CC BY
38
S3
13. Curran-Everett D. Multiple comparisons: philosophies and illustrations. Am. J. of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology 2000; 1 (279): l-8.
14. Jost W.H., SchonrockL. M., CheringtonM. Autonomic nervous system dysfunction in lightning and electrical injuries. NeuroRehabilitation 2005; 1 (20): 19-23.
15. Spies C, Trohman R. G. Narrative review: Electrocution and life-threatening electrical injuries. Annals of internal medicine 2006; 7 (145): 531-37.
УДК 612.017.122.3:616-005.1-036.882-08-078.75]-092.9
© Д.А. Еникеев, Е.А. Нургалеева, Л.В. Нагаева, Г.А. Байбурина, В.И. Лехмус, Н.В. Нургалеев, 2009
Д.А. Еникеев, Е.А. Нургалеева, Л.В. Нагаева, Г.А. Байбурина, В.И. Лехмус, Н.В. Нургалеев ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ И УРОВЕНЬ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПОСЛЕ ПЕРЕНЕСЕННОЙ СМЕРТЕЛЬНОЙ КРОВОПОТЕРИ И РЕАНИМАЦИИ У КРЫС
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Целью экспериментального исследования являлось изучение состояния фагоцитоза и уровня провоспалительных цито-кинов на протяжении 35 суток после смертельной кровопотери. Эксперимент выполнен на 210 беспородных белых крысах массой 190-220 г под кетаминовым наркозом (2 мг/кг). На протяжении всего периода наблюдения выявлялись нарушения в системе фагоцитоза, что проявлялось снижаем фагоцитарного числа, изменением фагоцитарного индекса. Клеточные реакции в ранние сроки после оживления проявлялись нейтрофильным лейкоцитозом, а в поздние сроки - моноцитозом. Стойкое повышение содержания провоспалительных цитокинов (а-ФНО) на протяжении всего периода после оживления сопровождалось изменениями фагоцитарной активности крови.
Ключевые слова: смерть, реанимация, животные, крысы, цитокины, фагоцитоз.
D.A. Enikeyev, E.A. Nurgaleyeva, L.V. Nagayeva,
G.A. Baiburina V.I. Lekhmus M.A. Aleksandrov., N.V. Nurgaleyev PHAGOCYTE ACTIVITY AND THE LEVEL OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES AFTER MORTAL BLOOD LOSS AND RESUSCITATION IN RATS
The purpose of the experimental investigation was to study the phagocyte condition and the level of pro-inflammatory cytokines during the 35 day period after mortal blood loss. The experiment was carried out on 210 mongrel white rats weighing 190-200 g by using ketamin anesthesia (2 mg/kg). The phagocyte system disorders associated with an increase in phagocyte number, and changes in the phagocyte index were observed within the whole experimental period. Cellular reactions were caused by neutrophilic leukocytosis in the early period, and monocytosis in the late one. A steady increase in the content of pro-inflammatory TNF-a cytokine observed within the whole period after resuscitation was accompanied by changes in blood phagocyte activity.
Key words: death, resuscitation, animal, rats, neurophysiology, cytokines, phagocytosis.
Общеизвестно, что устойчивость организма к экстремальным повреждениям, токсическим агентам в значительной мере определяется его неспецифической резистентностью и, в частности, состоянием системы фагоцитоза. Многочисленными исследованиями доказано, что развитие экстремальных состояний сопровождается сложной структурно- функциональной перестройкой клеточных элементов системы фагоцитов, играющей ключевую роль в исходе постагрессивных состояний [1,8]. Так снижение функциональной активности фагоцитов у больных в раннем (3-и сутки) по-стреанимационном периоде относится к фактору риска развития летального исхода [11].
Не менее важными представляются сведения об изменении при терминальных состояниях гуморальных факторов, участвующих в реализации иммунных реакций. Принципиально важную роль в развитии системных расстройств метаболизма играют медиаторные системы и в первую очередь цитокины. Цитокины вырабатываются прежде всего клетками иммунной системы, но также и другими типами клеток мезенхимального происхождения и эпителиальных тканей. Секрети-руемые цитокины способствуют непрерывной ак-
тивации всех типов иммуннокомпетентных клеток, отвечающих за противоинфекционную защиту. Любая антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов первого поколения -интерлейкина 1 (1Ь-1), интерлейкина 6 (1Ь-6), фактора некроза опухоли - а (а-ФНО), которые индуцируют биосинтез цитокинов второго поколения- ГЬ-2, ГЬ-3 и др. Цитокины второго поколения вновь оказывают влияние на биосинтез ранних цитокинов, что позволяет не только регулировать иммунный ответ, но и усиливать его, вовлекая в реакцию все возрастающее количество клеток. Бесконтрольно выделяемые цитокины превращаются из факторов иммунной защиты организма в факторы агрессии. Именно «цитокиновая буря» приводит к микротромбозам сосудов и нарушению микроциркуляции в органах и системах, способствует системной вазодилятации, патологическому депонированию крови, прогрессирующей гиповолемии, что усугубляет тяжесть состояния [4,9].
Целью настоящего исследования явилось изучение состояния фагоцитоза и цитокинов для выяснения патогенетических механизмов нарушения неспецифической резистентности организма в
постреанимационном периоде от острой кровопо-тери.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 210 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 190-220 г под кетаминовым наркозом (2 мг/кг). Клиническую смерть продолжительностью 6 мин вызывали острым одномоментным кровопусканием из сонной артерии до момента наступления клинической смерти. Началом клинической смерти считали момент последнего вдоха. Реанимационные мероприятия проводились инфузией аутогенной крови с гепарином (0,01мл), проведением наружного массажа сердца и искусственной вентиляции легких до стабилизации самостоятельного дыхания. В период оживления фиксировалось появление сердечной деятельности, первого вдоха и самостоятельного дыхания. Контрольная группа крыс подвергалась аналогичному наркозу без моделирования клинической смерти.
Наблюдение за динамикой общего состояния животных проводилось в течение 5 недель после эксперимента. Абсолютное количество лейкоцитов в 1мкл капиллярно-венозной крови, полученной из сосудов хвоста, определяли путем подсчета в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу определяли в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Абсолютное количество нейтро-филов и моноцитов рассчитывали исходя из процентного содержания их в лейкоцитарной формуле и абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. Рассчитывался лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по формуле Я. Я. Кальф-Калифа. Для характеристики фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов применялся фагоцитоз латекса с вычислением фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса [7].
Цитокины определялись с помощью стандартных диагностических наборов иммунофер-ментного анализа фирмы «Вектор бест». В сыворотке крови исследовано содержание а-ФНО, ИЛ-1Р, ИЛ-6. Статистическая обработка результатов велась с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни для независимых выборок.
Результаты и обсуждение
Процент успешной реанимации составил 73,3% (154 крысы). Восстановление сердечной деятельности происходило в сроки 1,3±0,26 мин, а самостоятельного дыхания на 18,15±3,4 мин после начала реанимации. Общая летальность составила 30,4% (64 крысы). В первые 6 часов наблюдения погибло 18 животных (28,1%), к концу первых суток еще 35 крыс (54,7%). Летальность в поздние сроки постреанимационного периода составила 15,6 % (10 крыс). В первые часы после оживления животные находились в угнетенном состоянии, отсутствовали произвольные движения. В течение первых 6 часов определялись атония всех мышечных групп, отсутствие болевого рефлекса, нарушение терморегуляции. К 12 часам постреанима-ционного периода брадикардия сменялась тахикардией, животные начинали принимать еду. От-
четливая положительная динамика восстановления появлялась с конца первых суток эксперимента.
Результаты проведенного исследования свидетельствовали об изменении количества и функциональной активности клеток белой крови. Динамика общего содержания лейкоцитов (табл.1) в постреанимационном периоде носила волнообразный характер. В первые сутки наблюдалось достоверное повышение данного показателя (р=0,0002) на 160%. В последующие сутки произошло уменьшение числа лейкоцитов в периферической крови, но показатели были в основном выше контрольных величин. Достоверно высокие значения наблюдались на 5-е (р=0,0185), 14-е (р=0,0004), 21-е (р=0,0004) и 28-е сутки (р=0,0263). Лейкоцитоз у больных с экстремальными состояниями имеет по данным Ю.В. Редькина и соав., (1985) перераспределительную природу и обусловлен нейрогуморальными сдвигами, вызывающими сильное раздражение костного мозга и выход из него в кровь большого количества резервных клеток.
Таблица 1.
Динамика абсолютного содержания лейкоцитов, нейтрофилов и моно-
цитов в перифе рической крови крыс после оживления М±т, (х109/л).
Сроки исследования п Общее количество лейкоцитов Абс. число ней-трофилов Абс. число моноцитов
Контроль 10 14,25±0,35 8,85±0,50 0,70±0,03
1-е сут 12 23,18±0,80 р=0,0002*** 19,43±1,18 р=0,0005*** 0,65±0,05 р=0,1752
3-е сут 14 15,50±0,69 р=0,1651 11,16±0,78 р=0,0343* 0,94±0,14 р=0,0,046*
5-е сут 10 16,375±0,70 р=0,0185* 12,26±0,80 р=0,0052 1,01±0,07 р=0,0015**
7-е сут 13 14,74±0,65 р=0,6568 11,68±0,84 р=0,0210* 0,77±0,05 р=0,1490
10-е сут 15 16,15±0,83 р=0,0685 14,50±0,79 р=0,0005*** 0,68±0,04 р=0,3547
14-е сут 8 20,25±1,05 р=0,0004*** 16,80±0,62 р=0,0006*** 0,66±0,05 р=0,1659
21-е сут 7 20,45±0,90 р=0,0004*** 16,01±0,63 р=0,0005*** 0,91±0,05 р=0,0471*
28-е сут 10 16,29±0,73 р=0,0263* 13,31±0,77 р=0,0011*** 1,03±0,07 р=0,0137*
35-е сут 12 16,2±1,02 р=0,0620 14,46±0,79 р=0,0008*** 0,91±0,05 р=0,0236*
* Достоверность р<0,05; **Достоверность р<0,01; ***Достоверность р<0,001
Абсолютное содержание нейтрофилов в группе экспериментальных животных во все сроки наблюдения было выше контрольных величин, причем отклонения от показателей нормы достоверны. Абсолютное содержание моноцитов периферической крови в ранние сроки наблюдения (до 3-х суток) снижалось, зато в последующие сутки и особенно в поздние сроки постреанимационного периода (после 21 суток) данный показатель был достоверно выше контрольных величин. Количественные колебания лейкоцитов в периферической крови сопровождались изменением фагоцитарной активности клеток белой крови. Так, фагоцитарное число было достоверно выше на 1-е и 3-и сутки после реанимации (р=0,007 и р=0,003 соответственно), а в последующие сроки шло его угнетение вплоть до 21-х суток. После незначительного роста на 28-е сутки фагоцитарное число к концу периода наблюдения вновь было ниже контрольных величин. Фагоцитарный индекс во все сроки наблюде-
ния был достоверно ниже контрольных величин. На 3-и, 14-е и 21-е сутки отмечалось приближение фагоцитарного индекса к контрольным цифрам.
Несмотря на положительную динамику неврологического статуса, в крови реанимированных крыс наблюдались достоверно высокие значения лейкоцитарного индекса интоксикации на 1-е, 3-и, 7-е сутки (табл.2). Тенденция к его повышению отмечалась на 5, 28 и 35-е сутки после оживления. Лишь на 21-е сутки ЛИИ был ниже исходных значений. Интоксикация организма в раннем постреа-нимационном периоде обусловлена образованием и накоплением в органах и тканях во время клинической смерти недоокисленных продуктов, биологически активных веществ, гормонов, а с началом рециркуляции и реоксигенации происходит вымывание их в кровь. В дальнейшем выраженные микроциркуляторные нарушения, выявляемые даже на 35-е сутки после оживления [3], приводят к деструктивным процессам в тканях, всасыванию из кишечника бактериальных токсинов и тем самым к поддержанию эндотоксинемии. Хорошо известна способность эндотоксина интенсифицировать функцию костного мозга и в частности,
активировать миелоцитарныи росток, что наряду с лейкоцитозом обусловливает сдвиг леИкоцитарноИ формулы влево [5].
Таблица 2
Динамика показателей фагоцитоза и лейкоцитарного индекса интоксикации в постреанимационном периоде, М±т.
Сроки Лейкоцитарный индекс интоксикации Фагоцитарное число Фагоцитарный индекс
п М±т п М±т п М±т
Контроль 4 0,064±0,025 6 43,83±1,25 6 7,3±0,31
1-е сут 8 0,552±0,139 р=0,017* 7 53,43±2,02 р=0,007** 7 3,34±0,09 р=0.009**
3-е сут 9 0,166±0,039 р=0,045* 7 59,00±1,57 р=0,003** 7 6,58±0,18 р=0.093
5-е сут 9 0,066±0,025 р=0,640 6 37,67±3,80 р=0,298 6 5,44±0,15 р=0.009**
7-е сут 8 0,229±0,049 р=0,027* 6 40,33±4,9 р=0,522 6 3,68±0,11 р=0.009
10-е сут 6 0,336±0,135 р=0,340 6 37,83±4,33 р=0,262 6 3,0±0,26 р=0.009
14-е сут 6 0,089±0,016 р=0,200 6 41,67±5,74 р=0,5756 6 6,5±0,17 р=0.05*
21-е сут 6 0,058±0,012 р=0,670 6 47,67±2,72 р=0,128 6 5,26±0,29 р=0.009**
28-е сут 6 0,192±0,061 р=0,055 6 50,33±6,10 р=0,262 6 3,46±0,25 р=0.009**
35-е сут 8 0,181±0,041 р=0,062 6 40,17±1,83 р=0,173 6 5,2±0,34 р=0.009**
* Достоверность р<0,05; ** Достоверность р<0,01;
Динамика содержания провоспалительных цитокинов в плазме крови крыс в постреанимационном периоде (М±т), пг/мл
Таблица 3
Цито- Пока- Конт- Сутки постреанимационного периода
кины затели роль 1 3 5 7 10 14 21 28 35
Ч К п 4 5 6 9 4 4 3 5 3 7
М±т 7,27±0,438 6,23±0,67 5,98±0,19 5,97±0,25 6,175±0,904 6,075±0,66 4,88±0,169 5,42±0,537 4,26±0,033 5,09±0,109
р 0,026* 0,015* 0,02* 0,31* 0,18 0,007** 0,036* 0,002** 0,002**
ИЛ6 п 4 5 5 11 4 4 3 3 4 7
М±т 3,62±0,025 3,96±0,19 3,64±0,14 3,64±0,11 3,57±0,05 4,86±0,23 3,46±0,08 3,75±0,37 3,45±0,02 5,67±0,21
р 0,176 0,92 0,93 0,47 0,351 0,1 0,7 0,002** 0,87
п 4 4 7 8 4 4 3 6 3 5
о к е М±т 4,12±0,025 14,25±1,06,25 6,18±0,11 6,18±0,008 8,1±0,1 12,12±2,95 5,36±0,006 6,33±0,16 8,28±0,101 9,62±0,15
р 0,0002 *** 0,07 0,042* 0,0081 ** 0,0001 *** 0,012 * 0,033 * 0,001 ** 0,0001 ***
* Достоверность р<0,05;
** Достоверность р<0,01;
*** Достоверность р<0,001
При анализе содержания а-ФНО обнаружено его увеличение во все сроки наблюдения, причем в большинстве случаев повышение носило достоверный характер (табл.3). Другие же провос-палительные цитокины (ИЛ1Р, ИЛ6) в динамике после оживления значительно не возрастали, а ИЛ1р в некоторые сроки был даже несколько ниже контрольных величин.
Таким образом, на протяжении всего периода исследования в периферической крови отмечался лейкоцитоз. В раннем постреанимационном периоде он носил нейтрофильный характер. В основе данного явления могут лежать несколько механизмов. С одной стороны, постреанимационное состояние многие исследователи рассматривают с позиции стресс-реакции, действием стресс-гормонов объясняется повышение содержания лейкоцитов в ранние сроки после оживления [2,12], с другой - лейкоцитоз в постреанимацион-ном периоде, может быть результатом стимуляции костно-мозговой пролиферации. Главным индуктором роста миелоидного ростка является колониестимулирующий фактор гранулоцитопоэза (Г-КСФ), основным источником которого являются тканевые макрофаги[8]. Выделение Г-КСФ стимулируется главным образом цитокинами, причем
основная роль отводится а-ФНО, ИЛ1Р, а также эндотоксинам. В нашем исследовании на всем протяжении наблюдались повышенные концентрации а-ФНО, а также был повышен ЛИИ. В ходе эксперимента было обнаружено, что, несмотря на увеличение клеток лейкоцитарного ряда, снижалось количество фагоцитарно активных клеток крови, что проявилось снижением фагоцитарного числа. Это может быть связано с продукцией цитокинов. По данным [10], цитокины, присутствующие в первые 24 часа после геморрагического шока, способны вызывать толерантность к липо-полисахаридам бактерий и подавлять функцию клеток иммунной системы с помощью супрессоров цитокин сигнальных белков-3. Это свидетельствует о дефектах реактивности фагоцитирующих клеток. В поздние сроки постреанимационного периода лейкоцитарный профиль претерпевал существенные изменения. Количество моноцитов было достоверно выше контрольных значений в более поздние сроки после оживления. Это может быть связано со снижением активности гипотала-мо-гипофизарно-надпочечниковой системы, а также подключением специфических механизмов защиты в ответ на поступление в кровоток тканевых антигенов из тканей, подвергшихся ишемии и
реперфузии с образованием иммунных комплексов.
Выводы
1. Клеточные реакции периферической крови в постреанимационном периоде характеризуются системностью: для ранних сроков после оживления характерен нейтрофильный лейкоцитоз, а для поздних стадий - моноцитоз, что свидетельствует о подключении иммунных механизмов.
2. Фагоцитарные реакции клеток белой крови в постреанимационном периоде претерпевают существенные изменения, достоверно повышаясь в ранние сроки (до 3-х суток) с тенденцией к депрессии в дальнейшем.
Изменения фагоцитарной активности крови сопровождаются стойким повышением содержания провоспалительных цитокинов (а-ФНО) на протяжении всего периода после оживления.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ананьева С.К. Динамика некоторых иммунологических показателей в постреанимационом периоде: Автореф.дисс....канд.мед. наук-М..197З.
2. Волков А.В., Мишарина Г.В., Алексеева Г.В., Муравьев О.Б. Эндокринные синдромы при критических состояниях //Вестн. Рос. АМН.- 1997.- № 10.- C. 13-17.
3. Еникеев Д.А., Нургалеева Е.А., Идрисова Л.Т., Самигуллина А.Ф., Лаптев О.В. Морфофункциональные изменения в головном мозге и сетчатке глаза в постреанимационном периоде (экспериментальное исследование). //Общая реаниматология.- 2GG8. -Т. 4. -№1. -С.21-2З
4. Зильбер А.П. Медицина критических состояний. - Петрозаводск: Издательство Петрозаводского университета, 199З. -360с.
З. Пермяков Н.К., Яковлев М.Ю., Галанкин В.Н. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита //Архив патологии. -1989. -№З. -С. 3-11.
6. Редькин Ю.В., Соколова Т.Ф. Динамика показателей периферической крови у больных с тяжелой механической травмой//Лаб. дело.-198З.-№З. -С.28З-289.
7. Шишкин В.Л., Сперанский В.В., Загидуллин Ш.З., Филиппов В.В., Ганцева Х.Х. Алехин Е.К. Принципы и методы выявления иммунопатологических состояний при инфекционных аутоиммунных и аллергических заболеваниях: информационно- методическое письмо. -Уфа. 1987. -49с.
8. Berghem L; Lahnborg G; Jarstrand C. Role of phagocyte cells in host defence in relation to trauma--a brief review. Source:Acta Chirurgica Scandinavica. Supplementum [Acta Chir Scand Suppl] 1979; Vol. 489, pp. 231238.
9. Giovamballista A., Chisari A.N./ Corro L., et al. Metabolic, neuroendocrine and immune functions in basal conditions and during the acute- phase response to endotoxic shock in undernourished rats //Neuroimmunomodulation /. -2GGG -Vol.7. -№2. -P. 92-98.
1G. Grutkoski PS; Chen Y; Chung CS; Cioffi WG; Ayala A Putative mechanism of hemorrhage-induced leukocyte hyporesponsiveness: induction of suppressor of cytokine signaling-3. // The Journal Of Trauma, -2GG4. Apr; Vol. З6 (4), pp. 742-7;
11. McCallion K; McAuley DF; Harkin DW; McCarroll CP; Brown GE; Lavery G; Gardiner KR Phagocyte priming as a prognostic indicator in the intensive care unit. // The Journal Of Trauma, -2GG3 Dec; Vol. ЗЗ (б), pp. 1089-94.
12. Stanford G.G. The stress pesponse to trauma and critical illness. //Crit-Care-Nurs-Clin-North-Am, -1994. v.4. p.693-702
УДК 616.-8З1-00З.4-0З6.882-08-078] -092.9
© Д. А. Еникеев, Е.А. Нургалеева, А.Ф. Самигуллина, Л.В. Нагаева, М.А. Александров, Г.Г. Халитова, 2009
Д.А. Еникеев, Е.А. Нургалеева, А.Ф. Самигуллина, Л.В. Нагаева, М.А. Александров, Г.Г. Халитова ЦИТОКИНЫ И ПОСТИШЕМИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ СМЕРТЕЛЬНОЙ КРОВОПОТЕРИ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Целью экспериментального исследования являлось изучение состояния микроциркуляции головного мозга и уровня провоспалительных цитокинов на протяжении 35 суток после смертельной кровопотери. Эксперимент выполнен на 180 неинбердных белых крысах массой 190-220 г под кетаминовым наркозом (2 мг/кг). На протяжении всего периода наблюдения выявлялись нарушения в системе микроциркуляции головного мозга крыс, более выраженные в ранние сроки. Наблюдалось значительное повышение уровня ТОТ-а во все сроки наблюдения, а повышения уровня другого провоспалительно-го цитокина 1Ь-1р не обнаружено.
Ключевые слова: смерть, реанимация, модель заболевания, животные, неврология, мозг, цитокины.
