CC BY
76
ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗ ЧЕЛОВЕКА
БУТВИЛОВСКИЙ А.В.*. БАРКОВСКИЙ Е.В.**.
БУТВИЛОВСКИЙ В.Э.***
УО «Белорусский государственный медицинский университет» центральная научно-исследовательская лаборатория *, кафедра общей химии**, кафедра биологии ***
Резюме. Изучены эволюционные взаимоотношения алкогольдегидроге-наз (АДГ) человека. Возникновение отдельных классов АДГ человека достоверно происходило в последовательности (3 класса 2 класса 5 класс ^ 4 класс ^ 1 класс). а затем в пределах первого класса выделились три подкласса (1А. 1В и 1С). Предложена структурно-функциональная классификация алко-гольдегидрогеназ человека. согласно которой АДГ разделены на метаболизи-рующие формальдегид и хиноны (2 и 3 класс) и метаболизирующие спирты (1. 4 и 5 класс).
Ключевые слова: эволюционная дистанция. дендрограмма. время дивергенции. классификация. алкогольдегидрогеназа.
Abstract. We studied evolutional relationships of human alcohol dehydrogenases (ADH). Separate alcohol dehydrogenase's classes authentically appeared in a sequence class 3^ class 2 ^ class 5 ^ class 4 ^ class 1 and then in limits of the first class three subclasses were selected. We offered structural and functional classification of human alcohol dehydrogenases. according to which ADH are divided into a metabolizing formic aldehyde and quinones (2 and 3 classes) and metabolizing alcohols (1. 4 and 5 classes).
Адрес для корреспонденции: Республика
Беларусь. 220116. г. Минск. пр Дзержинского. 83. т. (017) 272-65-98. (0295) 65-50-00. Бутвиловский А.В.
По ряду причин исследования в области молекулярной эволюции принято начинать с анализа аминокислотных последовательностей. Во-первых, они более консервативны и поэтому дают информацию о долгосрочной эволюции генов и видов. Во-вторых, аминокислотные последовательности важны для выравнивания белок-кодирующих участков последовательностей нуклеиновых кислот. И, в-третьих, математическая модель эволюционных изменений амино-
кислотных последовательностей значительно проще таковой последовательностей ДНК и мРНК. К основным параметрам эволюции аминокислотных последовательностей относятся значения коэффициентов сходства. полученные при проведении BLAST-анализа. эволюционные дистанции. а также вычисленные на их основе скорости молекулярной эволюции. времена дивергенции и другие показатели.
Цель исследования: установить эволюционные взаимоотношения алко-гольдегидрогеназ человека и разработать их структурно-функциональная классификацию.
Методы.
Проанализированы и выровнены с помощью программы Clustal W [13] аминокислотные последовательности алкогольдегидрогеназ человека классов 1А. 1В. 1С [12]. 2 [11]. 3 [10]. 4 [9]. 5 [14]. а также кодирующие их нуклеотидные последовательности мРНК. Эволюционные дистанции и их ошибка вычислены по методам EIM (equal input model. модель равных вставок [4]) и Джонса-Тейлора-Торнтона (Jones-Taylor-Thornton. JTT [5]). Дендрограммы построены с помощью NJ-метода (neighbor-joining. метод связывания ближайших соседей [6]). Для статистического подтверждения корректности дендрограмм методом бутстрэп определены значения В^ (bootstrap confidence level) [6].
Результаты.
Эволюционные дистанции между аминокислотными последовательностями алкогольдегидрогеназ человека представлены в табл. 1.
Таблица 1
Эволюционные дистанции, определенные методами EIM и JTT, и их
ошибка
для аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогеназ человека
Класс АДГ 1А 1В 1С 2 3 4 5
1А 0,067± 0,0132 0,075± 0,0135 0,510± 0,0417 0,464± 0,0387 0,382± 0,0346 0,472± 0,0381
1В 0.067± 0.0134 0,058± 0,0125 0,505± 0,0412 0,477± 0,0394 0,374± 0,0342 0,450± 0,0371
1С 0.075± 0.0134 0.058± 0.0123 0,519± 0,0417 0,477± 0,0401 0,374± 0,0337 0,468± 0,0381
2 0.563± 0.0483 0.547± 0.0460 0.567± 0.0465 0,485± 0,0394 0,540± 0,0437 0,531± 0,0444
3 0.505± 0.0447 0.514± 0.0442 0.521± 0.0451 0.529± 0.0465 0,511± 0,0410 0,540± 0,0433
4 0.392± 0.0348 0.384± 0.0348 0.390± 0.0348 0.612± 0.0524 0.564± 0.0489 0,516± 0,0415
5 0.510± 0.0427 0.493± 0.0426 0.504± 0.0417 0.599± 0.0504 0.573± 0.0480 0.543± 0.0440
Примечание. Ошибка эволюционных дистанций определена методом бутстрэп при 1000 повторов. Эволюционные дистанции, вычисленные методом Е1М, и их ошибка выделены жирным шрифтом.
Эволюционные взаимоотношения между аминокислотными последовательностями алкогольдегидрогеназ человека представлены на дендрограмме. построенной методом N1 на основании 1ТТ-дистанций с АДГ 3 нематоды в качестве внешней группы (рис. 1).
100
96
98
ДОИЭ Ив
48
100
ДОИ1Б Ив - ДОИ1С Ив -ДОИ1Д Ив
-------ДОИ4 Ив
--------ДРИ5 Ив
ДОИ2 Ив
ДОИЭ Се
I------------1
0.05
Рис. 1. Дендрограмма для аминокислотных последовательностей алкогольде-
гидрогеназ человека Примечание. Над точками ветвления указаны значения ВСЬ.
После обработки методом бутстрэп (при 1000 повторов) при вероятности безошибочного прогноза более 95% полученная дендрограмма несколько меняет свой вид (рис. 2).
Рис. 2. Дендрограмма. обработанная методом бутстрэп. для аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогеназ человека Примечание. Над точками ветвления указаны значения ВСЬ.
Эволюционные взаимоотношения между последовательностями мРНК, кодирующими АДГ человека. представлены на дендрограмме. построенной методом N1 на основании дистанций Кимуры с АДГ 3 нематоды в качестве внешней группы (рис. 3).
зд.--ДОИ1Б Ив
100 ---ДОИ1С Ив
99
ДОИ1Д Ив
98
ДОИ4 Ив
100
ДОИ5 Ив
ДОИ2 Ив
ДОИЭ Ив
ДОИЭ Се
0.05
Рис. 3. Дендрограмма для нуклеотидных последовательностей мРНК. кодирующих алкогольдегидрогеназы человека Примечание. Над точками ветвления указаны значения ВСЬ.
Полученная для последовательностей мРНК дендрограмма после обработки методом бутстрэп (при 1000 повторов) при уровне вероятности безошибочного прогноза более 95% несколько модифицируется (рис. 4).
Рис. 4. Дендрограмма. обработанная методом бутстрэп. для нуклеотидных последовательностей мРНК. кодирующих алкогольдегидрогеназы человека Примечание. Над точками ветвления указаны значения ВСЬ.
Обсуждение.
В табл. 1 выделяются малые эволюционные дистанции между алкоголь-дегидрогеназами 1А. 1В и 1С. колеблющиеся в пределах 0.058-0.075. В то же время значения эволюционных дистанций между ферментами других классов почти на порядок выше. Это наводит на мысль об эволюционной близости вышеназванных изоферментов алкогольдегидрогеназ человека и свидетельствует
о правильности их объединения в один класс. что и сделано в классификациях Х. Эденберга [8] и Г. Дуэстера [7].
ДОИ1Б Ив
ДОИЭ Се
Примечательно. что значения ЕТМ - дистанций и 1ТТ-дистанций очень близки. несмотря на то. что эти методы относятся к разным группам (ЕТМ - метод корректированной оценки эволюционных дистанций. а 1ТТ - метод. основанный на матрицах аминокислотных замен). Сходные средние значения АДГ 1А. 1В и 1С также свидетельствует в пользу целесообразности их объединения в один класс.
На рис. 2. значение ВСЬ. равное 100. характерно для точки ветвления АДГ класса 3 человека и внешней группы (АДГ класса 3 нематоды). что объясняется их принадлежностью к одному классу алкогольдегидрогеназ. На данной дендрограмме четко определяется последовательное возникновение от общих предшественников АДГ второго. пятого. четвертого и. наконец. первого классов. При этом три изофермента АДГ (1А. 1В и 1С) имеют общую точку ветвления при ВСЬ=100. что еще раз подтверждает их эволюционную близость.
Ранее нами установлены чрезвычайно малые эволюционные дистанции между последовательностями мРНК. кодирующими изоферменты алкогольде-гидрогеназ 1А. 1В и 1С. колеблющиеся в пределах 0.047-0.064; и высокие расчетные соотношения транзиций и трансверсий для них (1.886-3.193). Это также подтверждает их эволюционное сходство и свидетельствует о необходимости объединения в один класс. Также как и для эволюционных дистанций между аминокислотными последовательностями алкогольдегидрогеназ человека. значения эволюционных дистанций между последовательностями мРНК. соответствующими изоферментам других классов. почти на порядок выше. что говорит об их эволюционной отдаленности и невозможности объединения на основе эволюционных дистанций других классов АДГ.
Значения показателя ВСЬ для всех точек ветвления на рис. 3 выше таковых для аминокислотных последовательностей алкогольдегидрогеназ человека (рис. 1). На дендрограмме. показанной на рис. 4 более четко. чем на таковой для аминокислотных последовательностей (рис. 2). выделяется эволюционный предшественник (АДГ класса 3 нематоды). от которого при высоких значениях ВСЬ последовательно отходят АДГ человека 3. 2. 5. 4 и 1 классов. При этом ал-когольдегидрогеназы 1А. 1В и 1С имеют общую точку ветвления (ВСЬ=100).
Для определения времен. соответствующим точкам ветвления. нами методом N1 по эволюционным дистанциям Кимуры построена линеаризованная дендрограмма с АДГ 3 нематоды в качестве внешней группы и АДГ 1Е лошади в качестве реперной точки (90 млн. лет). Время существования предшественника АДГ 1В и 1С человека составило 28.1 млн. лет. АДГ 1В. 1С и 1А - 35.1 млн. лет.
Согласно построенной дендрограмме. время существования общего предшественника 1 и 4 классов равно 210.0 млн. лет; 1 и 5 - 264.7 млн. лет; 1 и 2 - 283.3 млн. лет. а 1 и 3 классов - 283.3 млн. лет. Однако эти времена не являются точными. поскольку не учитываются различия в скоростях эволюционных изменений изучаемых нуклеотидных последовательностей. Для учета этого фактора нами предложена методика их поправки. для которой необходимо предварительно вычислить скорости эволюции по общепринятой методике. Затем полученное время необходимо умножить на скорость эволюции наиболее
сходных последовательностей (в данном случае АДГ 1 класса) и разделить на скорость эволюции изучаемых последовательностей. Так время существования общего предшественника 1 и 3 классов равно 283.3 млн. лет х 0.60-10-9 замен на нуклеотидный сайт в год [3] /0.40-10-9 замен на нуклеотидный сайт в год (скорость эволюции АДГ 3 класса [1]) = 422.8 млн. лет. Эти данные согласуются с тем. что у трески обнаружен фермент со смешанными свойствами 1 и 3 классов. а общепринятое время дивергенции костных рыб составляет 405-410 млн. лет. Определить таким способом времена существования общих предшественников 1 и 4. 1 и 5. 1 и 2 классов не представляется возможным. поскольку в настоящее время секвенированы лишь нуклеотидные последовательности АДГ 2 и 5 классов грызунов и приматов. Определение скоростей эволюции по этим последовательностям приведет к значительному завышению истинных скоростей из-за высокой скорости эволюционных изменений нуклеотидных и аминокислотных последовательностей у грызунов.
Полученные нами ранее данные [2] по содержанию гуанина и цитозина в зависимости от положения кодона позволяют сформулировать следующую закономерность: Г1+Ц1>Г3+Ц3>Г2+Ц2. которая характерна для всех мРНК. кодирующих АДГ человека. за исключением алкогольдегидрогеназ 2 и 3 классов. в которых содержание гуанина и цитозина во втором положении больше. чем в третьем (Г1+Ц1>Г2+Ц2>Г3+Ц3). Существование двух закономерностей последовательного количественного распределения гуанина и цитозина в последовательностях мРНК. кодирующих АДГ человека. позволяет предположить наличие. по крайней мере. двух подсемейств АДГ человека. В пользу этого предположения также свидетельствует более низкий процент ГЦ3-кодонов (кодонов. содержащих в третьем положении гуанин или цитозин) в мРНК. кодирующих АДГ 2 и 3 классов (37.2% и 37.6% соответственно).
Таким образом. к первому подсемейству можно отнести АДГ 2 и 3 классов. а ко второму - 1. 4 и 5 классов. Возможность такой классификации АДГ подтверждена полученными дендрограммами (рис. 1-4). на которых алкоголь-дегидрогеназы 2 и 3 классов наиболее близки к корню. а. следовательно. являются наиболее филогенетически древними. В то же время алкогольдегидроге-назы 1. 4 и 5 классов. напротив. удалены от корня. Более того. АДГ 2 и 3 классов объединяет наличие детоксикационной функции. которая у АДГ 3 ярко выражена в отношении формальдегида. а у АДГ 2 - в отношении хинонов. Алко-гольдегидрогеназы 1. 4 и 5 классов преимущественно участвуют в метаболизме спиртов (этанола и ретинола). На основании этих данных нами предложена структурно-функциональная классификация среднецепочечных алкогольдегид-рогеназ человека (рис. 5). в которой АДГ разделены на метаболизирующие формальдегид и хиноны (2 и 3 класс) и метаболизирующие спирты (1. 4 и 5 класс). Следует сказать. что данная классификация полностью согласуется с функциональной классификацией АДГ по их чувствительности к пиразолу.
Рис. 5. Структурно-функциональная классификация алкогольдегидрогеназ человека
Выводы/Заключение.
Анализ полученных данных по аминокислотным последовательностям алкогольдегидрогеназ человека. а также кодирующим их последовательностям мРНК позволяет сделать ряд выводов об их эволюционных взаимоотношениях.
Эволюционные дистанции между изучаемыми аминокислотными и нуклеотидными последовательностями. расчетные соотношения транзиций и трансверсий указывают на высокое сходство АДГ 1А. 1В и 1С. что свидетельствует о корректности объединения их на основании эволюционных параметров в один класс. что отражено в классификациях Х. Эденберга и Г. Дуэстера.
Полученные дендрограммы для аминокислотных последовательностей АДГ и кодирующих их нуклеотидных последовательностей мРНК свидетельствует о том. что АДГ 3 нематоды является эволюционным предшественником алкогольдегидрогеназ человека. Возникновение отдельных классов АДГ человека достоверно происходило в последовательности (3 класса 2 класса 5 класс ^ 4 класс ^ 1 класс). а затем в пределах первого класса выделились три подкласса (1А. 1В и 1С). По предложенной нами методике. учитывающей различия скоростей эволюции. установлено время существования общих предшественников АДГ 1В и 1С (28.1 млн. лет). АДГ 1В. 1С и 1А (35.1 млн. лет). АДГ
1 и 3 классов (422.8 млн. лет).
На основании наличия двух закономерностей последовательного количественного распределения Г+Ц в последовательностях мРНК. кодирующих ал-когольдегидрогеназы. содержания ГЦ3-кодонов. полученных дендрограмм для аминокислотных последовательностей АДГ человека и кодирующих их мРНК. а также основных выполняемых функций все среднецепочечные АДГ человека разделены нами на 2 подсемейства. К первому подсемейству (алкогольдегидро-геназы. метаболизирующие формальдегид и хиноны) отнесены АДГ третьего и
второго классов. а ко второму семейству (алкогольдегидрогеназы, метаболизи-рующие спирты) - АДГ 1 (А. В. С). 4 и 5 классов.
Литература
1. Бутвиловский А.В.. Барковский Е.В. // Здравоохранение. - 2005.- №9.
- С. 11-15.
2. Бутвиловский. А.В. Молекулярные механизмы регуляции функции клетки: материалы международного симпозиума / А.В. Бутвиловский. Е.В. Барковский. - Тюмень: Издательство “ВекторБук”. 2005. - С. 275-277.
3. Бутвиловский А.В.. Барковский Е.В.. Бутвиловский В.Э. // Медицинский журнал. - 2005.- №4. - С. 30-33.
4. Бутвиловский А.В.. Барковский Е.В.. Бутвиловский В.Э. [и др.]. // Здравоохранение. - 2006.- №1.- С. 42-44.
5. Бутвиловский А.В.. Барковский Е.В.. Бутвиловский В.Э. [и др.] // Здравоохранение.- 2006.- №1. - С. 45-49.
6. Хрусталев В.В.. Барковский Е.В.. Бутвиловский А.В. [и др.] // Здравоохранение.- 2005.- №8. - С. 11-13.
7. Duester G.. Farres J.. Felder M.R. [et al.] // Biochem. Pharmacol. - 1999.
- Vol. 58 (3). - P. 389-395.
8. Edenberg. H.J. Alcohol dehydrogenases / H.J. Edenberg. W.F. Bosron; ed. F.P. Guengerich // In Comprehensive toxicology. - 1997. - Vol. 3. - P. 119-131.
9. Farres J.. Moreno A.. Crosas B. [et al.] // Eur. J. Biochem. - 1994. - Vol. 224(2). - P. 549-557.
10. Galter D.. Carmine A.. Buervenich S. [et al.] // Eur. J. Biochem. - 2003. -Vol. 270 (6). - P. 1316-1326.
11. Iida A. Saito S.. Sekine A. [et al.] // J. Hum. Genet. - 2002. - Vol. 47 (2).
- P. 74-76.
12. Ikuta T.. Szeto S.. Yoshida A. // Biochemistry. - 1986. - Vol. 25 (9). - P. 2465-2470.
13. Tompson J.D.. Higgins D.G.. Gibson T.J. // Nucl. Acids Res.. - 1994. - Vol. 22. - P. 4673-4680.
14. Zhi X.. Chan E.M. and Edenberg H.J. // J. DNA Cell Biol. - 2000. - Vol. 19(8). - P. 487-497.
