CC BY
41
УДК 616.155.1:616.37-002-092.9
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ И НЕФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ КОРРЕКЦИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА
© Гаврилюк В.П., Долгарева С.А., Назаренко П.М., Конопля А.И., Иванов В.П.
Кафедра хирургических болезней № 2 Курского государственного медицинского университета
Установлены характер и степень нарушений физико-химических свойств эритроцитов в условиях экспериментального острого панкреатита и эффективность коррекции выявленных нарушений физическими (ультразвуковое и магнитно-инфракрасно-лазерное воздействие) и фармакологическими (сочетание поли-оксидония с мексидолом или абактала с мексикором) способами.
Ключевые слова: структурно-функциональные свойства эритроцитов, острый панкреатит, фармакологическая коррекция.
PHARMACOLOGICAL AND NON-PHARMACOLOGICAL WAYS OF CORRECTING PHYSICAL AND CHEMICAL DISTURBANCES OF ERYTHROCYTES IN THE EXPERIMENTAL ACUTE
PANCREATITIS
Gavrilyuk V.P., Dolgareva S.A., Nazarenko P.M., Konoplya A.I., Ivanov V.P.
Department of Surgical Diseases № 2 of the Kursk State Medical University
The character and degree of disturbances of erythrocytes physical and chemical properties in experimental acute pancreatitis were established. The efficiency of correcting the given disturbances by the physical (ultrasound and magnetic-infrared-laser influence) and pharmacological (the combination of Polyoxidonium with Mexidol or Abaktal with Mexicor) ways is testified.
Key words: structurally functional properties of erythrocytes, acute pancreatitis, pharmacological correction.
Множество исследований, проведенных в середине прошлого века, посвященных изучению роли эритроцитов в поддержании гомеостаза, казалось бы, раскрыли многообразие функций этой популяции клеток крови и дали ответы на многие вопросы. Конец XX века характеризуется поиском механизмов развития универсальных условно-
приспособительных и патологических реакций организма, к которым относятся воспаление, реакция системного иммунного ответа, аллергические реакции, сепсис и другие. В последние несколько лет по-новому представляется роль эритроцитов в регулировании различных звеньев гомеостаза не только в условиях нормы, но, в первую очередь, в условиях патологии [8, 9].
Кроме этого, достоверно установлена важная роль эритроцитов в регулировании иммунологических реакций, как в условиях нормы, так и в условиях различных патологий: перегревания, переохлаждения, при
гнойном холангите, остром панкреатите и других [3].
Не исключено, что существуют типовые физико-химические и структурнофункциональные изменения в эритроцитах при различных патологиях, являющихся званьем одной цепи каскада патофизиологических реакций [7].
Целью работы явилось установление изменений физико-химических свойств эритроцитов при экспериментальном остром панкреатите и разработка эффективных способов фармакологической и нефармакологической их коррекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальный острый панкреатит (ЭОП) моделировали по R.N. Wang [18] в модификации С.А. Алехина [1].
Эритроциты получали из 5 мл гепарини-зированной крови по методу E. Beutler [14]. Определяли сорбционную способность эритроцитов (ССЭ) по отношению к витальным красителям [12] и сорбционную емкость их
гликокаликса (СЕГ) для альцианового синего, который является катионным красителем фталоцианиновой группы [10]. О функциональном состоянии эритроцитов судили также по содержанию в них малонового диальдегида (МДА) [2].
Мембраны эритроцитов получали методом G.T. Dodge [15]. Электрофорез проводили в присутствии додецилсульфата натрия в вертикальных пластинах полиакриламидного геля по методу U.K. Laemmli [17]. Белки окрашивали кумаси голубым R-250 по модифицированной методике G. Fairbanks [16]. Количественное содержание белковых фракций рассчитывали через площадь и известную концентрацию яичного альбумина, выступающего как маркерный белок. Полученные значения пересчитывали на 1 мг общего белка в исследуемом образце сухих мембран эритроцитов.
Ультразвуковое воздействие проводили с использованием ультразвукового аппарата "УЗТ - 1.01" при частоте 0,88 мГц, плотности потока мощности 0,4 Вт/см в непрерывном режиме, а магнитно-инфракрасно-лазерное воздействие с использованием аппарата "МИЛТА-Ф-5-01" при частоте 50 Гц и мощности светодиода 50 мВт. В обоих случаях воздействие производилось на область селезенки 4 раза с интервалом 24 часа контактно в течение 120 секунд
Использовали инъекционные формы по-лиоксидония ("ПетроваксФарм", Россия; в/м
0,15 мг/кг № 5), абактала ("Lek", Словения; в/в 15 мг/кг № 5), мексикора ("ЭкоФарм-Инвест", Россия; в/м 1 мг/кг № 5) и мексидо-ла ("Эллара", Россия; в/м 1 мг/кг № 5). Дозы, способы и схемы введения препаратов соответствовали рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машков-ского "Лекарственные средства" и аннотациях к использованию препаратов [6].
Статистическую обработку результатов исследования проводили, используя непараметрические методы: критерии Вилкоксона-Манна и Уитни, Крускала-Уоллиса, Фридмана и непараметрический вариант критерия Ньюмена-Кейлса, а также коэффициент ранговой корреляции Спирмена [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
У животных с ЭОП на первые сутки от моделирования наблюдается снижение представительности в эритроцитарной мембране анкирина, тогда как сорбционные свойства мембраны эритроцитов и концентрация МДА не изменяются (рис. 1).
На 5-е сутки от моделирования острого панкреатита в мембране эритроцитов снижается количество как а- так и Р-спектрина (на 30,4% и 28,5% соответственно), анкирина (почти в 2 раза) и на 24,2% белка полосы 6 (глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназа или Г3ФД). Кроме этого, повышается общая сорбционная способность эритроцитов (на 78,0%) и их гликокаликса (на 31,6%), возрастает внутриклеточная концентрация МДА (на 53,1%) (рис. 1).
На 9-е сутки моделирования ЭОП дополнительно повышается представительность анионтранспортного белка (АТБ), дематина и снижается ССЭ (рис. 1).
Таким образом, в условиях ЭОП наблюдаются нарушения физико-химических свойств эритроцитов, направленных на уменьшение прочности и деформируемости эритроцитарной мембраны, повышение общей сорбционной способности эритроцитов и их гликокаликса и снижение их метаболической активности.
Полученные факты можно сопоставить с данными литературы о роли эритроцитов в регуляции иммунного гомеостаза при патологии [3] и результатами исследований, проведенных по изучении состояния иммунологической реактивности у животных в условиях ЭОП, в которых максимальные иммунологические нарушения имели место на 5-7 сутки от моделирования острого панкреатита [13]. Это еще раз подтверждает важную роль эритроцитов в регулировании иммунологического гомеостаза при патологии, в частности при остром панкреатите. Возможно, иммунотроп-ные свойства легких и тяжелых эритроцитов могут быть обусловлены различными изменениями их структурно-функциональных свойств. Для этого нами изучались нарушения физико-химических свойств различных фракций эритроцитов у животных с ЭОП на 5-е сутки от моделирования.
а-спектрин
Рис. 1. Структурно-функциональные свойства эритроцитов животных с экспериментальным острым панкреатитом в зависимости от времени моделирования.
Условные обозначения: 1 - радиусом окружности отмечены показатели у интактных животных
(1 группа); 2--- - показатели у животных с ЭОП на 1-е сутки моделирования (2 группа);
3 -.....- показатели у животных с ЭОП на 5-е сутки моделирования (3 группа); 4--------пока-
затели у животных с ЭОП на 9-е сутки моделирования (4 группа); 5 - О - р < 0,05 между показателями 2-4 групп по отношению к 1 группе.
У фракции легких эритроцитов в условиях ЭОП по сравнению с цельным пулом эритроцитов повышена концентрация анкирина и Г3ФД и снижена внутриклеточная концентрация МДА (рис. 2). У фракции тяжелых эритроцитов по сравнению с цельными эритроцитами повышена представительность а- и Р-спектрина и повышена ССЭ и концентрация МДА (рис. 2). Сравнивая значения показателей структурно-функциональных свойств легких и тяжелых эритроцитов у животных с ЭОП между собой, были выявлены различия в представительности а- и Р-спектрина, анки-рина, актина, Г3ФД, глутатион-Б-
трансферазы (^Т) и внутриклеточной концентрации МДА (рис. 2).
Полученные результаты позволяют предположить, что изменения структурно-
функциональных свойств различных фракций эритроцитов обусловливают различные их
иммунотропные эффекты, доказанные целым рядом исследований [3, 10]. Эти данные вписываются в концепцию, что красные клетки крови являются интегрирующим звеном между взаимодействием гепатоцитов и макрофагов. Так, гепатоциты выделяют в сосудистое русло соединения, индуцирующие появление у легких эритроцитов свойства усиливать выделение макрофагами селезенки иммуносупрессирующих цитокинов [3].
Многие лекарственные соединения, обладающие иммунотропной и антиоксидантной активностью, физические факторы воздействия, такие как ультразвуковое (УЗ) и магнитно-инфракрасно-лазерное воздействия (МИЛ), обладают свойством ослаблять им-муносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцировать появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов [4], при этом не исключено, что в осно-
Рис. 2. Структурно-функциональные свойства легких и тяжелых эритроцитов по сравнению с общим пулом эритроцитов у животных с экспериментальным острым панкреатитом на 5 -е сутки от моделирования.
Условные обозначения: 1 - прямой линией отмечены значения у цельного пула эритроцитов (1
группа); 2--------значения у легкой фракции эритроцитов (2 группа); 3 - .... - значения у
тяжелой фракции эритроцитов (3 группа); 4 - О - р < 0,05 между показателями 2 и 3 групп по отношению к 1 группе; 5 - □ - р < 0,05 между показателями 3 и 2 групп.
ве данных эффектов лежат изменения физико-химических свойств эритроцитов, обусловленные структурными перестройками мембранных белков.
Исходя из этого, нами изучалась возможность коррекции нарушенных структурнофункциональных свойств эритроцитов у животных с ЭОП путем воздействия на область селезенки УЗ и МИЛ или применением фармакологических средств, обладающих иммуномодулирующими (полиоксидоний и абак-тал) и антиоксидантными (мексидол и мекси-кор) эффектами.
Воздействие на организм животных УЗ нормализовало концентрацию в эритроцитах МДА и корригировало количество в их мембране Р-спектрина. Тогда как у животных, подвергнутых магнито-инфракрасно-лазерно-му воздействию, нормализуется представительность Р-спектрина, белка полосы 6 и СЕГ (табл.).
Применение сочетания полиоксидония и мексидола снижает и нормализует количество в эритроцитарной мембране а- и Р-
спектрина, СЕГ и корригирует ССЭ и концентрацию в них МДА. Инъекции абактала в сочетании с мексикором нормализуют представительность в мембране эритроцитов а- и Р-спектрина, подфракций анкирина, белка полосы 6, СЕГ, ССЭ и концентрацию в них МДА (рис. 3).
Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях острого экспериментального панкреатита нарушается целый ряд параметров структурно-функциональных
свойств эритроцитарной мембраны, играющих важную роль в патогенезе иммунологических расстройств при данной нозологии, которые могут быть корригированы воздействием in vitro физиотерапевтических факторов, таких как УЗ и более эффективно МИЛ-терапии, или введение сочетания полиокси-дония с мексидолом или, что более эффективно, абактала с мексикором. Вероятно, выраженный описываемый в литературе иммунокорригирующий эффект данных фармакологических и нефармакологических способов воздействия обусловлен не прямым их влия-
Таблица
Структурно-функциональные свойства эритроцитов у животных с ЭОП, подвергнутых воздействию УЗ или МИЛ (М±т)
Белок(полоса) Контроль Эритроциты животных с ЭОП на 5-е сутки
без введения эритроцитов + УЗ + МИЛ
1 2 3 4
а-спектрин (1а) 109,5±11,2 76,2±8,70*1 89,4±7,80 77,9±7,90*1
Р-спектрин (1Р) 92,0±8,70 65,7±5,90*1 77,9±4,20*1,2 83,6±6,50*2
Анкирин (2) 69,5±1,11 39,5±0,68^ 51,5±1,10*1 39,5±1,20*1
АТБ (3) 172,6±10,2 206,2±19,5 200,1±13,0*1 230,5±12,4*1-3
Белок полосы 4.1 (4.1) 80,9±7,10 92,1±6,70 85,2±6,10 87,1±6,40
Паллидин (4.2) 63,9±5,90 77,1±6,50 72,2±6,20 64,4±5,70*2
Белок полосы 4.5 (4.5) 71,9±6,10 78,9±6,00 82,2±7,40 82,2±7,30
Дематин (4.9) 39,2±2,80 50,1±3,00 48,8±3,90 45,9±4,60
Актин (5) 116,1±8,00 136,2±8,10 98,8±7,20*2 101,1±8,10*2
Г3ФД (6) 56,0±4,10 42,4±3,70*1 44,4±3,40*1 57,1±4,20*2,3
Тропомиозин (7) 66,4±4,90 75,1±6,80 72,2±6,50 68,4±4,60
ГБТ (8) 61,4±5,00 58,9±5,10 77,1±5,90*2 62,2±4,70*3
СЕГ 0,95±0,11 1,25±0,13*1 1,32±0,15*1 1,10±0,13
ССЭ 16,4±1,30 29,2±2,10*1 27,7±2,10*1 25,6±2,30*1
МДА 3,20±0,30 4,90±0,25^ 4,00±0,45*2 4,20±0,32*1,2
а-спектрин
Рис. 3. Структурно-функциональные свойства эритроцитов животных с экспериментальным острым панкреатитом на 5-е сутки от моделирования на фоне фармакологической коррекции. Условные обозначения: 1 - радиусом окружности отмечены показатели у животных с ЭОП без
введения препаратов (1 группа); 2---------показатели у животных с ЭОП, получавших полиок-
сидоний и мексидол (2 группа); 3 - ..... - показатели у животных с ЭОП, получавших абактал
и мексикор (3 группа); 4 - О - р < 0,05 между показателями 2 и 3 групп по отношению к 1 группе; 5 - □ - р < 0,05 между показателями 3 и 2 групп.
нием на иммунокомпетентные клетки и их метаболизм, а на эритроцитарную мембрану, которая, в свою очередь, влияет на их взаимоотношения.
Механизм влияния физиотерапевтических факторов при воздействии их на эритроциты скорее всего обусловлен непосредственным механическим воздействием на архитектонику эритроцитарной мембраны, в первую очередь тяжелой фракции эритроцитов, изменения которой приводят к изменению характера распознавания их макрофагами селезенки, которые, выделяя в системный кровоток ци-токины, регулируют эритропоэз к красном костном мозге и созревание легкой фракции эритроцитов.
Использованные фармакологические препараты, такие как мексидол и мексикор, нивелируя оксидантный стресс, развивающийся в условиях острого панкреатита, стабилизируют фосфолипидный слой эритроцитарной мембраны, тем самым предотвращают потерю пристеночных белков, что уменьшает изменения антигенной поверхности мембран эритроцитов. Механизм влияния полиокси-дония и абактала на физико-химические свойств эритроцитов остается пока недостаточно ясным. Возможно, нормализующие действие их на функцию фагоцитов, являющихся важными поставщиками неокислен-ных радикалов, обусловливает их корригирующее влияние в отношении структурнофункциональных свойств эритроцитарной мембраны.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алехин С.А., Емельянов Р.А., Назаренко Д.П. Моделирование острого панкреатита у крыс. -Курск, 2006. - 64 с.
2. Банкова В.В., Прищепова Н.Ф., Авратин-ский О.И. Способ оценки патологических изменений плазматической мембраны у детей при различных заболеваниях // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 1987. - № 3. -С. 78-81.
3. Лазарева Г.А., Бровкина И.Л., Лазарев А.И. и др. Иммунометаболические эффекты регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза. - Курск: КГМУ, 2006. - 329 с.
4. Лазарева Г.А., Конопля А.А. Иммунометабо-лические нарушения и их коррекция при различных формах анемии // Окислительный, энергетические и иммунный гомеостаз
(нарушение и коррекция). - Курск, 2003. - С. 35-66.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1980. - 243 с.
6. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. - М.:ООО "Изд-во Новая Волна", 2000. - 540 с.
7. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Стеновая Е.А. и др. Клинический патоморфоз эритроцита (атлас) / Томск: Изд-во Томского ун-та, 2003. - 208 с.
8. Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., Быстрова Н.А. и др. Эритроциты и регуляция иммунного гомеостаза (материалы открытия). -Курск: КГМУ, 2006. - 132 с.
9. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Типовые нарушения молекулярной организации мембраны эритроцита при соматической и психической патологии // Успехи физиологических наук. - 2004. - Т. 1, № 1. - С. 53-65.
10. Семко Г.А. Структурно-функциональные изменения мембран и внешних примембранных слоев эритроцитов при гиперэпидермопоэзе // Украинский биохимический журнал. - 1998. -Т. 70, № 3. - С. 113-118.
11. Суняйкина О.А., Бровкина И.Л., Быстрова Н.А. Протективное действие активаторов биологического окисления при тепловом поражении // Вестн. Уральской Мед. акад. науки. - Екатеринбург, 2006. - № 3-1(14). - С. 23-24.
12. Тогайбаев А.А., Кургузкин А.В., Рикун И.В. Способ диагностики эндогенной интоксикации // Лаб. дело. - 1988. - № 9. - С. 22-24.
13. Хмелевская Ю.В., Смахтин М.Ю., Конопля А.И. Применение макролидов для коррекции иммунного ответа при экспериментальном панкреатите // Фундаментальные исследования. - 2005. - № 5. - С. 117.
14. Beutler E. How do red cell enzymes age a new perspective // Brit. J. Haemat. - 1985. - V. 61. -P. 377-384.
15. Dodge G.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghosts of human erythrocytes // Arch. Biochem. Biophys. - 1963. - V. 100. -P. 119-130.
16. Fairbanks G., Steck T., Wallach D. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. -1971. - V. 10. - P. 2606-2616.
17. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680.
18. Wang R.N., Kloppel G., Bouwens L. Duct to islet cell differention and islet growth in the pancreas of duct ligated adult rats // Diabetologia. -1995. - № 38. - P. 1405-1411.
