CC BY
57
Название групп Опыт 1 Опыт 2
масса печени, г индекс печени масса печени, г индекс печени
1. Контроль 1,82+0,27 0,086+0,020 1,57+0,50 0,088±0,020
(10)* (12)
2. Дипиридамол 1,36±0,27 0,061+0,010 1,30+0,22 0,062+0,020
(500 мкг на мышь) (13) (13)
р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
3. Поли И:Ц 1,46+0,27 0,064+0,020 1,32+0,21 0,066+0,050
(50 мкг на мышь) (13) (13)
р<0,05 р<0,05 р<;0,05 р<0,05
Примечание. Звездочкой обозначено количество животных в группе; р — достоверность различий между опытными и контрольными группами по ^критерию Стьюдента.
В наших опытах Дп использовался в дозе 25 мг на 1 кг массы, которая является интер-ферониндуцирующей у мышей [7, 11]. При использовании максимально переносимых доз у мышей (свыше 100 мг/кг при подкожном введении) происходит подавление размножения опухолевых клеток, что связывают с ингибированием транспорта нуклеотидов через мембрану [5]. Высокие дозы Дп вместе с цитостатиками, апробированные в клинических испытаниях, дают значительный синергический эффект, однако эти дозы являются токсичными для организма [12].
В наших опытах показано, что препарат дипи-ридамол и в терапевтических дозах дает выраженный антиметастатический эффект, причем уменьшает метастазирование опухолей с разной органной тропностью. Хорошо изученные токсикологические и фармакологические свойства Дп делают возможными его испытания с целью профилактики метастазов. Однако вопрос о механизмах действия Дп на диссеминацию опухолей остается открытым.
ЛИТЕРАТУРА
1. Григорян С. С., Поверенный А. М., Ершов Ф. И. // Вопр. вирусол.— 1987.— № 2.— С. 204—207.
2. Гублер Е. В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., 1973.
3. Сенин. В. М., Иванов А. В., Афанасьева А. В., Бун-цевич А. М. // Вестн. АМН СССР.— 1984.— № 5.— С. 85—91.
4. Федоровская Е. О., Пелевина И. И., Афанасьев Г. Г. и др. // Бюл. экспер. биол.— 1989.— № 1.— С. 83—85.
5. Brusereid Q. // Clin. Immunol. Immunopath.— 1987.— Vol. 42,— P. 102—109.
6. Cao Sh., Zhen Y. // Cancer ChemQther. Pharmacol.— 1989,—Vol. 24,— P. 181 —186.
7. Galabov A. S., Masticova M. // Acta virol.— 1982.—
Vol. 26,— P. 137—147. \
8. Grem J. L., Fisher P. M. // Pharmacol. Ther.— 1989.—
Vol. 40,—P. 349—371. i
9. Masao H., Eys /., Tsumo N. et al. // Cancer Res.—
1986,—Vol. 33,—P. 51—57.
10. Neiwiarowski S., Lukasiewicz H. et al.i // J. Lab. clin. Med.— 1975,— Vol. 86,— P. 64—76.
11. Tonev E., Indulen М. K-, Dzeguza D. R.\ // Acta virol.— 1982,—Vol. 26,—P. 125—129.
12. Young C. W. U Med. Clin. N. Amer.— 1971,—Vol. 55,— P. 721—728.
Поступила 3.01.90
THE EFFECT OF THE HEART VASODILATATOR DIPYRIDAMOLE ON THE DISSEMINATION OF HIGHLY-ME-
TASTATIC MURINE MAMMARY CARCINOMA
E. O. Fedorovskaya, A. V. Afanasyeva, V. M. Senin, A. M. Poverenny
The well-known heart vasodilatator dipyridamole was studied to determine its effect on the dissemination of a highly-metastatic murine mammary tumor. The dose of dipyridamole selected (25 mg/kg per week) was therapeutic, non-toxic and known to induce interferon production. Dipyridamole, given at this dose per os, significantly inhibited formation of metastases in liver, lungs and other organs.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 576.8.078.73
А. К- Язова, А. И. Гусев, В. С. Полторанина, Е. Ф. Якименко, Г. И. Абелев
ЭПИТОПЫ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА — ВЫЯВЛЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ
НИИ канцерогенеза
Альфа-фетопротеин (АФП) — эмбриоспецифи-ческий сывороточный одноцепочечный гликопротеин с мол. м. 70 кД, содержащий около 4 % углеводов,— является маркером гепатоцеллюлярного рака и тератокарцином [1]. Попытки изучения антигенной структуры этого белка делались путем иммунологического сравнения АФП различных видов млекопитающих на уровне поликлональных антител [3, 5, 11, 15, 6], но такой подход позволял регистрировать только наличие или отсутствие сходных антигенных детерминант (эпитопов) и не позволял судить о количестве эпитопов АФП. Моноклональные антитела (МкАт) — продукты гибридом [13] —представляют уникальный инструмент для изучения антигенов с точки зрения их эпитопного построения, так как моноклональность гибридом определяет специфичность МкАт относительно одного лишь эпитопа антигена, если этот эпитоп не повторяется в молекуле. Так, с помощью МкАт к АФП человека (АФПч) разными группами исследователей выявлено в этом антигене разное количество эпитопов: 4 — при анализе 7 МкАт [16], 5 МкАт [17] и 7 отдельных эпитопов — при анализе 20 МкАт [12].
В настоящей работе приводятся полученные иммуноферментным методом (ИФМ) данные по изучению эпитопной специфичности 12 МкАт к АФПч. Сочетанием двух подходов (анализ реакции с гетерологичкыми АФП и анализ кооперативного связывания парных смесей МкАт с
АФПч) показано, что 12 изученных МкАт различают 8 эпитопов на молекуле АФПч.
Методика исследования. 12 МкАТ к АФПч (DIO, F2, F5, СЗ, G10, ЕЗ, С2, Е9, В9, D8, СП и С9) являются продуктами гибридом, полученных в одном слиянии, процедура которого описана в авторских заявках на изобретение, оформленных на МкАт DIO, F2, С2 и С9 [9]. Скрининг супернатантов от гибридом проводили в ИФМ, как это описано ранее [7]. Большая часть МкАт относится к у1 подклассу мышиного IgG, за исключением СЗ (у2А) и ЕЗ (у2В)*. МкАт использованы в составе полной ростовой среды, содержащей 15 % эмбриональной телячьей сыворотки.
АФП выделяли методом аффинной хроматографии на сорбенте из кроличьих антител к АФПч, конъюгированных с CNBr-активированной сефарозой 4В, из сывороток больных с первичным раком печени и тератобластомами (АФПч — ПРП+ТБ), из смеси сывороток больных с первичным раком печени (АФПч—ПРП), из смеси сывороток больных с тератобластомами (АФПч—ТБ) и из препарата плацентарного альбумина как источника эмбрионального АФП (АФП—Э). АФП мыши (АФПм) и крысы (АФПкр) были очищены соответственно из сывороток новорожденных мышей и крыс аффинной хроматографией на крысиных МкАт к АФПм, перекрестно реагирующих с АФПм и АФПкр [8]. АФП собаки (АФПс) и теленка (АФПт) выделены методом препаративного дискового электрофореза в полиакриламидном геле [2]. В качестве препаратов АФП свиньи (АФПсв) и кошки (АФПк) использовали сыворотку эмбрионов свиньи и сыворотку новорожденного котенка.
Методом смешанной преципитации в геле (СПГ) изучали связывание МкАт с АФПсв и АФПк. В качестве преципи-тирующей тест-системы на АФП использован коммерческий препарат иммунодиагностикума на первичный рак печени и тератобластомы (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР), поликлональные кроличьи анти-АФПч антитела которого перекрестно реагируют с АФПсв и АФПк. Этапы и постановка СПГ описаны ранее [4].
В ИФМ использованы 96-луночные микропластины фирмы «Nunk». Для сенсибилизации лунок использовали очи-, щенные препараты АФП разных видов млекопитающих в,^ концентрации 1 мкг/мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (pH 7,2). После инкубации в течение ночи при +4 проводили забивку 0,5 % раствором сывороточного альбумина человека на ЗФР с 0,05 % Тви-ном-20 (200 мкл на лунку). МкАт (двукратные разведения 1:150—1:4800 на ЗФР) в объеме 100 мкл инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре, затем лунки промывали 3 раза проточной водой и 1 раз ЗФР с Твином. Конъюгат кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой хрена [18] вносили в объеме 100 мкл на лунку, инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре, проводили отмывание, после чего вносили по 100 мкл субстрата (0,8 мг/мл 5'-аминосалициловой кислоты, pH 6,0, содержащей 0,005 % перекиси водорода). За отрицательный контроль принимали величину OD450 нм в лунках, где вместо МкАт добавляли ростовую среду. Измерение OD450 проводили на миниридере МР 590 (Dynatech Product). Для изучения связывания парных смесей МкАт с антигеном лунки сенсибилизировали раствором АФПч в концентрации
0,1 мкг/мл, что создает низкую плотность антигена на твердой фазе, а МкАт брали в сильном избытке по отношению к антигену, иммобилизованному на пластике,— индивидуальные МкАт и их парные смеси исследовали в разведении 1:100. В остальном реакцию проводили, как описано выше. Учитывали среднее значение OD450 для двух параллельных лунок. Индекс аддитивности (ИА) вычисляли по формуле [ 10]:
ИА= [2-ОР(МкАт 1+МкАт2) 1
LOD МкАт 1+OD МкАт 2 J
Результаты и обсуждение. При изучении перекрестных реакций МкАт оказалось, что их специфичность к АФПч в реакции с 6 другими видами АФП проявляется по-разному, что позволило выделить МкАт в отдельные группы (табл. 1). Группы III, IV, VI и VIII по спектру
* Определение подклассов проводили в ИФМ, используя кроличьи антисыворотки к 72А, 1>2В и 71 изотипам производства Московского научно-исследовательского института вирусных препаратов М3 СССР.
Таблица 1
Реакция МкАт к АФПч с гетерологичными АФП
МкАт - Реакция Груп- пы МкАт
П ИФМ с В СП Г с
АФПч АФПм АФПкр АФПс АФПт АФПсв АФПк
D10 + I
F2 +
F5 + __ + — + —
СЗ + — — + — + — п
G10 + — — + — + —
ЕЗ + — — + — + —
С2 + + — — + + + ш
Е9 + — + + + + IV
В9 + + — + + — — V
D8 + + — + + — —
СП + + + + + — VI
С9 + + + + + + VII
перекрестных реакций включают по 1 МкАт, группы I и V — по 2 и группа II — 4. Для всех 12 МкАт уровень связывания в ИФМ с иммуногеном (АФПч) всегда превышал уровень реакции с АФП других видов млекопитающих, тогда как уровень связывания с разными гетерологичными АФП в разных группах варьировал, что отражает скорее всего разный аффинитет у разных МкАт в отношении изученных антигенов.
При изучении кооперативного взаимодействия МкАт с АФПч в парных их сочетаниях (табл. 2) распределение МкАт по группам на основании их эпитопной специфичности несколько изменилось. МкАт D10 и F2 по ИА (64 %) выделились в самостоятельные группы. Аналогично этому МкАт ЕЗ, входившее ранее в группу II, оказалось отличным по эпитопной специфичности от F5 (ИА= =62 %), от СЗ (ИА=57 %) hotGIO (ИА=48 %) и поэтому также выделилось в самостоятельную труппу. С другой стороны, сочетание ЕЗ и С2 дает низкий ИА (20%), но по спектру перекрестных реакций эти МкАт сильно отличаются. На основании полученных ИА к группе, состояв-
Т а б л и ц а 2
Кооперативное взаимодействие парных смесей МкАТ с АФПч в ИФМ (ИА %)*
МкАт D10 F2 F5 СЗ GI0 ЕЗ С2 Е9 В9 D8 СП С9
D10 64 71 82 78 53 55 54 44 50 66 22
F2 55 80 69 80 67 40 64 59 62 62
F5 15 12 62 40 35 60 37 39 32
СЗ 8 57 46 68 46 50 60 42
G10 48 32 50 39 33 42 27
ЕЗ 20 71 64 56 48 23
С2 44 37 43 46 0
Е9 49 33 36 22
В9 11 15 28
D8 20 36
СП 52
Примечание. Вертикальные линии в верхней графе таблицы отражают распределение МкАТ по группам на основании их реактивности с гетерологичными АФП (см. табл. 1). В вертикальной слева графе указаны МкАТ, использованные для образования парной смеси с каждым из МкАТ из верхней графы.
* ИА около 50 % и выше означает, что два МкАТ различны по эпитопной специфичности и могут одновременно связываться с антигеном; ИА ниже 25 % — 2 МкАТ не могут связываться одновременно, и ИА от 25 до 50 % — 2 МкАТ различны по эпитопной специфичности, но их одновременное связывание стерически затруднено [18].
шей ранее из МкАт В9 и D8, может быть отнесено к МкАт СП, так как все 3 МкАт при комбинировании друг с другом давали ИА ниже 20 %. Такие же низкие значения ИА (8, 12 и 15 %) были получены для МкАт F5, СЗ и G10, которые по cneKfpy перекрестных реакций входили в одну и ту же группу (см. табл. 1). Следует отметить, что при изучении кооперативного взаимодействия наименее эффективным в этом тесте оказалось МкАт С9: только в 3 из 11 сочетаний были получены высокие ИА (62 % с F2, 42 % с СЗ и 52% с СИ), во всех остальных случаях значения ИА были очень низкими.
Таким образом, при оценке возможностей двух использованных нами подходов к анализу эпитопной специфичности МкАт можно обнаружить ограниченность каждого из них: метод перекрестных реакций не является исчерпывающим из-за неполного набора гетерологичных АФП, а определение ИА не всегда позволяет выявить различную эпитопную специфичность у двух МкАт, если узнаваемые ими эпитопы топографически близко расположены друг к другу. Поэтому мы считали целесообразным для окончательных выводов об эпитопной специфичности МкАт учитывать данные, полученные при обоих подходах, и на этом основании распределили 12 МкАт на 8 групп (табл. 3). Для выделения групп I, И, III, IV и VIII сведения, полученные двумя методами, были взаимно дополняющими, а для групп V и VI — полностью совпадающими. И только МкАт В9, D8 и G11 объединены в группу VII практически на основании низких значений ИА, несмотря на то что МкАт СП отличается по профилю перекрестных реакций от D8 и В9 только лишь слабовыраженной реакцией с АФПкр (при полном совпадении реакций с прочими АФП), что может отражать слабый аффинитет у МкАт D8 и В9 к этому эпитопу в АФПкр. Характерно, что наиболее высокие ИА (от 50 до 80 %) отмечались при комбинировании с любыми другими антителами у МкАт D10 и F2, которые из всей панели использованных в настоящей работе гетерологичных АФП реагировали только с иммуногеном — АФП человека. И наоборот, МкАт С9, реагирующее с максимальным числом гетерологичных АФП, практически не могло одновременно связаться с антигеном при сочетании с большинством из МкАт.
При анализе перекрестных реакций МкАт, различающих в АФПч 8 эпитопов, можно заметить, что у АФПч и АФП разных видов млекопитаю-
щих иммунологическое сходство определяется, как видно из табл. 3, несколькими эпитопами. Наибольшее количество общих эпитопов (по 5) у АФПч выявлено при сравнении с АФП собаки и свиньи, обнаружено по 3 эпитопа, общих с АФП теленка, кошки и мыши, и 2 эпитопа, общих с АФП крысы. С помощью использованного набора гетерологичных АФП через МкАТ выявлено только 2 видоспецифических для человека эпитопа (D10 и F2), но не исключено, что при расширении панели АФП эти эпитопы могут не сохранить свою видоспецифичность в отношении человека. Очевидно, что для спленоцитов мыши наиболее иммуногенными оказались видоспецифические эпитопы АФПч, а затем эпитопы, общие с АФП свиньи, собаки, теленка и т. д., то есть млекопитающих, филогенетически более отдаленных от мыши. Примечательным является то обстоятельство, что при индукции иммунного ответа на АФПч у мыши были получены гибри-домы, продуцирующие МкАт, которые реагировали с собственными АФП мыши. Как видно из табл. 3, все три эпитопа АФПм не являются видоспецифическими для мыши, а представляют некие общие (сходные) структуры, определяемые через МкАт V, VII и VIII групп одновременно у нескольких видов АФП. Поэтому в данном случае мы имеем пример частичного преодоления естественной толерантности к АФПм у мыши за счет иммунизации тремя перекрестно реагирующими детерминантами, представленными на АФПч. Очевидно, что речь в данном случае идет не об активации клонов В-клеток, реагирующих с собственными антигенами, а об ошибке узнавания сходного с АФПч эпитопа, присутствующего на АФПм. С гомологичным эпитопом направленные к нему МкАт реагируют с большим сродством, чем с его аналогом, присутствующим на АФПм. Было бы очень важно установить, станут ли иммуногенными для мыши видоспецифические эпитопы АФПм, конъюгированного, например, с каким-либо чужеродным гап-теном.
Несмотря на то что полученные нами МкАт различают 8 отдельных эпитопов в АФПч, нам не удалось получить с антителами, тестированными как по отдельности, так и в разных сочетаниях, преципитирования АФПч в двойной иммунодиффузии в агаре. Таким образом, данные 8 эпитопов являются уникальными для АФПч и неповторяющимися. Одной из возможных причин отсутствия преципитирования могут быть
Таблица 3
Эпитопы АФПч, выявленные при анализе 12 МкАТ, реагирующих с АФПч
МкАТ D10 F2 F5 СЗ GI0 ЕЗ С2 Е9 В9 D8 СМ С9
Эпитопы I И III IV V VI VII VIII
Видоспецифические для человека эпитопы Количество эпитопов, общих с: АФПм-3 АФГТкр-2 АФПс-5 АФПт-3 АФПсв-5 АФПк-3
Примечание. 0 обозначены реакции МкАТ с АФП.
Од4}0мм
анти-йФПч
мышиная
сыдоротка
Связывание в ИФМ анти-АФПч МкАТ с АФПч различного происхождения.
АФПч — ПРП: белый столбик; АФПч — ТБ: черный столбик; АФПч — Э: забитый точками столбик.
Контроль (К) — неразведенная ростовая среда (даны средние значения для нескольких мнкропластин, использованных в данном опыте).
стерические помехи для одновременного связывания 8 данных МкАт с антигеном, так как для исследованных антител это явление наблюдается нами даже в парных сочетаниях. Следовательно, если вспомнить о преципитирующей антиген поликлональной анти-АФПч сыворотке, взятой у мыши, спленоциты которой были использованы для слияния, то можно думать, что должны быть другие по эпитопной специфичности МкАт, которые в определенном сочетании могут преци-питировать антиген. В таком случае следует предположить, что количество эпитопов в АФПч должно быть существенно больше 8, установленных нами, и, следовательно, более 6, вычисленных математически [19].
Прямые данные о количестве эпитопов в АФП можно было бы получить при сравнении адекватным методом анти-АФПч МкАТ, полученных разными группами исследователей.
Представлялось интересным установить сохранность обнаруженных эпитопов в препаратах АФПч в зависимости от источника синтеза этого антигена. С этой целью лунки микропластин сенсибилизировали растворами АФПч (ПРП, ТБ или Э) в концентрации 2 мкг/мл (по 100 мкл на лунку) для обеспечения возможности адсорбции на пластике микровариантов АФП, присутствующих в выделенных препаратах АФПч. МкАт использовали неразведенными. Как видно из рисунка, все МкАт реагируют в ИФМ с тремя препаратами АФПч, но в отличие от поликлональной анти-АФПч сыворотки мыши, из спленоцитов которой были получены гибридомы, обнаруживают явную тенденцию к пониженному связыванию с АФП-ТБ. Помимо этого, МкАт D10 и F2 также слабо связываются и с АФП-Э. Эти предварительные результаты показывают необходимость изучения МкАт в отношении микровариантов
АФП с целью возможного использования этих МкАт для дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований.
ЛИТЕРАТУРА
1. (Абелев Г. И.) Abelev G. I. // Cancer Res.— 1971.— Vol. 14,— P. 295—358.
2. Гусев А. И., Язова А. К. // Биохимия.— 1970.— Т. 35.—
В. 1,— С. 172—181.
3. Перова С. Д., Абелев Г. И. // Вопр. мед. химии.— 1967.— Т. 13, № 4,— С. 369—377.
4. (Полторанина В. С., Абелев Г. И., Язова А. К.) Poltora-nina V. S., Abelev G. /., Yazova A. K. // Molec. Immunol.—
1987,— Vol. 24, N 11,— P. 1123—1127.
5. Татаринов Ю. С., Афанасьева А. В. // Бюлл. экспер. биол.— 1965.— № 6.— С. 65—69.
6. Язова А. К-, Гусев А. И. // Бюлл. экспер. биол.— 1971.— № П.—С. 63—67.
7. Язова А. К-, Гусев А. И., Лежнева О. М. // Бюлл. экспер. биол,— 1982.— № 7,— С. 62—64.
8. Язова А. К-, Гусев А. И., Лежнева О. М. // Иммунологические аспекты биологии развития, М., 1984, С. 130—138.
9. Язова А. К., Гусев А. И., Андреев А. В., Якименко Е. Ф. Заявки № 4682710/30—13 (046202); № 4684433/30—13
(046204); № 4683257/30—13 (045412); № 4682709/30—13
(046205). Приоритет от 31.3.89.
10. Friquet В., Djavadi-Ohaniance Z., Pages I. et al. // J. Immunol. Meth.— 1983.— Vol. 60,— P. 351—358.
11. Gittin D., Boesman M. // Comp. Biochem. Physiol.— 1967,—Vol. 21,— P. 327—336.
12. Griffits B. W., Godard A., Caron I. A., Tostowaryl N. // Immunology.— 1987.— Vol. 60, N 4.— P. 491—496.
13. Kohler G., Milstein C. // Nature.— 1975.— Vol. 256.— P. 495—497.
14. Kenett Dan // J. Immunol. Meth.— 1988.— Vol. 106, N 2.— P. 203—209.
15. Masopust I., Zizkovsky V., Kithier К■ // Protides Biol. Fluids, Proc. Collog.— 1971. P. 18.
16. Michell B., Fiebach N.. Karsten U. et al. // Europ. J. Cancer Clin. Oncol.— 1983.—Vol. 19, N 9.—P. 1239—1246.
17. Wellerson B., Shaw S., Kaplan P. // Hybridoma.— 1984.— Vol. 3, N 2.— P. 177—185.
18. Wilson М. B., Makane P. K. Immunofluorescense and related staining technique.— Amsterdam, Elsevier (North Holland Biomedical Press), 1978.
19. Zeng Carl Q.-Y., Alpert Elliot // Tumor Biology.— 1989,— Vol. 10, N 1,— P. 4—11.
Поступила 19.12.89
HUMAN ALPHA-FETOPROTEIN EPITOPES — AS REVEALED WITH MONOCLONAL ANTIBODIES
A. K- Yazova, A. I. Goussev, V. S. Poltoranina, E. F. Yakimenko, G. I. Abelev
Two approahes were applied to study the epitope specificity of 12 monoclonal antibodies (Mabs) to human alpha-feto-protein (hAFP). The first includes Mab cross-reactivity with AFP of seven mammalian species in ELISA and mixed precipitation in gel. The second consists of cooperative Mab binding with hAFP when tested in pair mixtures in ELISA.
The results in anti-hAFP Mab epitope specificity showed the necessity to consider the findings as additional to each other because of the revealed limitations in both approaches. Thus, it was shown that 12 anti-hAFP Mabs recognize 8 unique epitopes (поп-repeated) on hAFP. In terms of this analysis 2 of these 8 epitopes may be regarded as specific for human beings, whereas, the remaining were found common for other species (i. e. mouse, rat, calf, dog, pig and cat), combined in several groups according to each epitope. Revealed 8 epitopes present in the AFP synthesized by hepatocellular carcinoma, teratoblastoma and embryon.
