CC BY
56
© М.М.Батюшин, Д.Г.Пасечник, Д.С.Бобылев, А.У.Уруджев, 2015 УДК 616.61-036.12:57.017.35
М.М. Батюшин1, Д.Г. Пасечник2, Д.C. Бобылев1, А.У. Уруджев1
ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КАК ОДИН ИЗ АСПЕКТОВ РЕПАРАЦИИ ПОЧЕК В РАМКАХ ХРОНИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ
1 Кафедра внутренних болезней с основами общей физиотерапии №2; 2Центральная научно-исследовательская лаборатория Ростовского государственного медицинского университета, г Ростов-на-Дону, Россия
M.M. Batiushin1, D.G. Pasechnik2, D.S. Bobilev1, A.U. Urudgev1
EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITION AS AN ASPECT OF KIDNEY REPARATION IN CONTEXT OF CHRONIC NEPHROPATHY
1 Department of internal disease with fundamentals of physical therapy №2; 2Central Research Laboratory Rostov State Medical University, Russia
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ: оценить взаимосвязь эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) с повреждением паренхимы и нарушением функции почек. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ. В исследование было включено 62 пациента с различными формами хронического гломерулонефрита (ГН), 25 мужчин и 37 женщин. Для оценки эпителиального фенотипа клеток использовались моноклональные антитела (фирма «DAKO», ready-to-use (RTU) к панцитокератину (клон АЕ1/АЕ3), Е-кадгерину (клон NCH-38), CD10 (клон 56C6), в качестве маркеров мезенхимальной дифференцировки использовались моноклональные антитела к виментину (клон V9) и альфа-гладкомышечному актину (клон 1A4). Оценка пролиферативной активности тубулярного эпителия проводилась с помощью антител к Ki67 (клон MIB-1). РЕЗУЛЬТАТЫ. По результатам исследования ЭМТ наблюдалась у 66% пациентов, у 34% данного явления не обнаружено. Тубулоинтерстициальный фиброз (ТИФ) имел умеренную выраженность в 84%, в 11% случаев был выраженным, у 5% пациентов не отмечался. В группе больных с IgA-нефропатией и ФСГС при проведении регрессионного логистического анализа при отсутствии ЭМТ риск развития тПН составил 8%, при умеренно выраженном ЭМТ риск тПН увеличился до 55% (df= 1, p=0,003). ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Таким образом, согласно результатам проведенного исследования, в группе больных с ЭМТ достоверно чаще встречаются более тяжелые стадии ХБП.
Ключевые слова: хронический гломерулонефрит, эпителиально-мезенхимальная трансформация, тубулоинтерстициальный фиброз, хроническая болезнь почек.
ABSTRACT
AIM: to identify relationship between epithelial-mesenchymal transition (EMT) and renal parenchyma injury and renal dysfunction. PATIENTS AND METHODS. The study included 62 patients with various forms of chronic glomerulonephritis (GN), 25 males and 37 females. To assess phenotype of epithelial cells used monoclonal antibodies (company DAKO, ready-to-use (RTU) to pancytokeratine (clone AE1 / AE3), E-cadherin (clone NCH-38), CD10 (clone 56C6), as marker for mesenchymal differentiation used monoclonal antibodies to vimentin (clone V9) and alpha-smooth muscle actin (clone 1A4). Evaluation of tubular epithelium proliferative activity was performed using antibodies to Ki67 (clone MIB-1). RESULTS. According to the study EMT was observed in 66% patients, in 34% this phenomenon is not found. Tubulointerstitial fibrosis (TIF) had moderate severity in 84%, in 11% cases was significant, in 5% of patients not found. In patients group with IgA-nephropathy and FSGS, during logistic regression analysis without EMT risk of ESRF was 8%, with moderate EMT end-stage renal failure risk increased to 55% (df = 1 , p = 0,003). CONCLUSIONS. Thus, according to results of the study, in patients with EMT severe CKD stages are significantly more common. Key words: chronic glomerulonephritis, epithelial-mesenchymal transition, tubulointerstitial fibrosis, chronic kidney disease.
ВВЕДЕНИЕ
Одними из основных факторов риска прогрес-сирования почечного фиброза, независимо от этиологии заболевания, являются протеинурия и окислительный стресс. До недавнего времени полагали,
Батюшин М.М. 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, д. 29. Ростовский государственный медицинский университет, кафедра внутренних болезней с основами физиотерапии №2. Тел.: +7 918-501-88-01, E-mail: [email protected]
что гломерулярные и тубулоинтерстициальные процессы фиброза обусловлены взаимодействием между проникающими в ткань воспалительными и резидентными почечными клетками, приводящими к замене паренхимы внеклеточным коллагеновым матриксом. В настоящее время установлены новые аспекты повреждения почек - доказана способность гломерулярных и канальцевых клеток к
фенотипическим изменениям в процессе ремоде-лирования. В ответ на повреждение гломеруляр-ные и канальцевые эпителиоциты регрессируют до примитивно-зародышевого мезенхимального фенотипа путем эпителиально-мезенхимальной трансформации. Пластичность клеток эпителия обусловлена, главным образом, двумя процессами: метаплазией, или трансдифференциацией, и эпителиально-мезенхимальной трансформацией (ЭМТ), или клеточной трансформацией. В обоих случаях происходит активация «запрещенных к экспрессии» генов локусов хромосом. При ЭМТ генетический материал «рекрутируется» по нескольким направлениям.
Первый тип ЭМТ характерен для эмбриональных тканей, в стадию гаструляции и образования нервной трубки. Для него важно образование из первичного эпителия кластера мезенхимальных клеток с последующим образованием вторичного эпителия.
Второй тип ЭМТ реализуется при персисти-рующем повреждении клеток. Схема событий такова: при раздражении мембраны эпителиоцитов происходит нарастание стресс-волокон, «рекрутирование» молекулярных носителей ЭМТ, синтез сократительных волокон, накопление в клетках лизосом, лизис подлежащей базальной мембраны с последующим формированием псевдоподий на мембране клеток и выходом в окружающую межуточную ткань с началом функционирования данных клеток как фибробласты. Важно отметить один момент: неизвестно, есть ли в этом процессе «промежуточная» мезенхимальная, малодиффе-ренцированная стадия, или же эпителиоциты сразу превращаются в «зрелые» фибробласты [1-3].
Третий тип ЭМТ реализуется в опухолях (карциномах). У опухолевых клеток появляется возможность передвигаться и метастазировать с током крови [4].
Отличием же метаплазии от ЭМТ служит то, что при метаплазии из эпителия образуется вновь эпителий, хоть и другого типа, при ЭМТ происходит качественный скачок в пользу «открытия» новых, ранее не используемых, но предсуществующих «запрещенных» генов.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В исследование было включено 62 пациента, средний возраст 37,8±1,9 года, с различными формами хронического гломерулонефрита и другими нефропатиями, из них 25 мужчин и 37 женщин. По результатам нефробиопсий в группе обследуемых наблюдали следующие формы нефропатий: ^А-
нефропатия - 22 человека; фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) - 9 человек; болезнь минимальных изменений - 5 человек; амилоидная нефропатия - 5 человек; болезнь тонких мембран -2 человека; мембранозная нефропатия - 2 человека; СЗ-нефропатия - 2человека; быстропрогрессирую-щий олигоиммунный гломерулонефрит с формированием полулуний - 2 человека, по 1 больному ANCA-ассоциированный очаговый некротическим гломерулонефрит с формирующимися полулуния-ми - 1 человек; быстропрогрессирующий гломе-рулонефрит (БПГН) с полулуниями - 1 человек; олигоиммунный гломерулонефрит - 1 человек; сосудистый нефросклероз - 1 человек; мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит 3-го типа - 1 человек; диабетическая нефропатия - 1 человек; люпус-нефрит, мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит 1-го типа - 1 человек; С3-ассоциированный БПГН - 1 человек; иммунотак-тоидная нефропатия - 1 человек; криоглобулине-мический гломерулонефрит - 1 человек.
Средний уровень креатинина в сыворотке крови в группе составил 200,2±29,4 мкмоль/л, средний уровень протеинурии - 2,2±0,25 г/л, средняя продолжительность нефропатии - 2,5±0,7 года, систолическое АД - 140,6±1,9 мм рт. ст., диастолическое АД - 90,6±0,9 мм рт. ст., средний уровень скорости клубочковой фильтрации (СКФ), рассчитанный по формуле CKD-EPI, - 62,6±4,8 мл/мин/1,73 м2, по четырехкомпонентной формуле MDRD - 45,4±2,4 мл/мин/1,73 м2.
Нефритический синдром наблюдался у 32% пациентов, нефротический синдром без артериальной гипертензии - у 27%, нефротический синдром с артериальной гипертензией - у 12%, изолированный мочевой синдром - у 16%, острое повреждение почек (ОПП) диагностировано у 5%.
Тканевой материал почечных биоптатов для световой микроскопии и иммуногистохимическо-го исследования фиксировали 4% забуференным нейтральным формалином и заключали в парафин по классической методике. Для оценки эпителиального фенотипа клеток использовали моно-клональные антитела (фирма <^АКО», геаёу-Ш-ше ^Ти) к панцитокератину (клон АЕ1/АЕ3), Е-кадгерину (клон ^Н-38), CD-10 (клон 56С6), в качестве маркеров мезенхимальной дифферен-цировки использовали моноклональные антитела к виментину (клон У9) и альфа-гладкомышечному актину (клон 1А4). Оценку пролиферативной активности тубулярного эпителия проводили с помощью антител к К167 (клон М1В-1). Эндотелий выявляли с помощью антител к CD34 класс II
(клон QBEnd 10). ЭМТ оценивали по характеру распространенности (очаговый и распространенный) [5].
Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета прикладных статистических программ программного обеспечения Statistica 8,0 («StatSoft Inc», USA). Рассчитывали среднюю арифметическую, удельный вес выбранных параметров и их ошибки. При нормальном распределении показателя вычисляли t-критерий Стьюдента, при несимметричном - х2-критерий. Проводили регрессионный анализ с помощью логит-преобразования с использованием теста Cox-Mantel. Проводили анализ выживаемости по Каплану-Майеру по общепринятой методике. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам исследования ЭМТ наблюдалась у 66% пациентов (у 1,5% - распространенная форма), у 34% - данного явления не обнаружено. Тубулоинтерстициальный фиброз имел умеренную выраженность у 84%, в 11% случаев был выраженным, у 5% пациентов не отмечался.
В морфологическом плане все больные были разделены на две группы по наличию ЭМТ и выраженности фиброзирования паренхимы почек.
В группу больных без ЭМТ включили 21 пациента (34%). Средние показатели в этой группе составили: креатинин сыворотки крови - 121±15 мкмоль/л, протеинурия - 1,7±0,37 г/л, продолжительность нефропатии - 0,88±0,05 лет, возраст -35,3±3 года, СКФ по CKD-EPI - 78,1±7,6 мл/ мин/1,73 м2.
В группу пациентов с умеренно выраженными признаками ЭМТ были включены 41 человек (66%). Средние показатели в этой группе составили: креатинин сыворотки крови - 236±43 мкмоль/л, протеинурия - 2,5±0,33 г/л, продолжительность нефропатии - 3,45±1 лет, возраст - 39±2,41 лет, СКФ по CKD-EPI- 55,67±5,8 мл/мин/1,73м2.
В группе больных с умеренно выраженными признаками ЭМТ уровень креатинина был практически вдвое выше, а СКФ достоверно ниже, чем в группе больных без ЭМТ; также отмечались более высокие показатели протеинурии и большая продолжительность нефропатии. При этом возраст пациентов был примерно одинаковым (39±2,41 года и 35,3±3 года соответственно, p>0,1), что позволило исключить возрастные процессы из факторов влияния на риск развития ЭМТ
В нашем исследовании частота IgA-нефропатии
составила 35 %. В этой когорте больные с ЭМТ составили 63,6%. Наличие умеренно выраженного тубулоинтерстициального фиброза у данной группы составило 77,3%, выраженного - 27,3%. В этой группе полностью отсутствовали пациенты без признаков тубулоинтерстициального фиброза.
ФСГС встречался в 14,5% всех случаев нефро-патий. Пациенты с ЭМТ составили 55,6%. Наличие умеренно выраженного тубулоинтерстициального фиброза у данной группы регистрировалось в 88,9%.
В группе больных с IgA-нефропатией и ФСГС при проведении регрессионного логистического анализа были выделены факторы, ассоциирующиеся с риском формирования ЭМТ. Показано, что при отсутствии ЭМТ риск развития ХПН составил 8%, при наличии ЭМТ риск ХПН возрос до 55% (t=3,4, p=0,003).
Анализ выживаемости по Каплану-Майеру не продемонстрировал влияния ЭМТ на почечную выживаемость (t = 1,1, p =0,27; t = -1,0, p =0,29). В качестве признака почечной выживаемости была выбрана СКФ<60мл/мин/1,73 м2.
ОБСУЖДЕНИЕ
Клетки эпителиального фенотипа начинают мигрировать в интерстиций, образуя area fibrotica, развиваются фиброз интерстиция, фиброз почек, «констелляционная» система сигнальных белков данной локальной системы, на уровне нефрона, изменяется, оставляя после себя очаги и фокусы фиброза, которые мы видели в микропрепаратах почек пациентов [6].
Очаги ЭМТ чаще всего наблюдаются у больных на фоне умеренного фиброза интерстиция, однако, примечательно, что есть четкая патогенетическая связь между наличием ЭМТ и тяжестью заболевания.
Давность заболевания, на первый взгляд, была связана с наличием фиброза почек на фоне очагов ЭМТ, представляющих собой своего рода «каналы», по которым небольшим, но постоянным потоком в локальный очаг фиброза поступали новые фибробластоподобные клетки. Последние во все нарастающем количестве и чем дольше, тем больше, продуцировали интерстициальный матрикс, приводя, в конечном итоге, к трансформации его в тот вид, который был продемонстрирован в био-птатах наших пациентов - фиброз интерстиция, доходящий в отдельных случаях до 30-40%.
В заключение хочется отметить, что остается открытым вопрос, почему в вышеприведенных случаях клеточный генотип выбирает путь ЭМТ, а
не апоптоза, так как в обоих случаях активируется схожий сигнальный путь SMAD. Возможно, в данном случае активируется более эволюционно древняя часть генов, призывающая клетку к «спасению бегством» и активному функционированию [7-9].
Таким образом, анализируя процесс ЭМТ, в конечном счете подходим к фундаментальным биологическим и медицинским проблемам, затрагивающим сущность жизни клетки в сложно кооперированной многоклеточной иерархичной системе с множеством путей существования клеток и их взаимообменом и взаимосообщением.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В завершение нашего исследования мы можем сделать следующие выводы. Согласно данным клинико-лабораторных исследований: уровень кре-атинина и протеинурии, степень снижения СКФ, нарушение почечной функции были выраженнее у больных с ЭМТ, чем у больных без ЭМТ. Более того, при проведении анализа выживаемости по Каплану-Майеру, что характеризует дальнейший прогноз данных пациентов, было выявлено, что в группе больных с ЭМТ чаще почечная выживаемость выглядит хуже, чем без ЭМТ.
При выделении ^А-нефропатии и ФСГС, проведении регрессионного логистического анализа были выделены факторы, ассоциирующиеся с риском формирования ЭМТ. Показано, что при отсутствии ЭМТ риск развития ХПН значительно ниже (8%), чем при наличии ЭМТ (55%).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Репин ВС, Сабурина ИН. Обратимые эпителио-мезенхимальные траснформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении тканей. Клет транспл и тканевая инженерия 2006; 1 (3): 64-72 [Repin VS, Saburina IN. Reversible epithelio-mesenchymal transformatsii cells in embryogenesis and postnatal tissue renewal. Klet. transpl. itkanevajainzhenerija 2006; 1 (3): 64-72]
2. Zeisberg M, Kalluri R. The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis. J Mol Med 2004; 82(3): 175-181
3. Liu Y Epithelial to mesenchymal transition in renal fibro-genesis: pathologic significance, molecular mechanism, and therapeutic intervention. J Am Soc Nephrol 2004; 15(1): 1-12
4. Biamonti G, Catillo M, Pignataro D et al. The alternative splicing side of cancer. Semin. CellDevBiol2014; (14): 44-49
5. Василенко ИВ, Кондратюк РБ, Кудряшов АГ и др. Особенности эпителиально-мезенхимальной трансформации в раках различной локализации и гистологического строения. Клин онкол 2012; 5 (1): 163-167 [Vasilenko IV, Kondratjuk RB, Ku-drjashov AG et al. Features of epithelial-mesenchymal transformation in cancers of different localization and histological structure. Klinicheskaja onkologija 2012; 5 (1): 163-167]
6. Okada H, Inoue T, Suzuki H, et al. Epithelial-mesenchymal transformation of renal tubular epithelial cells in vitro and in vivo. Nephrol Dial Transplant 2015;15 (6): 44-46
7. Галишон П, Гертиг А. Эпителиально-мезенхимальная трансформация как биомаркер почечного фиброза: готовы ли мы применить теоретические знания на практике? Нефрология 2013; 17 (4): 9-16 [Galishon P, Gertig A. Epithelialmesenchymal transformation as a biomarker of renal fibrosis: are we ready to apply theoretical knowledge in practice? Nefrologija 2013; 17 (4): 9-16]
8. Kriz W, Kaissling B, Le Hir M. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) in kidney fibrosis: fact or fantasy? J Clin Invest 2011; 121 (2): 468-474
9. Lee JM, Dedhar S, Kalluri R, Thompson E. The epithelialmesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J of Cell Biology 2006; 172(7): 973-981
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила в редакцию:17.02.2015 г.
Принята в печать: 26.06.2015 г.
