме большинства не-токсигенных штаммов эль Тор, обычно в этих штаммах определяется и rtxC. В ряде публикаций [18, 19] показано участие маннозочувствительных пилей в формировании биопленок на абиотических и биотических поверхностях, что способствует длительному
Федеральный округ Federal District Регион Region Генотипы Genotypes
Южный федеральный округ Southern Federal District Ростовская область Rostov Region A2 А7 А23 А 24 А 28 В2 СЗ С8 С9 Е2 Е4 1 ЕВ 1 Е7 1 Hl 1 Н2 1 Нб 1 К2 1
K5 К9 К10 К11 L2 L7 J1 Ml Gl F3
Республика Калмыкия Republic of Kalmykia A2 A4 А5 Аб А8 А10 А13 А14 А15 А16 А17 А18 А19 А 20 А 21 А 22 А27 А 34
A 35 А 38 А39 А40 А41 В2 В7 Cl С2 СЗ С4 С5 Сб С7 С9 D1 El Е5
E6 Н2 НЗ Н4 Н5 К1 К4 К5 К11 К12 L4 L5 L6 L7 L9 L10 II 12
Астраханская область Astrakhan Region A3 АЗб В1
Волгоградская область Volgograd Region K6
Краснодарский край Krasnodar Region A6 А7 А25 А 26 А 29 А 35 В1 Кб К14 L2
Крымский федеральный округ Crimean Federal District Республика Крым Republic of Crimea КЗ Кб L3
Северо-Западный федеральный округ Northwestern Federal District Республика Коми Komi Republic Fl
Архангельская область Arkhangelsk Region Кб
Калининградская область Kaliningrad Region L5
Ленинградская область Leningrad Region A 32 Кб L7
Новгородская область Novgorod Region Кб
Псковская область Pskov Region Кб
Дальневосточный федеральный округ Far Eastern Federal District 11риморский край Primorskv Reaion A3 All | К2 | К8 | L8 |
Амурская область Amur Region АЗО
Республика Саха Saha Republic А37
Хабаровский край Khabarovsk Region В5 ЕЗ LI L2 L3 F2
Уральский федеральный округ Ural Federal District Свердловская область Sverdlovsk Region В2 ВЗ Kl 5 L3
Челябинская область Chelyabinsk Region AI АЗб Аб К11
Тюменская область Tyumen Region В6 С7
Центральный федеральный округ Central Federal District Московская область Moscow Region А2 А9 С7 Кб
Рязанская область Ryazan Region Кб
Воронежская область Voronezh Region К13
Ярославская область Yaroslavl Region Кб
1ульская область Tula Reqion К7
Приволжский федеральный округ Volga Federal District Республика Татарстан Republic of Tatarstan A3
Кировская область Kirov Region С7 Кб
11ермская область Perm Region А31 Кб
Саратовская область Saratov Region Кб
Нижегородская область Nizhny Novgorod Region Кб
Пензенская область Penza Region Кб
Сибирский федеральный округ Siberian Federal District Иркутская область Irkutsk Region А2 А12 А28 А 33 АЗб С7 Кб К11
Кемеровская область Kemerovo Region А2 Кб
Новосибирская область Novosibirsk Region А2 Кб
Забайкальский край Transbaikal Region A3 А40 К2 Кб К11 L8
Республика Бурятия The Republic of Buryatia А40 L11
Красноярский край Krasnoyarsk Region Кб
Алтайский край Altai Region Кб
Северо-Кавказский федеральный округ North Caucasian Federal District Ставропольский край Stavropol Region A3 Кб
рис. 2. распределение пцр-генотипов нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, выделенных из оос и от людей на территории россии
Fig. 2. Distribution of PCR genotypes of non-toxigenic strains of cholera vibrios isolated from environmental objects and from people in Russia
сохранению вибрионов в водоемах. Исходя из приведенных данных, выявлено, что штаммы с таким генотипом наиболее устойчивы к действию факторов окружающей среды и способны к переживанию на протяжении летнего периода или ряда лет.
На следующем этапе работы проведен сравнительный генотипический анализ клинических неток-сигенных штаммов холерных вибрионов и «водных» штаммов. Установлено, что нетоксигенные изоляты V. cholerae 01, выделенные от больных в разные годы, относились к различным генотипам. Так, штаммы холерных вибрионов, выделенные от больных в 1999 г. (два изолята - Астраханская область) и 2000 г. (два изолята - Краснодарский край), относились к генотипу В1, как и штаммы, обнаруженные в 2015 г. в Краснодарском крае, р. Агура. Отличительной особенностью таких штаммов явилось наличие генов: int, nanH (гены сайта интеграции и нейраминида-зы острова патогенности VPI-2); rtxC - активатора MARTX и активного домена MARTX (acd-rtxA); vasK (структурный ген кластера системы секреции шестого типа T6SS) и маннозочувствительных пи-лей адгезии (mshA). Стоит отметить, что нетоксиген-ный изолят, выделенный от больного в Республике Калмыкия в 2002 г., имел одинаковый генотип К1 со штаммом, обнаруженным в р. Элистинке в 2018 г., и был представлен генами rtxC, acd-rtxA (MARTX), а также генами кластера системы секреции третьего типа T3SS (vcsN2, vspD) и маннозочувствитель-ных пилей адгезии (mshA). нетоксигенная культура холерного вибриона, изолированная от больного в 1999 г. в Хабаровском крае, имела уникальный генотип, ранее не встречавшийся на территории России, заключавшийся в наличии генов rtxC, acd-rtxA (MARTX); nanH (ген нейраминидазы острова патогенности VPI-2); vasK (структурный ген кластера системы секреции шестого типа T6SS) и маннозо-чувствительных пилей адгезии (mshA). исключение составили штаммы холерных вибрионов, обнаруженные в водоеме ветровский карьер в 2005 г. во время эпидосложнений в г. Каменске-Шахтинском, вызванных нетоксигенными штаммами V. cholerae 01 El Tor ctxA-tcpA+, и принадлежащие к одному генотипу н1, представленному следующим набором генов: int, nanH (гены сайта интеграции и нейрами-нидазы острова патогенности VPI-2); rtxC, acd-rtxA (MARTX); acd-vgrG1, pbd-vgrG3, vasK (гены кластера системы секреции шестого типа T6SS); vcsN2, vspD (гены кластера системы секреции третьего типа T3SS) и mshA (гены маннозочувствительных пилей адгезии). интересен тот факт, что на протяжении последних семи лет (2012-2018 гг.) на территории России нетоксигенных холерных вибрионов 01 се-рогруппы от людей выделено не было.
Что касается нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных из 00с, то они оказались генетически однородными, в сравнении с V. cholerae O1, и вошли в общий кластер А со штаммами 01 серогруппы. Большинство
штаммов (99,8 %) образовало отдельный генотип А2, который представлен следующим набором генов факторов патогенности/персистенции: int, nanH, vce (гены острова патогенности VPI-2); vasK vpbd-vgrG3 (транслокон и эффектор T6SS) и rtxC. У этих штаммов не выявлены гены tcpA, stn/sto, mshA, а также гены T3SS (vcsN2, vspD) и MARTX (acd-rtxA). Гены, кодирующие активный домен ключевого эффектора T6SS (acd-vgrG1), в 95,5 % случаев также не обнаружены. Такой генотип выявлен на территориях шести субъектов РФ трех ФО, а именно: Южного, Сибирского и Центрального. Стоит отметить, что исключение составил один штамм V. cholerae O139 (0,2 %), изолированный на территории Уральского Ф0 (челябинская область) и имеющий уникальный генотип. 0тличительной чертой вышеуказанного штамма явилось наличие в составе генома последовательности acd-vgrG1.
Таким образом, с помощью пополняемой ГИС дана расширенная характеристика по фено- и геноти-пическим признакам штаммов холерных вибрионов, как вновь выделенных на территории России, так и обнаруженных ранее. Проведенный ретроспективный анализ микробиологических свойств штаммов V. cholerae показал их типичность по культурально-морфологическим, серологическим и биохимическим свойствам. Установлено, что нетоксигенные штаммы холерных вибрионов 01 Эль Тор характеризовались устойчивостью по признаку фаголизабель-ности к холерному диагностическому фагу эльтор. Таким образом, сравнительный фенотипический анализ выявил изменчивость изучаемых штаммов по признаку фаголизабельности. 0пределены уникальные фаготипы (7, 8, 14, 18, 20), ранее не встречавшиеся на территории России. при проведении сравнительного анализа клинических нетоксиген-ных штаммов холерных вибрионов с «водными» выявлено, что единичные нетоксигенные изоляты V. cholerae 01, выделенные от больных в разные годы, относились к различным генотипам, что указывает на их заносное происхождение. Популяция нетоксигенных штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы являлась генетически однородной в отличие от изолятов V. cholerae O1 El Tor и имела идентичные ПЦР-генотипы. В целом распределение ветвей дендрограммы штаммов V. cholerae 0139 отличалось от такового штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы. Установлено, что использование метода ПЦР-генотипирования по 14 генам-мишеням позволяет дифференцировать изученные штаммы V. cholerae 01 и O139, а также выявить различия среди штаммов 0139, выделенных в различных географических регионах страны. Полученные данные свидетельствуют об актуальности проведения дальнейших исследований, направленных на изучение генетической организации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов с последующим поиском новых генетических маркеров для дифференциации клинических и водных штаммов.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
список литературы
1. Крутиков В.Д., Левченко Д.А., Титова С.В., Мо сквитина Э.А., Архангельская И.В., Гаевская Н.Е., Ежова М.И. Холерные вибрионы в водоемах Российской Федерации. Гигиена и санитария. 2019; 98(4):393-9. DOI: 10.18821/0016-9900-2019-98-4393-399.
2. Москвитина Э.А., Янович Е.Г., Куриленко М.Л., Кругликов В.Д., Титова С.В., Левченко Д.А., Водопьянов А.С., Лопатин А.А., Иванова С.М., Мишанькин Б.М., Кривенко А.С., Анисимова Г.Б., Носков, А.К. Холера: мониторинг эпидемиологической остановки в мире и России (2010-2019 гг.). Прогноз на 2020 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; 2:38-47. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-38-47.
3. Титова С.В., Монахова Е.В., Архангельская И.В., Писанов Р.В., Непомнящая Н.Б. Природные популяции холерных вибрионов как резервуар генов факторов патогенности. Здоровье населения и среда обитания. 2016; 5:45-7.
4. Титова С.В., Монахова Е.В. О потенциальной опасности нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, содержащих гены токсин-корегулируемых пилей адгезии. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2016; 5:65-72.
5. Зубкова ДА., Кругликов ВД., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Непомнящая Н.Б., Водопьянов С.О. генетические особенности штаммов холерных вибрионов о1 серогруппы ctxA-tcpA+, выделенных из водных объектов РФ, охарактеризованные с помощью новой геоинформационной системы. Здоровье население и среда обитания. 2014; 9:32-5.
6. Монахова Е.В. Стратегия вирулентности холерных вибрионов и пути ее реализации (обзор). Проблемы особо опасных инфекций. 2013; 4:60-8.
7. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Коннов Н.П., Кузнецов О.С., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ штаммов Vibrio cholerae O139 серогруппы, выделенных из внешней среды. Проблемы особо опасных инфекций. 2000; 80:93-100.
8. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28:2731-9. DOI: 10.1093/ molbev/msr121.
9. Кругликов В.Д., Левченко Д.А., Водопьянов А.С., Непомнящая Н.Б. Пцр-генотипирование нетоксигенных штаммов холерных вибрионов как один из подходов их актуализации в плане эпидназора за холерой. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2018; 2:28-35.
10. Гаевская Н.Е., Македонова Л.Д. Использование бактериофагов в лабораторной диагностике холеры. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 12(61):849-52. DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-12-849-852.
11. Tock M.R., Dryden D.T. The biology of restriction and anti-restriction. Curr. Opin. Microbiol. 2005; 8(4):466-72. DOI: 10.1016/j.mib.2005.06.003.
12. Labrie S.J., Samson J., Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(5):317-27. DOI: 10.1038/nrmicro2315.
13. Kuleshov K.V., Vodop'ianov S.O, Markelov M.L., Dedkov V.G., Kermanov A.V., Kruglikov V.D., Vodop'ianov A.S., Pisanov R.V., Mazrukho A.B., Shipulin G.A. Draft genome sequences of Vibrio cholerae O1 El Tor strains 2011 EL-301 and P-18785, isolated in Russia. Genome announc. 2013; 1(4):e00659-13. DOI: 10.1128/ genomeA.00659-13.
14. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Хунхеева Ж.Ю., Пономарева А.С., Басов Е.А., Гладких А.С., Бочалгин Н.О., Урбанович Л.Я. Актуальные вопросы совершенствования эпидемиологического надзора за холерой: эпидемиологические и молекулярно-генетические закономерности обнаружения холерного вибриона в объектах окружающей среды. Инфекция и иммунитет. 2017; 5:371.
15. Смирнова Н.И., Агафонова Е.Ю., Щелканова Е.Ю., Агафонов Д.А., Краснов Я.М., Ливанова Л.Ф., Кутырев В.В. Геномное разнообразие нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1, выделенные на территории России и сопредельных стран. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018; 2:76-86. DOI: 10.18821/0208-0613-2018-36-2-76-84.
16. Germyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002; 148:368193. DOI: 10,1099/00221287-148-11-3681.
17. Сизова Ю.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Черепахина И.Я., Бурлакова О.С. Фенотипический и генотипи-ческий анализ токсинопродукции типичных и атипичных штаммов холерных вибрионов в стрессовых условиях окружающей
среды. Современные проблемы науки и образования. 2017; 3. URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=26439 (дата обращения 03.11.2019).
18. Watnick P.I., Fullner K.J., Kolter R.A. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formatom by Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1999; 181:3606-9. DOI: 10.1128/ JB.181.11.3606-3609.1999
19. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to Zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(7):719-27. DOI: 10,f128/AEM.67.7.3220-3225.2001.
References
1. Kruglikov V.D., Levchenko D.A., Titova S.V., Moskvitina E.A., Arkhangelskaya I.V., Gaevskaya N.E., Ezhova M.I. [Vibrio cholera in the waters of the Russian Federation]. Gigiena i Sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2019; 98 (4):393-9. DOI 10.18821/00169900-2019-98-4-393-399.
2. Moskvitina E.A., Yanovich E.G., Kurilenko M.I., Kruglikov V.D., Titova S.V., Levchenko D.A., Vodop'yanov A.S., Lopatin A.A., Ivanova S.M., Mishan'kin B.M., Krivenko A.S., Anisimova G.B., Noskov A.K. [Cholera: Monitoring of Epidemiological Situation around the World and in Russia (2010-2019). Forecast for 2020]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2020; (2):38-47. DOI: 10.21055/0370-1069 -2020-2-38-47
3. Titova S.V., Monakhova E.V., Arkhangel'skaya I.V., Pisanov R.V., Nepomnyaschaya N.B. [Natural populations of Vibrio cholerae as a reservoir of virulence-associated genes]. Zdorov'e Naseleniya i Sreda Obitaniya [Public Health ana Life Environment]. 2016;
4. Titova S.V., Monakhova E.V. [Potential danger of nontoxi-genic Vibrio cholerae strains containing genes for toxin-coregulated adhesion pili]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Aktual'nye Voprosy [Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items].
5. Zubkova D.A., Kruglikov V.D., Arkhangelskaja I.V., Vodopyanov A.S., Nepomnyaschaya N.B., Vodopyanov S.O. [Genetic features of strains V. cholerae 01 CTXA-TCPA+, isolated from water bodies of the Russian Federation, described using a new geoinformation systems]. Zdorov'e Naseleniya i Sreda Obitaniya [Public Health and Life Environment]. 2014: 9:32-4.
6. Monakhova E.V. Cholera vibrio virulence strategy and ways of its realization (scientific review). Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2013; (4):60-8.D0I: 10.21055/0370-1069-2013-4-60-68.
7. Osin A.V., Eroshenko G.A., Konnov N.P., Kuznetsov O.S., Smirnova N.I. [Phenotypic and genetic analysis of Vibrio cholerae strains of O139 serogroup, isolated from environment]. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2000; 80:93-100.
8. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 2011; 28:2731-9. DOI: 10.1093/ molbev/msr121.
9. Kruglikov V.D., Levchenko D.A., Vodopyanov A.S., Nepomnyashchaya N.B. [PCR genotyping of non-toxigenic Vibrio cholerae strains as one of approaches to their actualization in terms of epidemiological surveillance of cholera]. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. Aktual'nye Voprosy [Epidemiology and Infectious Diseases. Current Items]. 2018; 2:28-35.
10. Gaevskaya N.E., Makedonova L.D. [The application of bacteriophages in laboratory diagnostic of cholera]. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics]. 2016; 12(61):849-52. DOI: 10.18821/0869-20842016-61-12-849-852.
11. Tock M.R., Dryden D.T. The biology of restriction and anti-restriction. Curr. Opin. Microbiol. 2005; 8(4):466-72. DOI: 10.1016/j.mib.2005.06.003.
12. Labrie S.J., Samson J., Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(5):317-27. DOI: 10.1038/nrmicro2315.
13. Kuleshov K.V., Vodop'ianov S.O, Markelov M.L., Dedkov V.G., Kermanov A.V., Kruglikov V.D., Vodop'ianov A.S., Pisanov R.V., Mazrukho A.B., Shipulin G.A. Draft genome sequences of Vibrio cholerae O1 El Tor strains 2011 EL-301 and P-18785, isolated in Russia. Genome announc. 2013; 1(4):e00659-13. DOI: 10.1128/ genomeA.00659-13.
14. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Khunkheeva Zh.Yu., Ponomareva A.S., Basov E.A., Gladkikh A.S., Bochalgin N.O., Urbanovich L.Ya. [Relevant issues of improvement of epidemiological surveillance over cholera: epidemiological and molecular-genetic regularities of cholera vibrio detection in environmental objects]. Infektsiya i Immunitet [Russian Journal of Infection and Immunity].
15. Smimova N.I., Agafonova E.Y., Shchelkanova E.Yu., Agafonov D.A., Krasnov Ya.M., Livanova L.F., Kutyrev V.V. [Genomic diversity of nontoxigenic Vibrio cholerae O1 strains isolated in the territory of Russia and neighboring states]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2018; 2:76-84. DOI: 10.18821/02080613-2018-36-2-76-84.
16. Germyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPl-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002; 148:368193. DOI: 10,1099/00221287-148-11-3681.
17. Sizova Ya.V., Pisanov R.V., Vodopyanov A.S., Cherepakhina I.Ya., Burlakova O.S. [Phenotypic and genotypic analysis of tox-inproduction of typical and atypical stamps of Vibrio cholerae in stress environmental conditions]. Sovremennye Problemy Nauki i Obrazovaniya [Modern Problems of Science and Education]. 2017; 3. URL: http:/ Www.science-education.ru/article/view?id=26439 .
18. Watnick P.I., Fullner K.J., Kolter R.A. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formatom by Vibrio
cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1999; 181:3606-9. DOI: 10.1128/ JB.181.11.3606-3609.1999
19. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to Zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(7):719-27. DOI: 10,1128/AEM.67.7.3220-3225.2001.
Authors:
Levchenko D.Ä., Kruglikov V.D., Gaevskaya N.E., Vodop'yanov A.S., Nepomnyashchaya N.B. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M. Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: plague@aaanet.ru.
Об авторах:
Левченко ДА., Кругликов В.Д., Гаевская Н.Е., Водопьянов А.С., Непомнящая Н.Б. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40. E-mail: plague@aaanet.ru.
