CC BY
94
ERCC1 как маркёр резистентности рака яичников к препаратам платины
Т. А. БОГУШ', А. С. ПОПОВА2, Е. А. ДУДКО', Е. А. БОГУШ', А.С. ТЮЛЯНДИНА', С. А. ТЮЛЯНДИН', М. И. ДАВЫДОВ'
' Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук, Москва
2 Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва
ERCC1 as a Marker of Ovarian Cancer Resistance to Platinum Drugs
T. A. BOGUSH, A. S. POPOVA, E. A. DUDKO, E. A. BOGUSH, A. S. TYULYANDINA, S. A. TYULYANDIN, M. I. DAVYDOV
N. N. Blokhin Russian Scientific Centre of Cancer, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow M. V. Lomonosov Moscow State University, Department of Fundamental Medicine, Moscow
Обзор посвящён важнейшему маркёру эксцизионной репарации нуклеотвдов ERCC1 и его вкладу в резистентность рака яичников к препаратам платины. Рассмотрены все варианты лабораторного и клинического определения ERCC1 в ткани рака яичников (однонуклеотидные полиморфизмы гена ERCC1, уровень мРНК и белка). Систематизированы сведения о прогностической и предиктивной значимости ERCC1 в качестве маркёра эффективности платиносодержащей терапии рака яичников. Авторы обсуждают возможные причины разнородности результатов и подчёркивают необходимость унифицированного и интегрального подхода к исследованию ERCC1 в опухоли. Проанализированы работы, цитированные в поисковой системе Pub Med до января 2015 года.
Ключевые слова: рак яичников, ERCC1, эксцизионная репарация нуклеотидов, препарат платины, резистентность, прогноз.
The review is concerned with the crucial marker of nucleotide excision repair ERCC1 and its contribution to platinum resistance of ovarian cancer. All the variants of the laboratory and clinical ERCC1 assessment in the ovarian cancer tissue (single nucleotide polymorphisms of the ERCC1 gene, levels of mRNA or protein) are considered. Data on the prognostic and predictive value of ERCC1 as a marker of the response to platinum-based therapy in ovarian cancer are systematized. The authors discuss the possible causes of heterogeneity of the results and emphasize the necessity of a unified and integrated approach to evaluation of ERCC1 in the tumor. The publications cited in the Search Engine Pub Med up to January 2015 were analyzed.
Key words: ovarian cancer, ERCC1, nucleotide excision repair, platinum drug, resistance, prognosis.
Введение
Препараты платины цисплатин (цис-дихло-родиаминплатина (II)) и его аналог карбопла-тин (циклобутан-1,1 -дикарбоксилатодиамин-платина(11)) в настоящий момент широко используются при лечении злокачественных опухолей различных локализаций, в том числе рака яичников. 75—80% случаев рака яичников полностью или частично отвечают на терапию первой линии [1, 2], в то время как остальные больные в течение шести месяцев после окончания лечения переживают рецидив заболевания. Таким образом, 20—25% пациенток получает заведомо неэффективную и токсичную терапию, которая ухудшает качество их жизни и нарушает режим лечения.
По данным фундаментальных исследований,
© Коллектив авторов, 2015
Адрес для корреспонденции: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24. Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН
направленных на изучение возможных механизмов резистентности рака яичников к препаратам платины, важную роль играет активность системы репарации повреждений ДНК, в частности эндонуклеазы БЯСС1-ХРБ, но клинические результаты противоречивы. В обзоре проведён анализ данных литературы, чтобы очертить круг проблем, обуславливающих неопределённость оценок клинической значимости БЯСС1 в прогнозе резистентности рака яичников к препаратам платины и сформулировать возможные подходы к преодолению этой неопределённости.
Для того чтобы понять, почему БЯСС1 является важнейшим предиктивным маркёром резистентности к платиносодержащим препаратам, ниже рассмотрен механизм их действия, а также принцип функционирования БЯСС1.
Механизм действия препаратов платины
После внутривенного введения цисплатин прочно связывается с белками плазмы и быстро
проникает в ткани организма. Около 90% препарата в крови оказывается связанным с альбумином и другими белками плазмы, что приводит к инактивации большого числа молекул цисплати-на. Попадая в клетку, молекулы воды замещают один или оба атома хлора в молекуле цисплатина, и, соответственно, образуются катионы [Pt(H2O)Cl(NH3)2] + и [Pt(H2O)2(NH3)2]2+. Эта реакция необходима для дальнейшего связывания цисплатина с ДНК [3]. В ДНК цисплатин преимущественно связывается с гуанином и адени-ном в N-7 положении [4], возможно из-за большей нуклеофильности этой позиции. В опытах на культурах опухолевых клеток показано, что цитотоксичность цисплатина коррелирует с образованием платиновых меж- и внутринитевых сшивок в молекуле ДНК [5, 6]. Эти сшивки нарушают структуру ДНК, ингибируют её репликацию, что, в конечном счёте, приводит к апоптозу клеток [7].
Карбоплатин имеет механизм действия сходный с цисплатином, но в исследованиях in vitro было показано, что для повреждения ДНК требуется большая концентрация первого препарата и более длительное время инкубации с ним по сравнению со вторым [8]. Ещё один препарат платины — оксалиплатин, в отличие от карбопла-тина и цисплатина, вызывает образование структурно отличного аддукта, содержащего большую 1,2-диаминоциклогескановую группу [7].
ERCC1 — белок эксцизионной репарации нуклеотидов
Резистентность к препаратам платины считается многофакторным феноменом, в который вносят вклад сниженная внутриклеточная аккумуляция препарата, его инактивация сульфгид-рильными группами белков плазмы и опухоли, повышенная репарация платиновых аддуктов в ДНК, а также несостоятельность механизма клеточной смерти. В зависимости от гистологического типа опухоли может быть экспрессирован один, два или даже все вышеупомянутые варианты резистентности [3, 9]. В ранних клинических исследованиях на культурах клеток рака лёгкого было показано, что устойчивость клеток к цис-платину связана с их повышенной способностью к репарации ДНК [10]. Повреждённая молекула ДНК может быть восстановлена системой репарации несоответствий, ДНК-зависимой проте-инкиназой, но главная роль отводится системе эксцизионной репарации нуклеотидов.
Эксцизионная репарация нуклеотидов — это сложный клеточный процесс, устраняющий различные дефекты, нарушающие структуру ДНК. Он включает 4 этапа: 1) нахождение повреждения ДНК, 2) раскручивание спирали
ДНК, 3) вырезание повреждения эндонуклеаза-ми и 4) ресинтез ДНК.
На первыгх двух этапах эксцизионной репарации нуклеотидов происходит поиск повреждений и раскручивание спирали ДНК. В этих процессах участвует ряд белков, результатом активности которых является подготовка фрагмента ДНК к действию нуклеаз — ферментов, участвующих в удалении дефектного участка.
Функцию вырезания повреждённого участка ДНК выполняет гетеродимер, состоящий из ERCC1 (excision repair cross complementing-group 1) и XPF (xeroderma pigmentosum group F). Этот комплекс разрезает цепь ДНК с 5'-стороны от повреждения. Надо заметить, что нуклеазной активностью обладает только домен XPF, который требует наличия ERCC1 для своей деятельности
[11]. То есть, для работы данного комплекса необходима экспрессия двух этих белков. Кроме того, совместно с ERCC1-XPF в вырезании дефекта ДНК участвует ещё одна нуклеаза — ERCC5 (другое название — XPG). После этого происходит ресинтез и сшивание цепей ДНК при участии нескольких белков, в частности ДНК-полимераз и ДНК-лигаз.
Первые работы, показавшие, что система экс-цизионной репарации играет существенную роль в устранении цисплатин-индуцированного повреждения ДНК, относятся к концу 1980-х годов
[12]. Многие исследования были сфокусированы на нахождении и выяснении вклада каждого белка репарации в резистентность клеток опухоли к цисплатину. Первым клонированным геном, отвечающим за синтез белка репарации ДНК, является ERCC1 [13], и уже тридцать лет ведутся активные исследования его структуры и функций.
Важность белков ERCC1 и XPF для восстановления структуры ДНК подтверждает тот факт, что мутации гена XPF приводят к заболеванию пигментной ксеродермой (xeroderma pigmento-sum — XP), которая характеризуется повышенной чувствительностью кожи к воздействию солнечного излучения, что может привести к возникновению базально- или плоскоклеточного рака кожи после второго десятилетия жизни. В 2007 г. N. G. J. Jaspers и сотр. описали случай мутации гена ERCC1, которая привела к пре- и по-стнатальным дефектам развития [14], однако ERCC1 не имеет номенклатуры «XP-х» как большинство факторов эксцизионной репарации [15].
Впервые предположение о том, что ERCC1 может играть роль предиктивного фактора резистентности клеток к препаратам платины, было высказано еще в 1990-х годах [16]. Для изучения механизмов резистентности рака яичников к препаратам платины, в том числе и перекрёстной резистентности клеток опухоли к широкому диапазону алкилирующих агентов, большинство ав-
торов используют клетки рака яичников человека линии А2780 с разной степенью резистентности к препаратам платины, полученные путём отбора клеток при их культивировании в присутствии возрастающих концентраций цис-платина [17]. Так, в работе K. V. Ferry и сотр. представлены результаты определения уровня мРНК некоторых генов, ассоциированных с репарацией ДНК, в клетках родительской линии А2780 и в наиболее резистентной к цисплатину клеточной линии С200. Методом Нозерн блота показано, что единственным транскриптом, уровень которого был значимо увеличен в резистентных клетках по сравнению с родительскими, оказался ERCC1. При добавлении к клеткам очищенного белкового комплекса ERCC1-XPF эксцизионная активность клеток линии А2780 увеличивалась в 2,2 раза, а линии С200 — в 1,2 раза, что продемонстрировало роль гетеродимера в вырезании платиновых аддуктов из ДНК [18]. Показано также, что даун-регуляция или двойной нокаут комплекса ERCC1-XPF повышают цитотоксичность цисплатина. IC50 цисплатина для клеток, мутантов по XPF и ERCC1, была приблизительно в 40 раз ниже по сравнению с клетками родительской линии, что указывает на ключевую роль этой нуклеазы в репарации цис-платин-индуцированного повреждения ДНК [19]. Подтверждают этот вывод и данные о том, что клетки с экспрессией других мутантных белков репарации — XPB, XPD и XPG, лишь незначительно более чувствительны к цисплатину, чем клетки родительской линии [20].
В одном из исследований с использованием клеточных линий немелкоклеточного рака лёгкого, рака яичников и молочной железы с разной чувствительностью к препаратам платины было показано, что во всех случаях уровень мРНК XPF приблизительно одинаков в отличие от уровня транскрипции ERCC1 — в чувствительных к цис-платину клетках он был существенно ниже по сравнению с резистентными. Помимо этого, нокаут гена ERCC1 привел к значительному уменьшению экспрессии XPF, но не наоборот [19]. Эти данные продемонстрировали возможность исследования ERCC1 в качестве самостоятельного маркёра резистентности к платиновым препаратам.
ERCC1 и резистентность рака яичников к препаратам платины
Результаты клинических оценок предиктив-ной значимости ERCC1 в качестве маркёра эффективности платиносодержащей химиотерапии рака яичников суммированы в таблице.
Наиболее изученным возможным механизмом изменения экспрессии ERCC1, индуцирующим резистентность опухолевых клеток к препа-
ратам платины, являются однонуклеотидные полиморфизмы в кодирующем участке гена ERCC1 (см. табл.). К наиболее распространённым относятся полиморфизмы в экзонах (кодон 118), а также в З'-нетранслируемом регионе (С8092А) гена ERCC1. Анализ этих параметров в лейкоцитах периферической крови проведён в исследовании III фазы эффективности внутрибрюшинного против внутривенного способов введения цисплатина и паклитаксела, в котором приняли участие 2ЗЗ женщины с раком яичников З стадии [21]. Методом прямого пиросеквенирования показано, что полиморфизм кодона 118 не связан с прогрессированием болезни и смертностью, что противоречит данным B. L. Qi и сотр., в работе которых выявлена прогностическая и предиктив-ная значимость полиморфизма кодона 118 (положительная корреляция с общей выживаемостью и продолжительностью безрецидивного течения болезни) [22]. В другом исследовании полиморфизм кодона 118 показал себя как предиктивный маркёр ответа опухоли на платиносодержащую химиотерапию, но не как прогностический маркёр [23]. И наконец, как полиморфизм в кодоне 118, так и средний или высокий уровни мРНК ERCC1, оказались связаны с увеличением риска прогрессирования заболевания (ОР=1,95, />=0,051; ОР=2,51, /=0,009; ОР=2,41, ^=0,014 соответственно) у пациенток, получавших монотерапию препаратами платины [24].
Противоречивы данные и о клинической значимости полиморфизмов региона С8092А (см. табл.). В работе T. C. Krivak и сотр. показано, что пациентки с С/A или А/А генотипом имели больший риск прогрессирования заболевания (ОР=1,44, 95% ДИ=1,06—1,94, p=0,018) и смерти (0Р=1,50, 95% ДИ=1,07—2,09, p=0,018), при этом безрецидивная и общая выживаемость была на 6 и 17 мес соответственно ниже, чем у женщин с С/С генотипом [21]. Напротив, в исследовании K. M. Moxley и сотр. показано, что в случаях выявления генотипа А/А безрецидивная выживаемость на 16 мес выше, чем при генотипах А/C или С/С (/=0,04) [25]. В большом исследовании S. Marsh и сотр. после циторедуктивной операции пациентки получали карбоплатин в комбинации с таксанами. При изучении методами по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) и пиросеквенирования 27 полиморфизмов в 16 ключевых генах, возможно влияющих на чувствительность клеток к таксанам (ABCB1, ABCC1, ABCC2 и др.) и к препаратам платины (ABCC2, ABCG2, ERCC1 и др.), не выявлено статистически значимых корреляций генотипа с исходом заболевания, а также с токсичностью [26]. Таким образом, результаты исследований однонуклеотид-ных полиморфизмов гена ERCC1 противоречивы и не позволяют сделать однозначное заключение
Методические подходы к оценке предиктивной значимости Е^С1 в качестве маркёра эффективности пла-тиносодержащей химиотерапии рака яичников
Автор, год, [ссылка] Число пациентов Объект исследования Метод исследования Прогноз**
заболевания эффективности терапии
I. Однонуклеотидные полиморфизмы кодона 118 (118) или региона С8092А (С8092А) гена ERCC1
Kang S., 2006 [23] 60 кровь ПЦР (8Кар8Ьо1) 118 - +
Marsh S„ 2007 [26] 869 ПЦР и пиросеквениро-вание 118 н/о -
854 С8092А н/о -
KrivakT., 2008 [21] 233 118 - н/о
С8092А + н/о
Smith S„ 2007 [24] 178 опухоль замороженные образцы ПЦР ( Тас] Мап) 118 - -
Bösmüller H., 2011 [32] 41 парафиновые блоки ПЦР в реальном времени 118 н/о -
С8092А н/о -
MoxleyK., 2013 [25] 98 118 - -
106 С8092А + -
QiB.L., 2013 [22] 220 ПЦР (8Кар81юГ) 118 + +
С8092А - -
II. Уровень мРНК ERCC1
Dabholkar M.,1994[27] 28 опухоль замороженные образцы ПЦР с обратной транскрипцией н/о -
DeLoia J„ 2012 [1] 41 + н/о
Smith S„ 2007 [24] 178 в реальном времени - -
Bösmüller H., 2011 [32] 41 парафиновые блоки ПЦР в реальном времени н/о -
III. Уровень белка ЕЯСС1
Stadlmann S„ 2008 [31] 59 опухоль тканевые микрочипы иммуно-гистохимический клон антител 8F1 н/о -
Steffensen D„ 2009 [30] 101 парафиновые блоки н/о +
Bösmüller H„ 2011 [32] 41 н/о -
XieC., 2011 [29] 64 н/о +
RubattJ.M., 2012 [38] 408 FL297 - н/о
MuallemM., 2014 [39] 98 EPR7277 + -
Milovic-Kovacevic M, 2011 [40] 55 замороженные образцы вестерн блот 8F1 + н/о
DeLoia J.A., 2012 [1] 25 FL297 - н/о
Примечание. * — не указано в абстракте, полный текст статьи на китайском языке; ** «+» или «—» — наличие или отсутствие корреляция экспрессии ЕКСС1 с прогнозом заболевания или эффективностью химиотерапии; н/о — прогностическую или предиктивную значимость ЕКСС1 не оценивали.
об их клинической значимости в предсказании резистентности к препаратам платины. Скорее можно думать о том, что этот показатель неинформативен для ответа на поставленным вопрос.
Ещё один подход к оценке экспрессии ERCC1 — определение уровня мРНК ERCC1 в опухолевых клетках (см. табл., II). В одной из работ при исследовании 28 хирургических образцов рака яичников методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией или в реальном времени показано, что уровень экспрессии ERCC1 в 33% случаев чувствительной опухоли и в 70% — резистентной к платино-содержащей химиотерапии оказался выше среднего показателя по группе (р=0,059) [27]. В исследовании J. A. DeLoia и сотр. экспрессию ERCC1 по разным показателям оценивали методами ПЦР с обратной транскрипцией и вестерн блота в хирургических образцах рака яичников 41 пациентки, которым проводили внутрибрю-шинную платиносодержащую химиотерапию [1]. Оказалось, что ни однонуклеотидные полиморфизмы гена ERCC1, ни уровень мРНК не позволяют судить о количестве белка ERCC1 в опухолевых клетках, но высокий уровень экспрессии мРНК ERCC1 (>9,0) коррелирует с более короткой безрецидивной (р=0,040) и общей выживаемостью (р=0,006). Увеличение уровня мРНК ERCC1 было связано также с увеличением на 26% риска прогрессирования (ОР=1,26, 95% ДИ=0,96—1,65, ^=0,093) и на 73% — риска смерти (ОР=1,73, 95% ДИ=1,16—2,58, ^=0,007). Возможно, что выявленное увеличение мРНК ERCC1, коррелирующее с худшим прогнозом, является маркёром активации в опухолях белка RAS, который ассоциирован с резистентностью к препаратам платины [1, 28]. Таким образом, определение мРНК ERCC1 не является надёжным предиктивным маркёром эффективности препаратов платины, что, возможно, обусловлено отсутствием однозначной связи между уровнем мРНК и экспрессией белка в клетке.
Для оценки экспрессии белка ERCC1 наиболее распространённым является иммуногистохи-мический (ИГХ) метод (см. табл.). С помощью этого метода с использованием антител к ERCC1 клона 8F1 показано, что частота вымвления экспрессии ERCC1 в опухолях, резистентных к препаратам платины, значительно выше по сравнению с чувствительными — в 67% (19/28) и в 25% (9/36) случаев соответственно [29]. В методически идентичном исследовании ткани рака яичников (101 образец) получены сходные результаты: резистентность к платиносодержащей химиотерапии отмечена в 75% случаев с положительной и в 27% случаев с отрицательной экспрессией ERCC1 в опухоли (р=0,0013) [30]. Однако в аналогичном исследовании S. Stadlmann и сотр.,
включившем 80 образцов серозного рака яичников, корреляции между экспрессией белка и ответом на препараты платины обнаружено не было (^=0,21), при этом частота вымвления экспрессии ERCC1 в опухолевыгх клетках оказалась довольно низкой — только в 20,3% случаев [31].
В исследовании H. Bosmüller и сотр. (41 случай оптимальной циторедукции низкодиффе-ренцированного серозного рака яичников) экспрессию ERCC1 оценивали параллельно на генетическом уровне (ПЦР в реальном времени), по уровню мРНК (ПЦР с обратной транскрипцией) и по количеству белка (ИГХ анализ с антителами 8F1). Из анализа были исключены пациентки с опухолями «условно резистентными» (рецидив заболевания в период от 6 до 12 мес после окончания 6 циклов платиносодержа-щей химиотерапии). При этом ни экспрессия белка ERCC1 (^=0,232), ни однонуклеотидные полиморфизмы кодона 118 и C8092A гена ERCC1 (^=0,269 и р=0,543), ни уровень мРНК ERCC1 (^=0,896) не показали связи с ответом на лечение [32].
Одной из причин расхождения результатов в представленных случаях иммуногистохимической оценки экспрессии ERCC1 могут быть отличия разных партий по активности и специфичности антител. Реальность такой интерпретации подтверждена в большом исследовании L. Friboulet и сотр. при ИГХ анализе ERCC1 в образцах немел-коклеточного рака лёгкого с использованием разных партий антител того же клона 8F1. Дискор-дантность результатов достигла 36% [33]. Более того, известно, что ген ERCC1 в результате альтернативного сплайсинга образует 4 изоформы (201—204), биологические функции которых исследованы недостаточно. При этом в одной из последних работ показано, что антитела клона 8F1 вымвляют все эти изоформы ERCC1 [34]. И наконец, недавно показано, что антитела 8F1 помимо ERCC1 вымвляют ещё один антиген — холинфос-фат-цитидилтрансферазу а, которая является ферментом синтеза фосфолипидов, регулируемым белком RAS, который ассоциирован с резистентностью к препаратам платины [1, 28]. Таким образом, антитела клона 8F1 не специфичны по отношению только к ERCC1 и, строго говоря, не подходят для проведения ИГХ анализа экспрессии этого белка в отличие от антител клонов FL297, 4F9 и EP2143Y [35—37].
В 2012 году опубликованы результаты работы с использованием одного из таких специфичных к ERCC1 антител — клона FL297 [38]. Экспрессия ERCC1 выявлена только в 27% исследованных образцов рака яичников. Пациентки с ERCC1-положительным и негативным статусом опухоли имели сходные показатели средней безрецидивной выгживаемости (17,9 мес против 17,5
мес соответственно, ^=0,59), общей выживаемости (52 мес против 47 мес соответственно, ^=0,30), а также риска прогрессирования заболевания (ОР=0,90, 95% ДИ: 0,71-1,15, ^=0,41) и риска смерти (0Р=0,81, 95% ДИ: 0,61-1,07, ^=0,14). При этом экспрессия белка не коррелировала с одиночными нуклеотидными полиморфизмами в кодоне 118 и регионе С8092А гена [38].
В отличие от этого, в одном из последних исследований с антителами к БЯСС1 клона БРЯ7277 общая выживаемость пациенток с раком яичников при низком или среднем уровне экспрессии БЯСС1 оказалась выше, чем в случаях выявления высокого уровня белка в опухоли. Средняя общая выживаемость составила 21 и 28 мес против 15 мес (^=0,048 и ^=0,017 соответственно). В то же время статистически значимого различия в безрецидивной выживаемости пациентов с разным уровнем экспрессии БЯСС1 в опухоли после платиносодержащей химиотерапии выявлено не было [39]. Таким образом, введение в анализ новых антител не позволило улучшить результаты — заключения о клинической значимости БЯСС1 остаются противоречивыми.
Тем не менее, если вновь обратиться к таблице и к работам, в которых оценивался показатель безрецидивной выживаемости, становится очевидным, что более надёжным предиктивным маркёром, заслуживающим дальнейшего изучения, является белок БЯСС1. Так, в 4 из 6 исследований однонуклеотидных полиморфизмов ДНК
гена БЯСС1 и в 3 из 3 работ по оценке уровня мРНК БЯСС1 не выявлено их предиктивной значимости. В то же время, в 2 из 4 исследований при ИГХ оценке экспрессии БЯСС1 с антителами 8Б1 и в работе с использованием антител этого же клона и проточной цитофлуориметрии показана корреляция молекулярного показателя опухоли с продолжительностью безрецидивного течения болезни, то есть значимость БЯСС1 в прогнозе эффективности платиносодержащей химиотерапии рака яичника.
Заключение
Результаты фундаментальных исследований показали, что белок эксцизионной репарации нуклеотидов БЯСС1 играет важнейшую роль и является необходимым звеном в репарации повреждений ДНК, вызванных препаратами платины. Это безусловный факт, который, однако, до настоящего времени не нашёл практического применения. Анализ клинических данных отчетливо демонстрирует, что противоречивость результатов разных авторов является следствием отсутствия общего алгоритма исследований. Эта «многоликая» несогласованность исследователей при оценке клинической значимости БЯСС1 как предиктивного маркёра резистентности к препаратам платины представлена на рисунке.
Прежде всего — материал исследования. Это не только опухоль, но и клетки крови [21, 23, 26].
Разнообразие подходов к оценке клинической значимости белка эксцизионной репарации ЕКСС1 как предиктивного маркёра эффективности платиносодержащей химиотерапии рака яичников.
Не только опухолевые клетки, полученные из замороженных [1, 24, 27, 40], но и из фиксированных формалином хирургических образцов [25, 29, 32, 38, 39], а также циркулирующие в крови опухолевые клетки [41] и тканевые микрочипы [30].
Столь же разнообразны объекты и методы исследования. Во-первых, исследование гена ЕЯСС1 — оценка однонуклеотидных полиморфизмов кодона 118 и региона С8092А методами ПЦР (в реальном времени, с обратной транскрипцией, с пиросеквенированием и т.д.) [21—26, 32]. Во-вторых, транскрипционный анализ мРНК БЯСС1 методами ПЦР в реальном времени и с обратной транскрипцией [1, 24, 27, 32]. И наконец, оценка экспрессии белка БЯСС1 методом имму-ногистохимии [29—32, 38, 39] и вестерн блота [1, 40] с использованием разных антител — 8Б1, ББ297 и БРЯ7277.
Отличия в информативности таких характеристик маркёра очевидна, так как от экспрессии гена до синтеза белка большой путь, который может прерваться на разных его этапах. Этот фундаментальный факт подтверждён и при исследовании БЯСС1. Показано, что оценка полиморфизмов гена и мРНК БЯСС1 не позволяют судить об уровне этого белка в клетке и об активности процесса экс-цизионной репарации нуклеотидов [1, 38].
Помимо этого существуют серьёзные методические недостатки внутри каждого из перечисленных методов. К аналитическим ошибкам наиболее распространённого иммуногистохимического анализа приводит отсутствие чёткой стандартизации условий фиксации, дегидратации, гидратации, ревитализации антигена и т.д., а также контроля активности антител в зависимости от производителя и партии поставки.
Важнейший фактор неточности иммуногис-тохимического анализа — субъективность полуколичественной визуальной оценки результатов и гетерогенность опухоли по уровню экспрессии опухолевых маркёров, учесть которую при исследовании локального участка опухоли невозможно. Необходимость для молекулярной диагностики интегрального показателя по всему опухолевому узлу убедительно продемонстрирована в одной из недавних работ. При иммуногис-тохимическом исследовании 15 участков одного и того же образца немелкоклеточного рака лёгкого дискордантность показателей экспрессии опухолевых маркёров БЯСС1, ЯЯМ1, ТиВВ-3 и К1-67 выявлена у 33—67% больных [42]. Проблема внутриопухолевой гетерогенности остро стоит и при молекулярной диагностике рака яичников [43] и рака молочной железы [44].
Этих двух серьёзных недостатков иммуноги-стохимического анализа позволяет избежать иммунофлуоресцентный метод, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией [45]. Ме-
тод лишён субъективизма, позволяет одномоментно строго количественно анализировать 5—10 тыс. клеток из клеточных суспензий, которые получают из хирургических образцов опухолей большого размера (до 2 см и более в диаметре). Показатель экспрессии БЯСС1 при этом становится интегральным по большому объёму опухоли, а не по локальному участку, как при иммуногистохимическом анализе, что в значительной степени нивелирует внутриопухо-левую гетерогенность. Крайне важно, что количественная оценка маркёра становится возможной и в клетках, полученных из асцитической жидкости при генерализации процесса. Метод использован при количественной оценке уровня, интенсивности и частоты экспрессии БЯСС1 в 37 хирургических образцах серозной аденокарциномы яичников [46], при этом показана молекулярная неоднородность сходных по гистологическому строению новообразований яичников. БЯСС1 выявлен во всех исследованных опухолях с колебанием показателя уровня экспрессии от 42 до 72%, а интенсивности — до 8 раз, при этом до 10 раз опухоли отличались по показателю интегрального индекса, рассчитанного как произведение уровня и интенсивности экспрессии маркёра. В реальном времени проведения исследования, у 7 из 8 пациенток выявлена обратная корреляция индекса экспрессии БЯСС1 с клинической эффективностью химиотерапии, включающей карбоплатин и паклитаксел [46].
И наконец, причиной разноречивости заключений о значимости БЯСС1 в предсказании резистентности к препаратам платины является отсутствие унифицированных дизайна и оценки результатов исследований. Не контролируется множество параметров, влияющих на эффективность препаратов платины, такие как активность других белков репарации, белков множественной лекарственной резистентности и т. д. В ряде работ предиктивная значимость БЯСС1 оценивается по общей выживаемости, которая зависит и от эффективности последующих линий химиотерапии, часто без препаратов платины. В других исследованиях показателем эффективности платиновых препаратов служит усреднённая продолжительность безрецидивного течения болезни. Такой параметр нивелирует чёткую клинически значимую градацию опухолей на резистентные, условно резистентные и чувствительные в зависимости от времени диагностирования рецидива болезни в течение 6 мес, в период от 6 до 12 мес и после 12 мес после завершения химиотерапии соответственно. Более того, в ряде работ в группу чувствительных опухолей включают все случаи появления рецидива через 6 мес от окончания терапии, в том числе и условно резистентные.
Подводя итог, необходимо отметить, что, несмотря на неоднозначность клинических оценок, белок эксцизионной репарации повреждений ДНК — ERCC1, безусловно, является важнейшим предиктивным маркёром эффективности платиновых препаратов, а главной проблемой остается чёткая унификация его изучения. Оптимально, клиническая оценка ERCC1 как предиктора резистентности препаратов платины при лечении рака яичников должна проводиться в ус-
ЛИТЕРАТУРА
1. DeLoia J. A., Bhagwat N. R, Darcy K. M. et al. Comparison of ERCC1/XPF genetic variation, mRNA and protein levels in women with advanced stage ovarian cancer treated with intraperitoneal platinum. Gynecologic Oncology 2012; 126: 3: 448—454.
2. Syrios J., Banerjee S, Kaye S. B. Advanced epithelial ovarian cancer: from standard chemotherapy to promising molecular pathway targets — where are we now? Anticancer Research 2014; 34: 5: 2069—2077.
3. Cepeda V., Fuertes M. A., Castilla J. et al. Biochemical mechanisms ofcis-platin cytotoxicity. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents) 2007; 7: 1: 3—18.
4. Pinto A. L, Lippard S. J. Binding of the antitumor drug cis-diamminedichloroplatinum(II) (cisplatin) to DNA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Reviews on Cancer 1985; 780: 3: 167—180.
5. Zwelling L. A., Michaels S, Schwartz H. et al. DNA cross-linking as an indicator of sensitivity and resistance of mouse L1210 leukemia to cis-diamminedichloroplatinum(II) and l-phenylalanine mustard. Cancer Research 1981; 41: 2: 640—649.
6. Plooy A. C. M., van Dijk M., Lohman P. H. M. Inductionand repair of DNA cross-links in chinese hamster ovary cells treated with various platinum coordination compounds in relation to platinum binding to DNA, cytotoxicity, mutagenicity, and antitumor activity. Cancer Research 1984; 44: 5: 2043—2051.
7. Bowden N. A. Nucleotide excision repair: why is it not used to predict response to platinum-based chemotherapy? Cancer Letters 346: 2: 163—171.
8. Atsushi H, Shuji S, Kosuke A., Takafumi K. A comparison of in vitro plat-inum-DNA adduct formation between carboplatin and cisplatin. International J Biochemistry 1994; 26: 8: 1009—1016.
9. Almeida G. M, Duarte T. L, Farmer P. B. et al. Multiple end-point analysis reveals cisplatin damage tolerance to be a chemoresistance mechanism in a NSCLC model: implications for predictive testing. International J Cancer 2008; 122: 8: 1810—1819.
10. Zeng-Rong N., Paterson J., Alpert L. et al. Elevated DNA repair capacity is associated with intrinsic resistance of lung cancer to chemotherapy. Cancer Research 1995; 55: 21: 4760—4764.
11. Tripsianes K, Folkers G, Ab E. et al. The structure of the human ERCC1/XPF interaction domains reveals a complementary role for the two proteins in nucleotide excision repair. Structure 13: 12: 1849—1858.
12. Hansson J., Wood R. D. Repair synthesis by human cell extracts in DNA damaged by cis- and trans-diamminedichloroplatinum(II). Nucleic Acids Research 1989; 17: 20: 8073—8091.
13. Westerveld A., Hoeijmakers J. H. J., van Duin M. et al. Molecular cloning of a human DNA repair gene. Nature 1984; 310: 5976: 425—429.
14. Jaspers N. G. J., Raams A., Silengo M. C. et al. First reported patient with human ERCC1 deficiency has cerebro-oculo-facio-skeletal syndrome with a mild defect in nucleotide excision repair and severe developmental failure. Amer J Human Genetics 2007; 80: 3: 457-466.
15. Gregg S. Q, Robinson A. R, Niedernhofer L. J. Physiological consequences of defects in ERCC1-XPF DNA repair endonuclease. DNA Repair 2011; 10: 7: 781—791.
16. Lee K. B, Parker R. J., Bohr V. et al. Cisplatin sensitivity/resistance in UV repair-deficient Chinese hamster ovary cells of complementation groups 1 and 3. Carcinogenesis 1993; 14: 10: 2177—2180.
17. Johnson S. W, Laub P. B, Beesley J. S. et al. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resis-
ловиях проспективного исследования, при этом объективным показателем может служить продолжительность безрецидивного течения болезни после платиносодержащей терапии с учётом упомянутых выше общепринятых критериев разделения опухолей на резистентные, условно резистентные и чувствительные.
Поддержано грантами РФФИ (№№ 13-04-01004-a, 15-04-06991-a, 14-04-31734-мол-а), а также РАН РФ (ФИМТ-2014-205).
tance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research 1997; 57: 5: 850—856.
18. Ferry K. V., Hamilton T. C, Johnson S. W. Increased nucleotide excision repair in cisplatin-resistant ovarian cancer cells: role of ERCC1-XPF. Biochem Pharmacol 2000; 60: 1305—1313.
19. Arora S, Kothandapani A., Tillison K. et al. Downregulation of XPF-ERCC1 enhances cisplatin efficacy in cancer cells. DNA Repair (Amst) 2010; 9: 745—753.
20. De Silva I.U., McHugh P.J., Clingen PH., Harley J.A. Defects in understand cross-link uncoupling do not account for the extreme sensitivity of ERCC1 and XPF cells to cisplatin. Nucleic Acids Research 2002; 30: 17: 3848—3856.
21. Krivak T. C, Darcy K. M, Tian C. et al. Relationship between ERCC1 polymorphisms, disease progression, and survival in the gynecologic oncology group phase III trial of intraperitoneal versus intravenous cis-platin and paclitaxel for stage III epithelial ovarian cancer. J Clinical Oncology 2008; 26: 21: 3598—3606.
22. Qi B.-l., Li Y., Wang N. et al. Polymorphisms of ERCC1 gene and outcomes in epithelial ovarian cancer patients with platinum-based chemotherapy. Zhonghua fu chan ke za zhi 2013; 48: 11: 847—852.
23. Kang S., Ju W, Kim J. W. et al. Association between excision repair cross-complementation group 1 polymorphism and clinical outcome of platinum-based chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer. Exp Mol Med 2006; 38: 320—324.
24. Smith S, Su D, Rigault de la Longrais I. A. et al. ERCC1 genotype and phenotype in epithelial ovarian cancer identify patients likely to benefit from paclitaxel treatment in addition to platinum-based therapy. J Clinical Oncology 2007; 25: 33: 5172—5179.
25. Moxley K. M, Benbrook D. M, Queimado L. et al. The role of single nucleotide polymorphisms of the ERCC1 and MMS19 genes in predicting platinum-sensitivity, progression-free and overall survival in advanced epithelial ovarian cancer. Gynecologic Oncology 2013; 130: 2: 377—382.
26. Marsh S, Paul J., King C. R. et al. Pharmacogenetic assessment of toxicity and outcome after platinum plus taxane chemotherapy in ovarian cancer: the Scottish randomised trial in ovarian cancer. J Clinical Oncology 2007; 25: 29: 4528—4535.
27. Dabholkar M, Vionnet J., Bostick-Bruton F. et al. Messenger RNA levels of XPAC and ERCC1 in ovarian cancer tissue correlate with response to platinum-based chemotherapy. J Clinical Investigation 1994; 94: 2: 703—708.
28. Youn C.-K, Kim M.-H, Cho H.-J. et al. Oncogenic H-ras up-regulates expression of ERCC1 to protect cells from platinum-based anticancer agents. Cancer Research 2004; 64: 14: 4849—4857.
29. Xie C, Yin R.-t, Li Y.-l. et al. The protein expression of ERCC1 and sur-vivin in epithelial ovarian carcinoma and their clinical significance. Sichuan da xue xue bao. Yi xue ban = Journal of Sichuan University. Medical Science Edition 2011; 42: 1: 86—89.
30. Steffensen K. D, Waldstr0m M, Jakobsen A. The relationship of platinum resistance and ERCC1 protein expression in epithelial ovarian cancer. International Journal of Gynecological Cancer 2009; 19: 5: 820—825.
31. Stadlmann S, Singer G, Dirnhofer S. et al. ERCC1-immunoexpression does not predict platinum-resistance in ovarian cancer. Gynecologic Oncology 2008; 108: 1: 252—253.
32. Bosmuller H, Haitchi-Petnehazy S, Webersinke G. et al. Intratumoral lymphocyte density in serous ovarian carcinoma is superior to ERCC1 expression for predicting response to platinum-based therapy. Virchows Archiv 2011; 459: 2: 183—191.
33. Friboulet L, Olaussen K. A., Pignon J.-P. et al. ERCC1 isoform expression and DNA repair in non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine 2013; 368: 12: 1101-1110.
34. Bhagwat N. R, Roginskaya V. Y, Acquafondata M. B. et al. Immunodetection of DNA repair endonuclease ERCC1-XPF in human tissue. Cancer Research 2009; 69: 17: 6831-6838.
35. Vaezi A. E, Bepler G, Bhagwat N. R. et al. Choline phosphate cytidylyl-transferase-a is a novel antigen detected by the anti-ERCC1 antibody 8F1 with biomarker value in patients with lung and head and neck squamous cell carcinomas. Cancer 2014; 120: 12: 1898—1907.
36. Bauman J. E, Austin M. C, Schmidt R. et al. ERCC1 is a prognostic bio-marker in locally advanced head and neck cancer: results from a randomised, phase II trial. Br J Cancer 2013; 109: 8: 2096—2105.
37. Smith D. H, Fiehn A.-M. K, Fogh L. et al. Measuring ERCC1 protein expression in cancer specimens: validation of a novel antibody. Sci Rep 2014; 4.
38. Rubatt J. M, Darcy K. M, Tian C. et al. Pre-treatment tumor expression of ERCC1 in women with advanced stage epithelial ovarian cancer is not predictive of clinical outcomes: a gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology 2012; 125: 2: 421—426.
39. Muallem M. Z, Braicu I., Nassir M. et al. ERCC1 Expression as a predictor of resistance to platinum-based chemotherapy in primary ovarian cancer. Anticancer Research 2014; 34: 1: 393—399.
40. Milovic-Kovacevic M, Srdic-Rajic T., Radulovic S. et al. Expression of ERCC1 protein in biopsy specimen predicts survival in advanced ovarian
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Богуш Татьяна Анатольевна — д.м.н., профессор, заведующая лабораторией медицинской химии, заслуженный деятель науки РФ, ФГБНУ «РОНЦ им. H. Н. Блохина», ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина».
Попова Анна Сергеевна — лаборант-исследователь лабораторией медицинской химии, Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова.
Дудко Евгений Александрович — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской химии, ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина».
Богуш Елена Александровна — к.м.н., старший научный сотрудник хирургического отделения № 2 (диагностики опухолей), ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина».
cancer patients treated with platinum-based chemotherapy. Journal of B.U.ON. : Official J Balkan Union of Oncology 2011; 16: 4: 708-714.
41. Kuhlmann J. D, Wimberger P., Bankfalvi A. et al. ERCC1-positive circulating tumor cells in the blood of ovarian cancer patients as a predictive biomarker for platinum resistance. Clinical Chemistry 2014; 60: 10: 1282-1289.
42. Jakobsen J. N, Santoni-Rugiu E, Ravn J., Surensen J. B. Intratumour variation ofbiomarker expression by immunohistochemistry in resectable non-small cell lung cancer. European J Cancer 2013; 49: 11: 2494—2503.
43. Colombo P.-E, Fabbro M, Theillet C. et al. Sensitivity and resistance to treatment in the primary management of epithelial ovarian cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology 2014; 89: 2: 207—216.
44. Богуш Т. А., Попова А. С., Дудко E. A. и др. Дискордантность статуса эстрогеновых рецепторов мевду первичным и метастатическим раком молочной железы — возможные причины и прогностическая значимость. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 7—8:11—18.
45. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А. и др. Количественная имму-нофлуоресцентная оценка с использованием проточной цитофлу-ориметрии экспрессии эстрогеновых рецепторов в в солидных опухолях человека. Вестник Московского университета, Серия 2, Химия 2011; 52: 4: 305—312.
46. Богуш Т.А., Дудко Е.А., Семаков А.В. и др. Иммунофлуоресцентный анализ и оценка клинической значимости экспрессии ERCC1 в ткани рака яичников. Доклады академии наук 2014; 457: 4: 481—486.
Тюляндина Александра Сергеевна — к.м.н., старший научный сотрудник отделения клинической фармакологии и химиотерапии, ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина».
Тюляндин Сергей Алексеевич — д.м.н., профессор, руководитель отделения клинической фармакологии и химиотерапии, ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина».
Давыдов Михаил Иванович — д.м.н., академик РАН и РАМН, директор, ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина».
