CC BY
19
4.7. ИЗБРАННЫЕ ВОПРОСЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ
УДК 575.162:591.48:591.51
М.Б. Павлова
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В АМИГДАЛЕ У КРЫС С РАЗЛИЧНОЙ ВОЗБУДИМОСТЬЮ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА
ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия, [email protected]
Резюме.
Иммуногистохимическими методами изучали влияние длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС) в разные сроки (до 2 месяцев) после стрессирования на содержание 5-метилцитозина (5-таС), отражающее уровень метилирование ДНК, гистона Н3 по лизину 9 (ffi^meS) и гистона Н3 по лизину 4 (H3K4me2-3) клеток базолатерального комплекса амигдалы у крыс линий, различающихся по уровню возбудимости нервной системы - ВП (высокий порог возбудимости) и НП (низкий порог возбудимости). Выявлены межлинейные различия по базовому уровню изучаемых показателей, а также по характеру и динамике влияния на них длительного эмоционально-болевого стрессирования, зависимые от возбудимости нервной системы исследуемых линий.
Ключевые слова: метилирование, ДНК, гистон Н3, амигдала, стресс, возбудимость, крысы
Resume.
Pavlova M.B. Epigenetic changes in the amygdala of rats with different excitability of the nervous system under the influence of emotional pain stress /Pavlov Institute of
Physiology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia. We study by immunohistochemical methods the effect of prolonged emotional pain stress exposure (LEPS) at different times (up to 2 months) after treatment on the content of 5-methylcytosine (5-mC) reflecting the level of DNA methylation, histone H3 at lysine 9 (Н3К9ме3) and histone H3 at lysine 4 (H3K4me2-3) in the cells of basolateral amygdala complex in rat lines with different levels of nervous system excitability - HT (low excitability) and LT (high excitability). Interline differences in the basic level of the studied parameters, as well as in the nature and dynamics of the influence of prolonged emotional pain stress on them, depending on the excitability of the nervous system of the studied lines, were revealed. Keywords: methylation, DNA, histone H3, amygdala, stress, excitability, rat.
Введение.
Изучение эпигенетических механизмов, контролирующих деятельность мозга в норме и при патологических состояниях, вызванных стрессом, является актуальной задачей современной нейробиологии [3, 4, 12].
Значительная часть психических заболеваний, таких, в частности, как посттравматическое стрессовое (ПТСР) и компульсивное расстройства (КР) человека, сопровождается эпигенетической дисфункцией в нейронах структур мозга, входящих в патологический контур этих заболеваний. Одной из таких структур является амигдала [17, 20, 21, 23].
В работе использованы селектированные линии крыс с контрастной возбудимостью нервной системы, являющиеся моделью, с помощью которой, в условиях длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС), воспроизводится ряд нарушений высшей нервной деятельности у человека, характерный для ПТСР и КР. Так, у низковозбудимой линии ВП ДЭБС вызывал углубление депрессивноподобного состояния, рост порога возбудимости, увеличение агрессивности, нарушение пластических процессов; а у высоковозбудимой линии НП - появление и сохранение компульсивных движений, что позволило использовать эти линии для исследования эпигенетических механизмов ПТСР и КР [1, 2].
Известно, что важную роль в осуществлении эпигенетического контроля постстрессорных нарушений высшей нервной деятельности у животных и
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского
исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. человека, включая психопатологию, играют процессы метилирования ДНК
(присоединение метильной группы к цитозину в 5-м положении) и гистонов
(присоединение одной, двух или трех метильных групп к остаткам лизина в N
концах гистона), в частности - гистона Н3 [3, 5, 11,19].
Метилирование ДНК, как правило, связано с ингибированием процесса транскрипции [16]. Влияние на транскрипцию метилирования гистона Н3 может быть разнонаправленным в зависимости от сайта метилирования: три-метилирование гистона Н3 по лизину 9 (Н3К9me3) связано, также как и метилирование ДНК, c репрессией этого процесса [14, 15], а ди-,три-метилирование гистона Н3 по лизину 4 (Н3К4me2-3) напротив - с активной транскрипцией [10, 15].
В настоящее время не изучена роль этих эпигенетических модификаций при воздействии длительного эмоционально-болевого стресса, в частности - в реализации отдаленных постстрессорных нарушений эпигенетического статуса нейронов и деятельности мозга в зависимости от возбудимости, как основной характеристики функционального состояния нервной системы.
С помощью иммуногистохимического метода изучали влияние длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС) по схеме К.Гехта [1] в разные сроки (до 2 месяцев) после стрессирования на содержание 5-метилцитозина (5-тС); три-метилированного гистона Н3 по лизину 9 (Н3К9me3) и ди-,три- метилированного гистона Н3 по лизину 4 (Н3К4те2-3) клеток базолатерального комплекса амигдалы у крыс линий, различающихся по уровню возбудимости системы ВП (высокий порог возбудимости) и НП (низкий порог возбудимости). Эксперименты проведены с соблюдением правил биоэтики.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали самцов крыс двух линий, селектированных по высокому (ВП) и низкому (НП) порогам возбудимости нервной системы в лаборатории генетики высшей нервной деятельности Института физиологии им. И.П.Павлова РАН [1,2]. Линии прошли к настоящему времени более 70 поколений селекции по пороговым характеристикам нервно-мышечной возбудимости, коррелирующей с возбудимостью центральных отделов нервной
системы.
Исследовали нейроны базолатерального комплекса амигдалы; исследуемая область блА- basolateral amygdaloid nucleus, posterior part - BLP, в соответствии со стереотаксическим атласом мозга крысы [18]. Подопытных животных ежедневно в течение 15 дней подвергали 13-минутному воздействию сочетанным действием электрического тока и света с вероятностью подкрепления 0,5 по схеме К. Гехта [1]. Через 24 часа, 2 недели и 2 месяца после окончания длительного эмоционально-болевого стресса (ДЭБС) животных опытных и контрольных групп забивали и выделяли головной мозг. Мозг фиксировали в 4% растворе параформальдегида и подвергали стандартной гистологической обработке. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм изготавливали в соответствии с координатами стереотаксического атласа мозга крысы [18]. Срезы монтировали на предметные стекла, покрытые желатином и осуществляли иммуногистохимическое окрашивание. Использовали первичные антитела к 5-метилцитозину (5-metylcitidine, Santa Cruz) (5-mC); три-метилированному гистону Н3 по лизину 9 (Anti-Histone H3 (tri methylK9) antibody , Abcam) (H3K9me3) и к ди-,три- метилированному гистону Н3 по лизину (Anti-Histone H3 (di-tri-methyl K4) antibody , Abcam) (H3K4me2-3) в разведении 1:200 и соответствующие вторичные биотинилированные антитела (Vector Laboratories, США). Визуализацию реакции проводили с помощью окрашивания диаминобензидином (3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB) (Peroxidase subst^ Kit DAB, Vector Laboratories, США). Препараты анализировали, оценивая процент иммуноположительных клеток от общего числа клеток в исследуемой области мозга (оборудование: микроскоп Микромед-3; с ^D-камерой и программным обеспечением ВидеоТест-FISH (Санкт-Петербург) и ImageBase; увеличение х40).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выявлен более высокий уровень иммунореактивности клеткок базолатеральной амигдалы к 5-:таС в норме у крыс низковозбудимой линии ВП, по сравнению с высоковозбудимой линией НП (Рисунок 1). Длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие приводило у крыс линии ВП - к снижению, тогда как в линии НП - к возрастанию иммунореактивности клеток к 5-:С через 24 часа после воздействия. У животных линии НП возрастание
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. уровня 5-тС относительно контрольной группы наблюдали повторно через 2
месяца после воздействия.
Рисунок 1. Иммунореактивность к 5-тС клеток базолатеральной амигдалы крыс линий ВП и НП в норме и в разные сроки после действия длительного эмоционально-болевого стрессирования (ДЭБС). Приведены значения медиан, средние значения, границы первого и третьего квартилей, минимальное и максимальное значения выборки.
Обозначения: а, б, в - сроки после окончания ДЭБС; * - различия со значениями в контрольной группе той же линии статистически значимы (Р<0,05); # - различия со значениями в контрольной группе альтернативной линии статистически значимы (Р< 0,05).
Базовый уровень метилирования гистона Н3 по лизину 9 - сайту, ингибирующему транскрипцию (Н3К9те3) достоверно различался у крыс исследуемых линий в точках 24 часа и 2 недели (Рисунок 2). Длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие (ДЭБС) приводило к долговременной активации триметилирования гистона Н3К9, сохраняемой до 2-х месяцев после стрессирования у крыс обеих линий.
Рисунок 2. Иммунореактивность к Н3К9me3 клеток базолатеральной амигдалы крыс линий ВП и НП в норме и в разные сроки после действия длительного эмоционально-болевого стрессирования (ДЭБС). Приведены значения медиан, средние значения, границы первого и третьего квартилей, минимальное и максимальное значения выборки. Обозначения - те же, что на Рисунке 1.
Базовый уровень метилирования Н3К4 по активаторному сайту (Н3К4me2-3) был выше у низковозбудимых крыс по сравнению с высоковозбудимыми (Рисунок 3). Длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие (ДЭБС) приводило к подавлению метилирования Н3К4 только у низковозбудимых крыс линии ВП, с восстановлением показателя к 2-м месяцам. У высоковозбудимых крыс линии НП реакция на ДЭБС была отсроченной - с латентным периодом в 2 месяца, и заключалась, напротив, в активации метилирования Н3К4.
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов». К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
Рисунок 3. Иммунореактивность к Н3К4те2-3 клеток базолатеральной амигдалы крыс линий ВП и НП в норме и в разные сроки после действия длительного эмоционально-болевого стрессирования (ДЭБС). Приведены значения медиан, средние значения, границы первого и третьего квартилей, минимальное и максимальное значения выборки. Обозначения - те же, что на Рисунке 1.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные данные свидетельствуют о том, что базовые уровни иммунореактивности клеток базолатеральной амигдалы к 5-тС, к Н3К9те3 (кроме точки 2 месяца) и к Н3К4те2-3, в низковозбудимой линии ВП достоверно более высокие, чем в линии НП. Аналогичные данные получены нами ранее при изучении другой эпигенетической модификации в других структурах мозга - на этих же линиях крыс в таких же условиях эксперимента: у крыс линии ВП по сравнению с крысами линии НП обнаружен более высокий базовый уровень фосфорилирования гистона Н3 в поле СА3 гиппокампа [7] - структуры лимбической системы, входящей в патологический круг ПТСР и КР, наряду с амигдалой [21], а также - в ретикулярной формации среднего мозга [6].
Обращает на себя внимание тот факт, что более высокий базовый уровень
исследуемых эпигенетических модификаций в линии ВП и более низкий - в линии НП наблюдаются одновременно для показателей, связанных как с репрессией транскрипции, так и с ее индукцией, что свидетельствует о наличии в норме генотип-зависимого, обусловленного возбудимостью нервной системы, количественного баланса и возможной взаимозависимости факторов, разнонаправленно влияющих на процесс транскрипции.
Данные, полученные нами при влиянии ДЭБС, в целом, свидетельствуют об участии процессов метилирования ДНК и метилирования гистона Н3 по репрессорному и активаторному сайтам в постстрессорной регуляции функционирования генома нейронов базолатеральной амигдалы в ответ на длительное эмоционально-болевое воздействие. Аналогичными исследованиями других авторов показана роль эпигенетических модификаций в функционировании мозга в ответ на действие различных форм стресса, в стресс-зависимом поведении, в процессе формирования памяти и т.п. [3, 9, 10, 13, 14]. Однако, влияние генетической составляющей в этих работах не исследовалось.
Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что направленность и временные характеристики влияния ДЭБС на уровень иммунореактивности клеток базолатеральной амигдалы исследуемых линий крыс к 5-тС, к Н3К9те3 к Н3К4те2-3 также, как и показатели, наблюдаемые в норме, зависят от уровня возбудимости нервной системы и являются специфичными для каждой линии, что соотносится с данными, полученными нами ранее при исследовании влияния ДЭБС на уровень фосфорилирования в гиппокампе [6].
Крысы обеих линий реагировали на длительное эмоционально-болевое стрессорное воздействие (ДЭБС) долговременной активацией процесса три-метилирования гистона Н3 по сайту, ингибирующему транскрипцию (Н3К9те3) (Рисунок 2). Вместе с тем в таких же условиях эксперимента имело место подавление ди-три-метилирования гистона Н3 у крыс низковозбудимой линии ВП по сайту, стимулирующему транскрипцию (Н3К4те2-3) (Рисунок 3). Высоковозбудимые крысы линии НП реагировали на ДЭБС только через 2 месяца и противоположным образом - активацией процесса метилирования Н3К4.
Функционально значимое взаимодействие метилирования гистона Н3 по активаторному и репрессорному сайтам происходило только на ранних этапах
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского
исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России. после ДЭБС, и только у низковозбудимых животных (Рисунки 2, 3). У
высоковозбудимых крыс НП выявлено одновременное усиление и стабильное
сохранение до 2-х месяцев после ДЭБС как метилирования ДНК, так и
метилирования гистона Н3К9 (Рисунки 1, 2) - процессов, связанных с репрессией
транскрипции, формированием гетерохроматина и сайленсингом генов (Hunter,
2012; Moore LD, 2013; Дюжикова, 2018). Таким образом, под влиянием ДЭБС в
клетках амигдалы может происходить регулируемое по меньшей мере двумя
эпигенетическими путями подавление экспрессии генов, обусловленное
высоким уровнем возбудимости нервной системы крыс. Генетически
детерминированная возбудимость нервной системы является фактором риска,
определяющим специфику и временную динамику эпигенетических
преобразований нервных клеток при формировании травматической памяти
(памяти стресса).
ВЫВОДЫ
Полученные данные, в целом, дополняют результаты многочисленных исследований, доказывающих важную роль эпигенетических модификаций в реакции на разные виды стресса и в механизмах психопатологий у человека [4,8,12,19,22], а также свидетельствуют о влиянии генотипзависимого функционального состояния нервной системы на эпигенетическую реакцию нейронов амигдалы, как важнейшего звена лимбической системы, при действии стресса.
Работа проводилась в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013-2020 годы (ГП-14, раздел 65).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вайдо А.И., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В., Соколова Н.Е., Вшивцева В.В., Савенко Ю.Н. Системный контроль молекулярно-клеточных и эпигенетических механизмов долгосрочных последствий стресса // Генетика. 2009. Т.45. № 3. С. 342-348.
2. Вайдо А.И., Ширяева Н.В., Павлова М.Б., Левина А.С., Хлебаева Д.А.-А., Любашина О.А., Дюжикова Н.А. Селектированные линии крыс с высоким и низким порогом возбудимости: модель для изучения дезадаптивных состояний, зависимых от уровня возбудимости нервной системы // Лабораторные животные
для научных исследований. 2018. №3: С.12-23.
3. Григорьян Г.А., Гуляева Н.В. Стресс-реактивность и стресс-устойчивость в патогенезе депрессивных расстройств: роль эпигенетических механизмов // Журнал высшей нервной деятельности. 2015. Т.65. №1. С.19-32.
4. Дюжикова Н.А., Даев Е.В. Геном и стресс-реакция у животных и человека // Экологическая генетика, 2018. 16(1): 4-26. DOI: 10.17816/ecogen1614-26.
5. Дюжикова Н.А., Скоморохова Е.Б., Вайдо А.И. Эпигенетические механизмы формирования пост-стрессорных состояний // Успехи физиологических наук. 2015. Т. 46. № 1. С. 47-75.
6. Павлова М.Б., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В., Савенко Ю.Н., Вайдо А.И. Влияние длительного стресса на фосфорилирование гистона H3Ser10 в ядрах нейронов сенсомоторной зоны коры и ретикулярной формации среднего мозга линий крыс с различной возбудимостью нервной системы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013, Том 155, No 3. С 352-354.
7. Павлова М.Б., Савенко Ю.Н., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В., Вайдо А.И. Влияние длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия на процесс фосфорилирования на процесс фосфорилирования гистона Н3 в гиппокампе линии крыс, различающихся по возбудимости нервной системы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Том 153, N 3. С. 336339.
8. Blacker C.J., Frye M.A., Morava E., Kozicz T., Veldic M. A Review of Epigenetics of PTSD in Comorbid Psychiatric Conditions // Genes (Basel). 2019 Feb. 13;10(2). pii: E140. doi: 10.3390/genes10020140.
9. Chakravarty S., Pathak S.S., Maitra S., Khandelwal N., Chandra K.B., Kumar A. Epigenetic Regulatory Mechanisms in Stress-Induced Behavior // International Review of Neurobiology. 2014. V.115. P. 117-154.
10. Collins В.Е., Sweatt D., Greer C.B. Broad domains of histone 3 lysine 4 trimethylation are associated with transcriptional activation in CA1 neurons of the hippocampus during memory formation // Neurobiology of Learning and Memory 2019. Volume 161. Pages 149-157.
11. De Boni L. and Wullner U. Epigenetic Analysis in Human Neurons: Considerations for Disease Modeling in PD // Front Neurosci. 2019. 13: 276.
К 185-летию великого русского российского ученого и гражданина России -Дмитрия Ивановича Менделеева и 150-летию его наследия -«Периодического закона для химических элементов».
К 170-летию Ивана Петровича Павлова - выдающегося русского российского исследователя в области физиологии, первого нобелевского лауреата России.
12. Graff J., Kim D., Dobbin M.M., Tsai L.H. Epigenetic regulation of gene expression in physiological and pathological brain processes // Physiol.Rev. 2011. V.91. P.603-649.
13. Hunter R.G., McCarthy K.J, Milne T.A., Pfaff D.W., McEwen B.S. Regulation of hippocampal H3 histone methylation by acute and chronic stress // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Dec 8; 106(49):20912-7.
14. Hunter R.G., Murakami G., Dewell S., Seligsohn M., Baker M.E., Datson N.A., McEwen B.S., Pfaff D.W. Acute stress and hippocampal histone H3 lysine 9 trimethylation, a retrotransposon silencing response // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Oct 23;109(43):17657-17662. doi: 10.1073/pnas.1215810109. Epub 2012 Oct 4.
15. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function. // Cell. 2007. V.128. №4. P. 693-705.
16. Moore LD, Le T, Fan G. DNA methylation and its basic function // Neuropsychopharmacology. 2013. 38(1):23-38. doi: 10.1038/npp.2012.112. Epub 2012 Jul 11.
17. Pagliaroli L.,Veto В., Arányi T., Barta C. From Genetics to Epigenetics: New Perspectives in Tourette Syndrome Research. // Front Neurosci. 2016. V. 10. P. 277.
18. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates // 6th edition. -Ac.Press, 2007.
19. Qureshi I. A., Mehler M. F. Epigenetic mechanisms underlying nervous system diseases // Handb. Clin. Neurol. 2018. 147. 43-58. 10.1016/B978-0-444-63233-3.00005-1.
20. Ramo-Fernández L., Schneider A., Wilker S., Kolassa I.T. Epigenetic Alterations Associated with War Trauma and Childhood Maltreatment // Behav. Sci. Law. 2015. V. 33. N5. P. 701-721.
21. Shalev A, Liberzon I, Marmar C. Post-Traumatic Stress Disorder // N Engl J Med. 2017;376:2459-69.
22. Wen K.-X., Milic J., El-Khodor B., Dhana K., Nano J., Pulido T., et al. The Role of DNA methylation and histone modifications in neurodegenerative diseases: a systematic review // 2016. PLoS One 11:e0167201. 10.1371/journal.pone.016720.
23. Zannas A.S., Provencal N., Binder E.B. Epigenetics of posttraumatic Stress Disorder: Current Evidence, Challenges, and Future Directions // Biol Psychiatry.
