CC BY
78
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК Б15.038:Б15.2'2/.9
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭФИРОВ УКСУСНОЙ И ЯНТАРНОЙ КИСЛОТ БЕТУЛИНА
Р.А. Пегова1, О.Е. Жильцова1, И.Н. Клабукова1, И.В. Мухина2, Р.Д. Лапшин2, И.В. ЖЖданович1, Н.Б. Мельникова1,
1ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», 2Научно-исследовательский институт прикладной и фундаментальной медицины Нижегородской государственной медицинской академии
Пегова Регина Александровна - e-mail: reginapegova@gmail.com
Разработаны составы фармацевтических композиций производных бетулиновой кислоты (3,28-О-диацетат бетулина, 3,28-О-дисукцинат бетулина) в масле семян тыквы и методы анализа действующих веществ (ВЭЖХ, UV-Vis спектроскопия). В эксперименте на крысах при внутрибрюшинном введении Твина-80 доказано гипохолестеринемическое и гиполипидемическое действие фармацевтической композиции.
Ключевые слова: 3,28-О-диацетат бетулина, 3,28-О-дисукцинат бетулина, гипохолестеринемическое и гиполипидемическое действие.
The pharmaceutical compositions of betulinic acid derivatives (betulin-3,28-O-diacetate and betulin-3,28-O-disuccinate) in pumpkin seed oil and methods of active substances analysis (HPLC, UV-Vis spectroscopy) were developed. High lipid- and cholesterol-lowering activity of the pharmaceutical composition has been estimated in experiment on rats.
Key words: betulin-3,28-O-diacetate, betulin-3,28-O-disuccinate,
lipid- and cholesterol-lowering activity.
Введение
Тритерпеноиды лупанового ряда по своим свойствам и строению сходны с липофильными стеролами, которые относительно легко проникают через плазматические мембраны, а затем свободно секретируются клетками стероидогенных эндокринных желез [1].
Анализ связи «биологическая активность - структура» показывает, что все производные бетулина (бетулиновая и бетулоновая кислоты, сукцинаты и ацетаты и др. эфиры органических кислот) проявляют в различной степени противоопухолевые, гиполипидемические, гепатопро-текторные и противовирусные свойства [2-10]. Общность свойств, вероятно, обусловлена близкими механизмами биотрансформации. Так, бетулиновая кислота под действием ряда микроорганизмов и грибов превращается в бетулоновую кислоту и среди продуктов дальнейшей их биотрансформации обнаруживаются одни и те же метаболиты [11-14].
Весьма убедительно аргументированы гепатопротектор-ные свойства бетулина и его производных за счёт их воздействия на внутриклеточные мишени. На культуре раковых клеток печени человека показано, что бетулин в концентрации менее 0,1 мкг/мл (2.10-7М) практически полностью подавляет цитотоксическое действие CdCl2 [8]. Экспериментально доказана эффективность бетулина в предотвращении образования камней в мочевом пузыре крыс. Причиной положительного эффекта является минимизация кристалл-индуцирующих перекисных изменений, предотвращающая образование оксалатных камней и повреждение защитной антиоксидантной системы [9].
Однако, несмотря на многочисленные публикации, посвященные исследованию фармакологического действия производных бетулиновой кислоты, гиполипиде-мических лекарственных средств на основе эфиров бетулина на фармацевтическом рынке не представлено.
Настоящая работа посвящена разработке состава фармацевтической композиции с 3,28-О-дисукцинатом (ДСБ) и 3,28-О-диацетатом (ДАБ) бетулина, проявляющими гиполипидемическое и гипохолестеринемическое действия.
В задачи исследования входили:
1) выбор безопасных компонентов, способствующих прониканию эфиров бетулина в организм и оказывающих синергетическое действие;
2) выбор стабилизатора и консерванта для фармацевтической композиции;
3) исследование гиполипидемического и гипохолесте-ринемического действия фармацевтической композиции в эксперименте на крысах на модели гиперхолестерине-мии, вызванной Твином-80.
Экспериментальная часть
Реактивы. Бетулин (С30Н50О2) получали в соответствии со способом, указанным в литературе [10], "пл. 260°С (лит. 254-256 °С [10]); чистота 99.5%, ИК, V, ст-1: 3470 st (ОН), 1640 st (С=С); 1Н-ЯМР ^С13) (5С, м.д.): 4.67 т (1Н, =СН2), 4.57 т (1Н, =СН2), 3.78 Ьг. s (1Н, 28-СН2ОН), 3.31 т (1Н, 28-СН2ОН), 3.17 т (1Н,3-СНОН), 2.36 т (1Н, 19-СН), 1.66 s (3Н, СН3), 1.23 s (3Н, СН3), 0.96 s (3Н, СН3), 0.94 s (3Н, СН3), 0.80 s (3Н, СН3), 0.74 s (3Н, СН3). 13С-ЯМР (CDaз) (5С, м.д.): 76.71 (С-3), 109.46 (С-29), 150.24
Al
ЭдУД
(C-20), 57.87 (C-28). EI-MS m/z (%): 442 (M+, 40), 411 (60), 203 (95), 189 (100), 95 (85).
3,28-О-диацетат бетулина ^3^5404) синтезировали по методике [15]. Продукт имел следующие характеристики: Т.пл. 222-223°С. ИК-спектр (KBr) (v, см-1): 3068.75 (С=С); 2947.23; 2870.08 (С-Н); 1737.86 (С=О); 1456.26; 1388.75; 1365.60 (С-С); 1244.09; 1031.92 (С-О-С). 1Н-ЯМР (CDCl3) (5C, м.д.): 4.72 (1H, м, =CH2); 4.55 (1H, м, =CH2); 4.47 (1H, м, H3); 4.26 (1H, д, J10.7 Гц, Н28); 3.86 (1Н, д, J10.7 Гц, Н28); 2.50 (1Н, м, Н19); 2.08(3Н, с, CH3C0); 2.03 (3H, с, CH3C0); 1.65; 1.02; 0.94; 0.82; 0.80 (все 3H, с, CH3). 13С-ЯМР (CDCl3) (5C, м.д.): 14.95 (С27), 15.79 (С24), 15.92 (С25), 16.27 (С26), 17.94(С6), 18.89 (С29), 20.58 (С11), 20.77 (СН3Ас), 21.04(СН3Ас), 23.46 (С2), 24.92 (С12), 26.83 (С15), 27.71 (С23), 29.35 (С16), 29.52 (С21), 33.91 (С7), 34.32 (С22), 36.82 (С10), 37.32 (С13), 37.55 (С4), 38.16(0), 40.66 (С8), 42.45 (С14), 46.08 (С17), 47.47(С19), 48.54 (С18), 50.05 (С9), 55.15 (С5), 62.50(С28), 80.61 (С3), 109.69 (С30), 149.80 (С20), 170.63 (СОАс), 171.23 (СОАс).
3,28-О-дисукцинат бетулина (C38H5608) был синтезирован по методике [16]. Продукт имел следующие характеристики: Т.пл. 116.1-117.8°С. ИК-спектр (KBr) (v, см-1): 2954.83, 1726.44, 1169.46 см-1. 1Н-ЯМР (CDCl3) (5C, м.д.): 4.69 (1H, с), 4.59 (1H, с), 4.51 (1Н, м), 4.31 (1H, д, J=11.4 Гц), 3.88 (1H, д, J=10.8 Гц), 2.67(8Н, м), 2.44 (1Н, м), 1.68 (3H, с), 1.3, 0.98, 0.85, 0.86, 0.79 (5х3Н, все с), 1.06-2.1(24Н, комплекс). 13С-ЯМР (CDCl3) (5C, м.д.): 173.73, 173.65, 167.98, 167.37, 145.63, 105.44, 77.09, 58.72, 50.91, 45.77, 44.30, 43.25, 41.94, 38.22, 36.40, 33.88, 33.36, 33.10, 32.56, 29.97, 29.61, 25.18, 24.87, 24.61, 23.41, 22.54, 20.67, 19.13, 16.34, 14.65, 13.69, 12.04, 11.68, 11.55, 10.31.
Масло семян тыквы (ТУ 42-8110-06), тимол (ТУ 6-0937-36-79), вода деионизированная (сопротивление>18 MQ cm, Simplicity, Millipore Inc.) с рН 5.5 при температуре 20±1°C, янтарный ангидрид (ТУ 6-09-3611-85), ледяная уксусная кислота (ГОСТ 81-75 изм.№3), имидазол (ТУ 6-09-37-1127-91), хлористоводородная кислота (ГОСТ 3118-77) использовались без предварительной очистки и какой-либо обработки.
Приборы и оборудование. ИК-спектры были получены на приборе Shimadzu IR-Prestige-21 instrument (KBr tablets). Температуру плавления измеряли с помощью капиллярного метода на аппарате Electrothermal 9200. ВЭЖХ - хрома-тограммы эфиров бетулина были получены на высокоэффективном жидкостном хроматографе марки Shimadzu LC-20 Avp, колонка Discovery C18 (250 х 4.6 mm, 5pm) с UV-детектором. Подвижная фаза ацетонитрил-вода 80:20 (и/и) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 25°C, объем инжекции 20 pL, детектирование при длине волны 210 нм, время анализа 15 мин 13С, 1Н ЯМР спектры регистрировали на спектрометрах Bruker Advance DPX - 200 и Bruker DRX SF = 500 в CDCl3, внутренний стандарт - ТМС.
Анализ масла семян тыквы.
Подготовка модельных смесей. Стандартные образцы масла семян тыквы (МСТ): 1- (0.10 г), 2- (0.20 г), 3- (0.30 г), что составляло соответственно 50%, 100%, 150% от ожидаемой концентрации в испытуемом растворе, растворяли в 50 мл гексана и добавляли 0.1 г тимола. Омыление МСТ
проводили в присутствии аскорбиновой кислоты в соответствии с методикой, описанной ранее [17].
Растворы стандартов токоферолов, р.р-каротина и р-ситостерола готовили растворением их в 3.0 г МСТ (точная навеска). 0.2 г тимола и необходимого объема растворов. содержащих рассчитанную концентрацию этих БАВ (5 мг. 10 мг. 20 мг). аскорбиновую кислоту (0.02 г). 96% этанола (50 мл) смешивали. Стандартные растворы подвергали омылению и выделению каротиноидов в соответствии с методикой омыления МСТ [17]. Сухие остатки растворяли в 1 мл элюентов - этанол / ацетонитрил (15:85) для анализа р-ситостерола и метанол / ацетонитрил / дихлор-метан (50: 44: 6) для анализа токоферолов.
Выделение каротиноидов. Гексановый раствор пропускали через колонку с высотой сорбента 10 см (30 - см -длина колонки. 1-1.5 см - диаметр) со слоем МдО (или СаС03. А1203); Затем колонку промывали дважды порциями гексана по 10-15 мл. а затем гексан удаляли в атмосфере азота.
ОФ-ВЭЖХ-анализ токолов и р-ситостерола проводили после отделения каротиноидов. 1. Анализ токолов: 284 нм и 295 нм при 30°С. Скорость потока подвижной фазы была равна 1 мл/мин в изократическом режиме. 2. Анализ р-ситостерола: 210 нм при 40°С. Скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин в изократическом режиме.
Количественное определение суммы каротиноидов было выполнено спектрофотометрическим методом в соответствии с работой [17] и рассчитывалось по формуле:
(1),
где Анабл. - оптическая плотность исследуемого раствора масла семян тыквы в гексане; Ь - поправка оптической плотности по отношению к базовой линии; V - анализируемый объем раствора, мл; - удельные коэффициенты экстинкции. равные для р.р-каротин-3.3'-диола в гексане - 2480 и для а.р-каротин-3.3'-диола в гексане - 2550; Со - концентрация 1% раствора. равная 10 мг/мл.
ОФ-ВЭЖХ-анализ 3.28-О-диацетата и 3.28-О-дисук-цината бетулина в фармацевтической композиции проводился после пробоподготовки. включающей удаление каротиноидов и омыление компонентов масла в соответствии с процедурой. описанной выше. Условия хромато-графирования соответствовали условиям. описанным выше для этих соединений. Состав фармацевтической композиции Эфир бетулина 0.7 г
Тимол 0.7 г
Масло семян тыквы до 100.0 г
Композицию приготавливали растворением 0.7 г эфира бетулина (ацетата или сукцината) и 0.7 г тимола в масле семян тыквы. После перемешивания полученную смесь обрабатывают ультразвуком для полного растворения твердых компонентов исследуемой фармацевтической композиции.
Экспериментальная гиперхолестеринемия у белых крыс вызывалась внутрибрюшинным введением Твина-80.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Одновременно с Твином-80 опытным группам животных перорально вводили исследуемую фармацевтическую композицию в виде масляного раствора. Контрольная группа животных в аналогичных условиях вместо исследуемых веществ получала 0.5 мл воды. Через 12 ч после внутрибрюшинной инъекции Твина-80 крыс забивали декапитацией и в сыворотке крови определяли содержание холестерина и триглицеридов. В качестве фармацевтической композиции для сравнения использовалось масло расторопши, представленное, главным образом, тритерпеновыми кислотами, небольшим количеством органических кислот и другими неидентифицируемыми примесями.
Результаты и их обсуждения
Бетулин и его производные, в том числе и эфиры бетули-на, плохо растворяются как в воде, так и в липофильных средах. Для обеспечения хорошей биодоступности и биоусвояемости изучаемых эфиров бетулина - 3,28-О-дисук-цинат (ДСБ) и 3,28-О-диацетат (ДАБ) бетулина - при пероральном приеме разрабатываемой фармацевтической композиции нами предложено использовать масло семян тыквы (МСТ). Известны свойства МСТ снижать уровень холестерина и ЛПНП, что было использовано в ряде гиполипидемических БАД на основе МСТ. В настоящее время появилось описание вновь выявленных эффектов МСТ, таких как антикоагуляционный эффект, снижение сахара, гепатопротекторное действие [18, 19].
Фармакологический эффект воздействия МСТ, как полагают, обусловлен его жирно-кислотным составом, представленным 80%-й линолевой и олеиновой кислотами, антиоксидантами (токолами и каротиноидами), а также наличием в его составе фитостеролов, основным представителем которых является р-ситостерол.
Гипохолестеринемическое действие р-ситостерола объясняется тем, что он действует по принципу антиметаболитов, благодаря подобию химической структуры холестерола, вытесняя его при взаимодействии с ЛПНП в плазме. Другим механизмом гипохолестеринемического действия является образование достаточно стабильных комплексов р-ситостерола с холестеролом, затрудняя всасывание их из желудочно-кишечного тракта [20].
Кроме того, фитостеролы (кампестерол, р-ситостерол и их глюкопиранозиды) в МСТ по отношению к изучаемым эфирам бетулина - ДСБ и ДАБ, способны выполнять роль вектора доставки в лекарственной форме.
Эфиры бетулина - ДСБ и ДАБ, как тритерпеноиды, имеют структуру, близкую к фитостеролам, и могут быть также колоидно растворимы в МСТ, как и фитостеролы. Следовательно, МСТ является идеальной средой для обеспечения биодоступности производных бетулина.
На воздухе в МСТ быстро теряет свои ценные свойства: происходит изменение жирно-кислотного состава масла в сторону уменьшения доли ненасыщенных жирных кислот, уменьшение концентрации каротиноидов и токолов. Нами предложено для стабилизации МСТ использовать монотерпеновый спирт - тимол.
Тимол проявляет сильные антиоксидантные свойства (Е0=-0.98 В) в среде масла, что обуславливает его способность обеспечить высокую стабильность природных
ТАБЛицА 1.
Изменение состава масла семян тыквы при хранении на воздухе при 25°С
Сумма токолов, мг% Каротиноиды, мг% Фитостеролы, мг%
т=0 т=3 мес. т=0 т=3 мес. т=0 т=3 мес.
МСТ 56.0 28.0 0.82 0.50 130 75
МСТ+тимол 56.0 54.2 0.82 0.78 130 130
таблица 2.
Влияние эфиров бетулина в МСТ на содержание холестерина в крови животных
Группа Содержание холестерина, ммоль/л изменение, %
Твин-80 Твин-80 + композиция
Интактные, п=5 3.10±0.67 - -
Контроль 1, п=5 12.18±0.64 - +292.9±20.6
Контроль 2 Масло расторопши, п=5 - 9.11±0.71 -25.2±5.8
Композиция с ДСБ, п=5 - 6.15±0.42 -49.8±3.4
Композиция с ДАБ, п=5 - 7.32±0.80 -39.9±6.6
таблица 3.
Влияние эфиров бетулина в МСТ на содержание триглицеридов в крови животных
Группа Содержание холестерина, ммоль/л изменение, %
Твин-80 Твин-80 + композиция
Интактные, п=5 0.64±0.15 - -
Контроль 1, п=5 0.88±0.15 - +37.3±18.8
Контроль 2 Масло расторопши, п=5 - 0.59±0.15 -32.9±17.0
Композиция с ДСБ, п=5 - 0.48±0.09 -45.5±10.2
Композиция с ДАБ, п=5 - 0.44±0.14 -50.0±15.9
антиоксидантов и ненасыщенных жирных кислот в МСТ. Также доказана его положительная роль в обеспечении гиполипидемического действия в снижении ЛПНП [21].
Показано, что концентрация каротиноидов МСТ в присутствии тимола практически не изменялась в условиях ускоренного старения при температуре 40°С. Исходное МСТ содержит 6 мг% а-токоферола, около 50 мг% смеси у-токоферола и у-токотриенола, 105-150 мг% Р-ситостерола.
Нами предложена фармацевтическая композиция гиполипидемического и гипохолестеринемического действия в виде капсул, содержащая 0.7% эфиров бетулина (ДСБ или ДАБ) в масле семян тыквы, а также 0.7% тимола в качестве консерванта и стабилизатора.
Как показали опыты (таблицы 2, 3), в результате введения Твина-80 у крыс контрольной группы уровень холестерина в крови повысился на 292.9%, а уровень триглицеридов -на 37,3% по сравнению с интактными животными. Через 12 часов после введения одновременно с Твином-80 изучаемых фармацевтических композиций во всех случаях отмечалось снижение в крови крыс концентрации как холестерина, так и триглицеридов. В качестве сравнения в группе
Al
ЭдУД
Контроль 2 животным вводили масло расторопши. богатое тритерпеновыми кислотами. Полученные нами данные показали достоверное уменьшение уровня холестерина и триглицеридов в крови животных по сравнению с группами Контроль 1 (группа без лечения) и Контроль 2 (лечение маслом расторопши).
Фармацевтическая композиция может быть использована для лечения и профилактики широкого круга заболеваний нарушения обмена веществ. в том числе липид-ассоцииро-ванных заболеваний (сахарный диабет. атеросклероз. вари-коз. гепатоз).
Выводы
1. Разработана фармацевтическая композиция гиполипи-демического действия. содержащая в качестве действующего вещества эфиры бетулина - диацетат или дисукцинат бетулина в масле семян тыквы.
2. Предложена капсульная лекарственная форма композиции. в которой в качестве антиоксиданта и консерванта используется тимол в массовой концентрации 0.05%.
3. В эксперименте на крысах на модели гиперхолестерине-мии. вызванной Твин-80. доказано гипохолестеринемичес-кое и гиполипидемическое действие фармацевтической композиции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Falamas A., Pinzaru S.C., Chis V., Dehelean C. Spectroscopic investigations of newly fomed betulin-cyclodextrin quest-host type complexes as potential anti skin cancer candidates. Journal of Molecular Structure. 2011. Vol. 993. Р. 297-301.
2.Кислицын А.Н. Экстрактивные вещества бересты: выделение, состав, свойства, применение. Химия древесины. 1994. № 3. С. 3-28.
Kislitsyn A.N. Ehkstraktivnye veshchestva beresty: vydelenie, sostav, svojstva, primenenie. Himiya drevesiny. 1994. № 3. S. 3-28.
3.Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность. Химия в интересах устойчивого развития. 2005. № 13. С. 1-30.
Tolstikov G.A., Flekhter O.B., Shulc E.E., Baltina L.A., Tolstikov A.G. Betulin i ego proizvodnye. Himiya i biologicheskaya aktivnost. Himiya v interesah ustojchivogo razvitiya. 2005. № 13. S. 1-30.
4. Cichewicz R.H., Kouzi S.A. Chemistry, Biological Activity and Chemotherapeutic Potential of Betulinic Acid for the Prevention and Treatment of Cancer and HIV Infection. Medicinal Research Reviews. 2004. Vol. 24. № 1. Р. 90-114.
5. DasGupta T.K., Pezzuto J.M. Method and composition for selectively inhibiting melanoma using betulinic acid. Board of Trustees of University of Illinois. Patent US 5658947. Date of patent 19.08.1997. Р. 6.
6. флехтер О.Б., Нигматуллина Л.Р., Балтина Л.А. и др. Получение бетули-новой кислоты из экстракта бетулина. Противовирусная и противоязвенная активность некоторых родственных терпеноидов. Химико-фармацевтический журнал. 2002. Т. 36. № 9. С. 26-28.
Flehter O.B., Nigmatullina L.R., Baltina L.A. i dr. Poluchenie betulinovoy kislotyi iz ekstrakta betulina. Protivovirusnaya i protivoyazvennaya aktivnost nekotoryih rodstvennyih terpenoidov. Himiko-farmatsevticheskiy zhurnal. 2002. Т. 36. № 9. S. 26-28.
7. Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р. и др. Синтез и противовирусные свойства производных лупановых тритерпеноидов. Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. № 7. С. 10-13.
Flehter O.B., Boreko E.I., Nigmatulina L.R. i dr. Sintez i protivovirusnyie svoystva proizvodnyih lupanovyih triterpenoidov. Himiko-farmatsevticheskiy zhurnal. 2004. T. 38. №7. S. 10-13.
8. Ciurlea S., Soica C., lonescu D. et al. Birch tree outer bark, a natural source of bioactive pentacyclic triterpenes with an antitumor activity. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 2010. Vol. 16. № 3. P. 328-332.
9. Позднякова С.В., Грек О.Р., Фунтиков А.С. и др. Нефропротективный эффект производных бетулоновой кислоты при экспериментальном цитоста-тическом повреждении почек у крыс // Бюллетень СО РАМН. 2007. № 5. С. 117-121.
Pozdnyakova S.V., Grek O.R., Funtikov A.S. i dr. Nefroprotektivnyiy effekt proizvodnyih betulonovoy kislotyi pri eksperimentalnom tsitostaticheskom povrezhdenii pochek u kryis // Byulleten SO RAMN. 2007. № 5. S. 117-121.
10. Юнусов М.С., Комиссарова Н.Г., Беленкова Н.Г. Способ получения бетулина и лупеола. Патент RU 2270202. Опубликован 20.02.06, Бюл. № 25.
Yunusov M.S., Komissarova N.G., Belenkova N.G. Sposob polucheniya betulina i lupeola. Patent RU 2270202. Opublikovan 20.02.06, Byul. № 25.
11. Muffler K., Leipold D., Scheller M. et al. Biotransformation of triterpenes. Process Biochemistry. 2011. Vol. 46. Р. 1-15.
12. Chatterjee P., Kouzi S.A., Pezzuto J.M., Hamann M.T. Biotransformation of the antimelanoma agent betulinic acid by Bacillus megaterium ATCC 13368. Applied and environmental microbiology. 2000. Vol. 66. № 9. Р. 3850-3855.
13. Bastos D.Z.L., Pimentel I.C., Jesus D.A., Oliveira B.H. Biotransformation of betulinic acid by fungi. Phytochemistry. 2007. Vol. 68. Р. 834-839.
14. Liu J., Fu M.L., Chen Q.H. Biotransformation optimization of betulin into betulinic acid production catalysed by cultured Armillaria luteo-virens Sacc ZJUQH100 - 6 cells. Journal of Applied Microbiology. 2010. Vol. 110. Р. 90-97.
15. Кислицын А.Н., Трофимов А.Н., Патласов В.П., Чупрова В.А. Способ получения диацетата бетулинола. Патент RU 2150473. Опубликован 10.06.2000.
Kislitsyin A.N., Trofimov A.N., Patlasov V.P., Chuprova V.A. Sposob polucheniya diatsetata betulinola. Patent RU 2150473. Opublikovan 10.06.2000.
16. Krasutsky P.A., Carlson R.M., Karim R. Triterpenes having antibacterial activity. Patent US 6689767. Date of Patent: 10.02.2004
17. Vorobyova O.A., Bolshakova A.E., Pegova R.A. et al. Analysis of the Components of Pumpkin Seed Oil in Suppositories and the Possibility of Its Use in Pharmaceuticals. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2014. № 6 (5). P. 1106-1116.
18. Widy-Tyszkiewicz E. Assessment report on Cucurbita Pepo L., semen. European Medicines Agency. Science medicines health. 2012. P. 19-28.
19. Sedigheh A., Jamal M.S., Mahbubeh S. et al. Hypoglycaemic and hypolipidemic effects of pumpkin (Cucurbita pepo L.) on alloxan-induced diabetic rats. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2011. Vol. 5 (23). P. 2620-2626.
20. Пегова Р.А., Воробьева О.А., Мельникова Н.Б. Растительные масла. Состав и перспективы использования масла семян тыквы - Cucurbita Pepo в терапии. Медицинский Альманах. 2014. № 2 (32). C. 127-134.
Pegova R.A., Vorobeva O.A., Melnikova N.B. Rastitelnyie masla. Sostav i perspektivyi ispolzovaniya masla semyan tyikvyi - Cucurbita Pepo v terapii. Meditsinskiy Almanah. 2014. № 2 (32). C. 127-134.
21. Safari M.R. Effects of Vitamin E and Volatile Oils on the Susceptibility of Low-Density Lipoprotein to Oxidative Modification. Iranian Biomedical Journal. 2003. № 7 (2). P. 79. Ug
