CC BY
60
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 612.018:612.017
ЭСТРИОЛ В ФОРМИРОВАНИИ ТОЛЕРОГЕННОГО ФЕНОТИПА МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ
И. В. Некрасоваа, С. В. Ширшева> ь, И. Ю. Данченкос
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; nirina5@mail.ru; (342)2808431
ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; shirshev@iegm.ru
с Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера, 614000, Пермь, ул. Петропавловская, 26; irene-dan@mail.ru
Исследовано влияние гормона беременности эстриола (Е3) на экспрессию фенотипических маркеров Т-регуляторных (Т^) и ТЫ7-продуцирующих лимфоцитов, а также активность индола-мин-2,3-диоксигеназы (ГОО) моноцитов больных рассеянным склерозом (РС) в сравнении со здоровыми донорами. Гормон повышает процент и активность ГОО, при этом снижая уровень ТЫ7-клеток. Установлено, что более выраженное влияние Е3 оказывает на клетки больных РС.
Ключевые слова: рассеянный склероз; эстриол; Т-регуляторные лимфоциты; ТЫ7-продуцирующие лимфоциты; индоламин-2,3-диоксигеназа.
Введение
Поскольку состояние беременности связывают со смещением баланса Т-хелперов (Th) с 1-го типа на 2-й, у беременных происходит улучшение течения Thl-опосредованных аутоиммунных заболеваний [Lorenzi, Ford, 2002], одним из которых является рассеянный склероз (РС). В основе данной патологии лежит аутоиммунный процесс, характеризующийся иммунным ответом в отношении собственного белка миелина и разрушением нервных волокон при участии Т-лимфоцитов и макрофагов [Steinman, 1996]. При этом известно, что одним из механизмов формирования иммунологической толерантности является активация индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) [Terness et al., 2005], которая может способствовать генерации Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) [Chen et al., 2008]. Кроме того, одним из наиболее значимых механизмов формирования толерантности, в том числе при аутоиммунных заболеваниях, является поддержание баланса между регуляторными субпопуляциями Th17/Treg [Darmochwal-Kolarza et al., 2012].
Эстриол (Е3) называют «гормоном беременности», поскольку у небеременных женщин он практически не определяется, а для его синтеза необходима скоординированная работа ферментативных систем как матери, так и плода [Kase, Reyniak, 1985].
В наших исследованиях продемонстрирована способность данного гормона эффективно регулировать различные функции лейкоцитов человека [Ширшев, Некрасова, 2008; Некрасова, Ширшев, 2010; Ширшев, Некрасова, Орлова, 2011]. Принимая во внимание тот факт, что при беременности меняется гормональный баланс, а продукция Е3 существенно возрастает, данный гормон является одним из вероятных кандидатов на роль фармпрепарата при аутоиммунных заболеваниях, связанных с повышенной активностью ТЫ-клеток. Продемонстрирован благоприятный эффект от применения Е3 в экспериментальной модели РС у мышей [Jansson, О^оп, Holmdahl, 1994; Palaszynski et э1., 2004]. Однако данные исследования единичны и требуют дальнейшего изучения.
Цель данной работы - оценка влияния Е3 на активность ГОО моноцитов, а также созревание и ТЫ7 клеток больных РС в сравнении со здоровыми донорами.
Материалы и методы
В работе исследовали мононуклеары периферической крови (МПК) пациентов с РС, согласно модифицированным диагностическим критериям МакДональда 2005 г., с ремитирующим типом течения заболевания, не подвергавшихся терапии препарата-
© Некрасова И. В., Ширшев С. В., Данченко И. Ю., 2013
96
ми, изменяющими течение РС, иммуномодулирующей терапии и находящихся в стадии клинической ремиссии; средний возраст пациентов - 36.3 22.52 лет, средний стаж заболевания - 3.67 21.61 лет, с показателем по расширенной шкале оценки инвали-дизации EDSS (Expanded Disability Status Scale) от 1.5 до 3.5 баллов. В качестве контроля использовали МПК здоровых доноров (средний возраст 32.7 29338 2.68 лет). Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-ве-рографина (1.077 г/см3).
Е3 использовали в концентрациях, соответствующих уровням данного гормона во время физиологически протекающей беременности: 2 нг/мл - I триместр и 20 нг/мл - III триместр. В качестве контроля использовали растворитель гормона.
Активность IDO в МПК определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кину-ренина - первого стабильного метаболита пути распада триптофана [Braun et al., 2005]. Для этого МПК, стимулированные интерфероном липополи-сахаридом (ЛПС) (100 нг/мл, «Sigma», США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана («Sigma», США), в течение 4 ч. с гормоном. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30%-ной трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. Затем в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BD 800 («Bio-Tek Instruments, Inc.», США). Для определения концентрации кинуренина в пробах строили кривую по калибровочным пробам 0-100 мкМ ки-нуренина («Sigma», США).
Для оценки фенотипических маркеров выделенные МПК инкубировали в пластиковых пробирках «Эппендорф» в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина) в течение 72 ч. при 37 2Ц в условиях 5% СО2 с Е3. По окончании инкубации оценивали фенотип лимфоцитов на проточном цитофлюориметре («Becton Dickinson», США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч. инкубации с Е3, составляла 95-98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли. Количество Treg оценивали как процент CD4+-лимфоцитов (Anti-human CD4 FITC), экспрессирующих FOXP3 (Anti-Human FOXP3 PE) и CTLA-4 (Anti-human CTLA-4 APC). Экспрессия внутриклеточного фак-
тора FOXP3 является наиболее надежным маркером Treg-клеток, сильнее коррелирующим с супрессорной активностью, чем коэкспрессия CD4 и CD25 [Fontenot et al., 2005]. А основным показателем функциональной активности Treg считается экспрессия маркера CTLA-4 (цитотоксический Т-лим-фоцитарный антиген-4). Данная молекула участвует в реализации ингибиторной функции регуляторных лимфоцитов и поддерживает гомеостаз иммунной системы при ответе на антигены [Brunner et al., 1999].
Количество Th17 оценивали как процент CD4+-лимфоцитов (Anti-human CD4 FITC), экспрессирующих транскрипционный фактор ROR-gamma-t (Antimouse/human ROR-gamma-t PE) и интерлейкина (IL)-17 (Anti-Human IL17A PE-Cy7). Специфическим транскрипционным фактором для данной популяции клеток является ROR-gamma t (ядерный ор-фановый рецептор-гамма для ретиноидов), имеющий критическое значение для продукции IL-17 [Korn et al., 2009].
Результаты и их обсуждение
Одним из факторов, способствующих поддержанию периферической толерантности, является экспрессия IDO антигенпрезентирующими клетками, к которым, в частности, относятся моноциты периферической крови. Данный фермент конвертирует триптофан в кинуренины, что, в свою очередь, приводит к гибели цитотоксических лимфоцитов и Th1 [Braun, Longman, Albert, 2005].
Установлено, что Е3 вне зависимости от концентрации усиливает активность IDO в МПК здоровых доноров. Исходная активность IDO больных РС была ниже, чем здоровых доноров. Однако под влиянием Е3 в концентрации, соответствующей III триместру беременности, активность IDO повышалась, причем даже в большей степени, чем у здоровых доноров (табл. 1).
Таблица 1
Модуляция активности ЛПС-индуцированной IDO под влиянием Е3
Гормональное воздействие Концентрация кинуренина, ^kM
Здоровые доноры Больные PC
Контроль 7.14±0.516 5.03±0.549#
Эстриол, 2 нг/мл 9.16±0.639* 5.50±0.317
Эстриол, 20 нг/мл 10.54±0.449* 11.42±0.947*#
Примечание. Здесь и далее * - р < 0.05 по сравнению с контролем; # - р < 0.05 по сравнению со здоровыми донорами.
Установлено, что уровень CD4+FOXP3+CTLA-4+ лимфоцитов больных РС, был изначально ниже, чем у здоровых доноров. Под влиянием Е3 в высокой концентрации увеличивалось количество данных клеток у здоровых доноров, и вне зависимости
от концентрации гормон повышал процент Treg у больных PC (табл. 2).
Таблица 2
Изменение процентного содержания Treg-лимфоцитов под воздействием Е3
Гормональное Процент CD4+FOXP3+CTLA-4+ лимфоцитов
воздействие Здоровые доноры Больные PC
Контроль 1.54±0.358 0.82±0.180#
Эстриол, 2 нг/мл 1. 5 9±0.339 1.94±0.501*
Эстриол, 20 нг/мл 2.51±0.596* 1.46±0.332*
Следовательно, данный гормон не только усиливает экспрессию супрессорного фактора FOXP3, но и повышает процент клеток, несущих молекулу CTLA-4. Показано, что при контакте CTLA-4 на Treg с лигандами В7 на антиген-презентирующих клетках происходит усиление экспрессии IDO в последних [Fallarino et al., 2003]. В свою очередь, клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации индуцибельных Treg из CD4+CD25- лимфоцитов [Chen et al., 2008].
Субпопуляция IL-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) сейчас является одной из самых перспективных в плане исследования механизмов развития и терапии РС [Aranami, Yamamura, 2008]. В обеих исследуемых концентрациях Е3 понижал процент CD4+RORyt+IL-17+ лимфоцитов в культурах клеток больных РС и в низкой концентрации -в культурах клеток здоровых доноров (табл. 3).
Таблица 3
Изменение процентного содержания Th17-лимфоцитов под воздействием Е3
Гормональное воз- Процент CD4+RORyt+IL-17+ лимфоцитов
действие Здоровые доноры Больные PC
Контроль 1.74±0.738 2.16±0.753
Эстриол, 2 нг/мл 0.43±0.149* 1.607±0.697*#
Эстриол, 20 нг/мл 1.31±0.417 0.36±0.146*#
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что Е3 в концентрациях, характерных для беременности, способствует повышению экспрессии ГОО, а также меняет соотношение регуляторных субпопуляций Treg и 1Ы7 как здоровых доноров, так и больных РС.
Библиографический список
Некрасова И.В., Ширшев С.В. Роль эстриола в поддержании иммунологической толерантности при беременности // Вестник Уральской медицинской академической науки: Тематич. вып. по аллергологии и иммунологии. 2010. № 2/1 (29). С. 60-61.
Ширшев С.В., Некрасова И.В. Комплексное исследование иммуномодулирующей активности эстриола // Иммунология. 2011. Т. 32, № 2. С. 72-74.
Ширшев С.В., Некрасова И.В., Орлова Е.Г. Эстри-ол как модулятор функциональной активности фагоцитов и NK-клеток // Доклады АН. 2008. Т. 422, № 1. С. 128-130.
Aranami T., Yamamura T. Th17 Cells and Autoimmune Encephalomyelitis (EAE_MS) // Allergology International. 2008. Vol. 57. P. 115120.
Braun D., Longman R.S., Albert M.L. A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation // Blood. 2005. Vol. 106. P. 2375-2381.
Brunner M.C. et al. CTLA-4-mediated inhibition of early events of T cell proliferation. // J. Immunol. 1999. Vol. 162. P. 5813-5820.
Chen W. et al. The indoleamine 2,3-dioxygenase pathway is essential for human plasmacytoid dendritic cell-induced adaptive T regulatory cell generation // J. Immunol. 2008. Vol. 181. P. 53965404.
Darmochwal-Kolarza D. et al. The predominance of Th17 lymphocytes and decreased number and function of Treg cells in preeclampsia.// J. of Reproductive Immunology 2012. Vol. 93. P. 7581.
Fallarino F. et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells // Nat. Immunol. 2003. Vol. 4. P. 1206-1212.
Fontenot J.D. et al. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3 // Immunity. 2005. Vol. 22. P. 329-341.
Jansson L., Olsson T., Holmdahl R. Estrogen induces a potent suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis and collagen-induced arthritis in mice // J. Neuroimmunol. 1994. Vol. 53. P. 203-207.
Kase N.G., Reyniak J.V. Endocrinology of pregnancy // Mount Sinai J. Med. 1985. Vol. 52. P. 11-34.
Korn T. et al. IL-17 and Th17 Cells // Annu. Rev. Immunol. 2009. Vol. 27. P. 485-517.
Lorenzi A.R., FordH.L. Multiple sclerosis and pregnancy // Postgrad. Med. J. 2002. Vol. 78. P. 460-464.
Palaszynski K.M. et al. Estriol treatment ameliorates disease in males with experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for multiple
sclerosis // J. Neuroimmunol. 2004. Vol. 149. P. 84-89.
Steinman L. Multiple sclerosis: a coordinated attack against myelin in the central nervous system // Cell. 1996. Vol. 85, № 3. P. 299-302.
Terness P. et al. Regulation of human auto- and alloreactive T cells by indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)-producing dendritic cells: too much ado about IDO? // Blood. 2005. Vol. 105. P. 2480-2486.
Поступила в редакцию 17.10.2013
Estriol in formation of mononuclear leukocytes tolerogenic phenotype in multiple sclerosis patients
I. V. Nekrasova, candidate of biology, researcher
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Goleva str., Perm, Russia, 614081; nirina5@mail.ru
S. V. Shirshev, doctor of medicine, professor
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Goleva str., Perm, Russia, 614081
Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; shirshev@iegm.ru; (342)2808431 I. Y. Danchenko, postgraduate student
Perm State Medicine Academy, 26, Petropavlovskaya str., Perm, Russia, 614000; irene-dan@mail.ru
The influence of pregnancy hormone estriol (E3) on Treg and Th17 phenotypic markers and indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) activity of multiple sclerosis (MS) patients and healthy donors was investigated. The hormone increased Treg percent and monocyte IDO activity and depressed Th17 cells level. Generally E3 had more significant effect on MS patients cells than healthy ones.
Key words: multiple sclerosis; estriol; T-regulatory lymphocytes; Th17 lymphocytes; indoleamine-2,3-dioxygenase.
Некрасова Ирина Валерьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН
Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
Данченко Ирина Юрьевна, заочный аспирант кафедры неврологии лечебного факультета ГБОУВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» МЗ РФ
