CC BY
130
АПРЕЛЬ 2 0 16
Приведены обобщенные литературные данные о распространенности энтеровирус-ной инфекции (ЭВИ) и ее лабораторной диагностике с помощью специфических нейтрализующих сывороток. Представлена краткая информация о серийном промышленном производстве и применении специфических кроличьих сывороток к энтерови-русам 37 типов.
Из более чем сотни известных в настоящее время неполиомие-литных энтеровирусов человека (НПЭВ), насчитывающих 23 вируса Кок-саки А, 6 вирусов Коксаки В, 28 вирусов ЕСНО и ряд «нумеральных» энтеровирусов, классификация которых полностью не завершена, 64 серотипа обладают способностью вызывать различные по клиническим проявлениям, тяжести течения и последствиям заболевания [1]. Повсеместная распространенность возбудителей контагиозной энтеровирус-ной инфекции (ЭВИ) и отсутствие специфических средств лечения и профилактики (исключая полиомиелитную вакцину) постоянно поддерживают высокий уровень инфицированности населения во всем мире, превышающий биллион заражений ежегодно [2]. Хотя большинство случаев ЭВИ протекают бессимптомно или ограничиваются простудной симптоматикой, НПЭВ могут вызывать тяжелые заболевания со смертельными исходами [3, 4]. К их числу относится асептический менингит (энтеровирусы являются этиологическими агентами в более чем 90% случаев), миокардит (25—35%), мульти-органная патология новорожденных (до 33%). В некоторых странах, длительное время регистрирующих ЭВИ, ежегодно до 30—50 млн человек заболевают асептическим менингитом, из них госпитализируется до 50 тыс. [5, 6]. Пандемия острого геморрагического конъюнктивита, вызванная энтеровиру-сом 70-го типа [6—9], и периодические вспышки ящуроподобного заболевания (энтеровирус 71-го типа) с многомил-
Ключевые слова:
неполиомиелитные вирусы, энтеровирусная инфекция, диагностика ЭВИ, набор реагентов «Сыворотки диагностические энтеровирусные моновалентные сухие для реакции нейтрализации»
лионным количеством заболевших среди населения стран Азиатско-Тихоокеанского региона [10—14] выявили высокий потенциал НПЭВ как источников нехарактерных форм патологии.
Keywords: non-polio viruses, enterovirus infection, diagnosis of enterovirus infection, reagents kit«diagnostic enterovirus monovalent dry serum for neutralizing reactions»
This paper summarizes the available data on non-polio enterovirus infections and their diagnosis using specific neutralizing serum. As well as provides the brief information on a serial industrial manufacture of rabbits ' neutralizing serum against 37 enteroviruses serotypes.
V.G. KOZLOV, U.Kh. KHAPCHAEV, A.A. ISHMUKHAMETOV, FSUE Plant for the production of bacterial and viral drugs of M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis. NON-POLIO ENTEROVIRUS INFECTIONS AND PROBLEMS OF THEIR DIAGNOSIS.
ЭВИ подвержены преимущественно дети (60—90% среди всех заболевших), при этом возраст половины пациентов не превышает 12 месяцев. Помимо возрастного фактора, заражению способствуют нарушения иммунных реакций, отсутствие соответствующих санитарно-гигиенических условий, низкий социально-экономический статус определенных групп населения и скученность проживания больших родственных общин [5].
Клинические проявления ЭВИ не имеют строгой связи с типом возбудителя: один и тот же энтеровирус может вызывать различные заболевания, тогда как причиной определенного заболевания могут быть многие НПЭВ (табл.). Расширяющийся спектр НПЭВ и изменение патогенных свойств у уже известных серотипов указывают на продолжающуюся эволюцию этих агентов. Возможными катализаторами активации ЭВИ могут стать высвобождение экологической ниши, занимаемой по-лиовирусами, и снижение интерференционного пресса, создаваемого оральной полиомиелитной вакциной вследствие сокращения ее применения. Исходя из неблагоприятных перспектив глобально нестабильной ситуации по ЭВИ и социально-экономической значимости ряда заболеваний энтеро-вирусной природы, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в 2005 г. внедрила программу ликвидации полиомиелита и систему эпидемиологического надзора за НПЭВ [15]. На территории Российской Федерации (РФ) официальная регистрация энте-ровирусной (неполио) инфекции проводится с 2006 г. В последующий период был отмечен неуклонный рост заболеваемости, увеличение доли детей (до 90%) в общем количестве заболевших, возрастание числа очагов групповой
PEMEOUUM
МЕНЕДЖМЕНТ
заболеваемости, вовлечение в эпидемический процесс большинства регионов страны, включая территории, ранее считавшиеся благополучными по этой инфекции [16, 17]. В структуре ЭВИ регулярно доминировали менингиты (30—70% всех заболеваний энтерови-русной этиологии). Среди 40—60 серо-типов энтеровирусов, выявляемых в различные годы, наиболее часто обнаруживались вирусы ЕСНО 6, 7, 11, 13, 30, Коксаки А9, Коксаки В2, 4, 5. Как известно, большинство из названных се-ротипов циркулируют по эпидемическому типу (резкое повышение активности в различные периоды времени) и являются этиологическими агентами около половины случаев ЭВИ в мире. К «эндемичным» возбудителям, вызывающим немногочисленные вспышки со стабильно низкой заболеваемостью, относились лишь вирусы ЕСНО 11 и Коксаки В2 и 4. На фоне осложненной эпидемиологической ситуации по ЭВИ количество случаев энтеровирусных заболеваний было небольшим и составляло, по далеко не полным данным официальной статистики, от 6 до 16 тыс. [16, 17]. Очевидно, что эти данные не отражают истинные масштабы распространенности энтеровирусов и уровни инфицированности населения страны. В целом результаты проводимого эпидемиологического надзора за ЭВИ свидетельствуют о сохранении неконтролируемой заражаемости населения страны. До настоящего времени окончательно не установлены причины изменения вирулентности, появления новых типов энтеровирусов и разнообразия клинических проявлений ЭВИ.
Из-за этиологического разнообразия ЭВИ, полиморфизма ее манифестных форм и широко распространенного бессимптомного носительства основным источником эпидемиологической и диагностической информации являются данные лабораторных исследований. Следует отметить, что в настоящее время отсутствует стандартный общепринятый метод выявления и идентификации энтеровирусов. Для этих целей применяют как классические вирусологические и серологические методы исследования, так и современные моле-кулярно-биологические методики.
таблица ^¡^ Синдромы энтеровирусной (неполио) инфекции
Синдром Этиологический агент*
Вид Субгруппа, серотип
Паралич А Коксаки А1, 2, 5-7, 8. Энтеровирус 71-го типа
В Коксаки А9, 21. Коксаки В 2-5
ЕСНО 2, 4, 6, 9, 11, 30, 7, 8 13, 14, 16, 18, 31
D Энтеровирус 70-го типа
Серозный менингит А Коксаки А2, 3, 4, 6, 7
В Коксаки А9, 21, Коксаки В 1-6
ЕСНО 2-11,13-21, 25, 27, 28, 30-32
Асептический менингит, А Энтеровирус 71-го типа
менингоэнцефалит В ЕСНО 6, 9, 11, 30
D Энтеровирус 70
Энцефалит, синдром В ЕСНО 2, 6, 9, 19, 3, 4, 7, 11,14,18, 22
Гийена — Баре
Перикардит, миокардит В Коксаки В 1-5. ЕСНО 1, 6, 9, 19
Гепатит А Коксаки А4
В Коксаки А9. Коксаки В5. ЕСНО 4, 9
С Коксаки А20
Системная инфекция В Коксаки В 1-5. ЕСНО 11
новорожденных
Летальный отек легких А Энтеровирус 71-го типа
Герпангина А Коксаки А2-6, 8, 10, 22. Энтеровирус 71-го типа
В Коксаки В5. ЕСНО 6, 9, 11, 16, 17, 25
Пневмония новорожденных А Коксаки А16
В Коксаки А9. Коксаки В 2-5
D Энтеровирус 68-го типа
Острый фарингит А Коксаки А10
С Коксаки А21
Контагиозный насморк С Коксаки А21, 24
Респираторное заболевание A Коксаки А2, 10
В ЕСНО 4, 9, 11, 20, 25, 2-8, 16, 19, 22
Коксаки В 2-5
C Коксаки А21, 24
Лихорадка В Коксаки В 1-6. Энтеровирус 73-го типа
Эпидемическая миалгия В ЕСНО 6, 8, 9
Экзантема А Коксаки А 4-6, 9, 10, 16. Энтеровирус 71-го типа
В Коксаки А9. Коксаки В 5
ЕСНО 2, 4, 6, 9, 11, 12, 16, 18, 3, 5, 7, 8, 12, 14, 19, 20
Острый геморрагический D Энтеровирус 70-го типа
конъюнктивит C Коксаки А24
Острый увеит В ЕСНО 11, 19
Миозит В Коксаки В3
Диарея С Коксаки А18, 20-22, 24
В ЕСНО 11, 14, 18
Сыпь В Коксаки В5
Диабет (обнаружены В Коксаки В1, 3, 5
специфические антитела)
* Курсивом выделены cубгруппы и серотипы возможных этиологических агентов.
Регламентированным ВОЗ методом диагностики ЭВИ является реакция нейтрализации, основанная на подавлении (нейтрализации) инфекционности исследуемого агента поликлональными сыворотками известной специфичности, получаемыми от гипериммунизи-рованных животных. С помощью таких
сывороток были классифицированы 66 энтеровирусов и выявлены антигенные варианты у ряда прототипных штаммов. Функциональный диапазон энтеровирусных поликлональных сывороток позволяет надежно дифференцировать полиовирусы от других энтеровирусов (в контексте ликвида-
50
ЭНТЕРОВИРУСНАЯ (НЕПОЛИО) ИНФЕКЦИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЕЕ ДИАГНОСТИКИ
ршшиим
АПРЕЛЬ 2 0 16
51
ции полиомиелита), определять возбудителей полиморфных, субклинических и атипичных форм энтеровирус-ных заболеваний, выявлять связи между типами энтеровирусов и клиническими синдромами, устанавливать спектр циркулирующих и доминирующих штаммов НИЭВ в целях прогнозирования эпидемических процессов. В связи с этим методически несложная реакция нейтрализации, легко реализуемая на стандартном оборудовании и материалах, стала наиболее распространенным методом идентификации энтеровирусов, широко используемым практическими вирусологическими лабораториями.
Попытки получения энтеровирусных нейтрализующих антител генно-инженерными методами не увенчались достижениями, пригодными для реализации в условиях промышленного производства. Изготовление энтеровирусных типоспецифических сывороток, пригодных для длительного практического использования в качестве стандартного компонента реакции нейтрализации, никогда не выходило за рамки различных по эффективности разовых экспериментов. Основными причинами этого были антигенно-иммуногенная неравноценность многочисленных НПЭВ, а также видовые и индивидуальные особенности иммунологических реакций у животных-продуцентов различных видов. Отсутствие модели, адекватно воспроизводящей особенности иммунного ответа, препятствовало разработке нормативов, обеспечивающих регулярное получение энтеровирусных сывороток со стабильными свойствами качества, что необходимо для широкого применения этих препаратов и сравнения получаемых результатов. Наиболее результативными были эксперименты по иммунизации высоко-реактогенных обезьян и породистых лошадей. Лошади, наиболее полно соответствующие требованиям, предъявляемым к продуцентам специфических сывороток (относительная однородность иммунного ответа и получение целевых продуктов в значительных объемах), были использованы для получения больших количеств энтерови-русных сывороток, аттестованных ВОЗ в качестве международных стандартов
в начале 60-х гг. ХХ в. [18]. Однако в результате 30-летнего повсеместного использования этих препаратов, известных как сыворотки LBM, их запасы были полностью исчерпаны. Высокозатратная технология изготовления рефе-ренс-сывороток RIVM (Нидерланды), получаемых от генетически однородных кроликов (полиомиелитные сыворотки) или лошадей (неполиомиелит-ные энтеровирусные сыворотки), позволяла производить препараты только в ограниченных объемах, обеспечивающих потребности диагностических лабораторий ВОЗ. Вследствие этого многие практические вирусологические лаборатории занимались изготовлением энтеровирусных сывороток самостоятельно, используя доступных животных и различные схемы их иммунизации [19, 20]. Нестабильное качество подобных сывороток делало их непригодными для использования в диагностических целях. Проблема обеспечения диагностических служб РФ надежными средствами диагностики ЭВИ обострилась в начале 2000-х гг. вследствие прекращения масштабного изготовления энтеровирус-ных диагностических сывороток (ЭДС), не соответствующих требованиям стабильности, специфичности и отсутствия побочных эффектов. Для восполнения сложившегося дефицита средств диагностики ЭВИ и улучшения ее качества нами была разработана технология экономичного массового серийного промышленного изготовления диагностических сывороток со стабильными свойствами качества, идентифицирующих патогенные и наиболее распространенные НПЭВ, представленные вирусами Коксаки А2, 4, 7, 9,10, Коксаки В 1-6, ЕСНО 2-9, 11-13, 16, 20, 21, 25, 27, 29, 30, 33 и энтеровирусами 68—71 [21, 22].
С учетом экономической доступности в качестве продуцентов энтеровирусных сывороток были использованы кролики породы шиншилла рандомбредной категории, разводимые, содержащиеся и эксплуатируемые в открытых (конвенциональных) системах. Вследствие слабого и нестабильного иммунного ответа на большинство НПЭВ кролики этой категории традиционно считались непригодными для получения
высокоактивных сывороток соответствующей специфичности [23]. Исходя из этих обстоятельств, пути оптимизации качества целевых продуктов заключались в стабилизации и стандартизации специфической активности иммуноге-нов, в коррекции схемы иммунизации и в увеличении нейтрализующей активности целевых продуктов. Применение адекватных методов и тест-систем для оценки активности им-муногенов решило проблему обоснованного выбора стратегии иммунизации, обеспечивающей формирование приемлемого иммунного ответа у более чем 90% кроликов. Соответствие показателей нейтрализующей активности у получаемых однотипных энтеровирус-ных сывороток (в пределах разрешающих возможностей применяемых систем измерений) позволило установить допустимые лимиты этого параметра, что сделало процесс сывороточного производства контролируемым и управляемым [22]. Была установлена эффективность стимуляции гуморального иммунного ответа кроликов, иммунизируемых НПЭВ, адъювантной системой ШггМах [24, 25]. Хорошо известным недостатком кроличьих сывороток является их токсичность для ксеногенных клеток. Реакции используемых в нейтрализации индикаторных клеток на цитотоксичные кроличьи сыворотки, внешне сходные с ци-топатогенным эффектом энтеровиру-сов, могли приводить к ложноотрица-тельной интерпретации получаемых результатов. Детерминанты цитоток-сичности ассоциировали с ^М нормальных и ^ иммунных кроличьих сывороток. Однако этим представлениям противоречила нетоксичность некоторых высокоактивных энтеровирус-ных сывороток. Проведенные нами эксперименты по уточнению природы ци-тотоксичности показали, что иммуноглобулины не являются основной, а тем более единственной причиной этого свойства [26]. Эти данные послужили предпосылкой для разработки метода очистки цитотоксичных энтеровирус-ных сывороток. С этой целью были использованы ткани плаценты (ТП), способные пропускать молекулы ^ и непроницаемые для циркулирующих в крови эндогенных токсинов [27].
МЕНЕДЖМЕНТ
52 1Апо7б|РШШиим
В сериях экспериментов были отработаны режимы получения ТП с наибольшей адсорбционной емкостью и определены оптимальные условия очистки, приводящие к снижению уровней ци-тотоксичности кроличьих сывороток в 4-10 раз [28].
Внедрение разработанной технологии в промышленное производство 33 энте-ровирусных сывороток, изготавливаемых ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», показало, что свойства серийно произведенных препаратов полностью соответствуют стандартам диагностической
реакции нейтрализации: рабочие разведения сывороток, содержащие 20 нейтрализующих единиц, нейтрализуют 32320 ККИД гомологичного энтеровиру-са, не обладают гетерологичной активностью и не токсичны. Производимый в настоящее время набор реагентов «Сыворотки диагностические энтеровирус-ные моновалентные сухие для реакции нейтрализации», включающий 33 сыворотки к НПЭВ и сыворотки к полиови-русу 1-3-го типов, является неотъемлемым и основным компонентом диагностики ЭВИ, поскольку диагностический набор для ПЦР-анализа отечественного производства выявляет энтеровирусную РНК и идентифицирует РНК энтерови-
руса 71-го типа. Обогащение арсенала средств диагностики ЭВИ широким ассортиментом энтеровирусных диагностических сывороток повысило эффективность деятельности вирусологических лабораторий по выполнению программ эпидемиологического надзора и профилактики ЭВИ на территории РФ. Рациональное сочетание серологических и молекулярно-биологических методов диагностики может стать основой единого диагностического пространства, способствующего проведению эффективных противоэпидемических мероприятий и позитивному изменению ситуации по ЭВИ.
ИСТОЧНИКИ
1. Pallansch MA, Roos RP. Enteroviruses: polioviruses, coxsakieviruses, echoviruses and newer enteroviruses. In: Fields viriligy. Fourth edition. Knipe DN, Howley PM (Eds.). Lippincott-Raven Publ. Philadelphia. 2001. Pp. 724-775.
2. Morens DM, Pallanch MA. Epidemiology. In: Human enterovirus infections. Rotbart HA (Ed) ASM Press. Washington. 1995. Pp. 3-23.
3. Martino TA, Lin P, Petric M et al. Enteroviral myocarditis and dilated cardiomyopathy: a review of clinical and experimental studies. In: Human enterovirus infections. Rotbart H.A. (Ed.) AMS Press. Washington. 1995. Pp. 291-351.
4. Pallansch MA, Oberste MS. Molecular detection and characterization of human enteroviruses. In: Cardiomyopathies and heart failure: biomolecu-larinfectious and immune mechanisms. Matsumori A. (ed.). Kluwer Academic Publishers. Boston. 2003. Pp. 245-257.
5. Khetsuriani N, LaMonte-Fowlkes A, Oberste S, Pallansch MA. Enterovirus surveillance — United States, 1970—2005. MMWR Surveill Summ., 2006, 55: 1-20.
6. Palacios G, Oberste MS. Enterovirus as agents of emerging infectious diseases. J. Neurol., 2005, 11: 424-433.
7. Kew OM, Nottay BK, Hatch MN et al. Oligonucleotide fingerprint analysis of enterovirus 70 isolates from the 1980 to 1981 pandemic of acute hemorrhagic conjunctivitis: evidence for a close genetic relationship among Asian and American strains. Infect. Immun., 1983, 41: 631-635.
8. Kono R, Sasagawa A, Ishii K et al. Pandemic of new type of conjunctivitis. Lancet, 1972, 1: 1191-1194.
9. Wadia NH, Wadia PN, Katzak SM et al. A study of the neurological disorder associated with acute haemorrhagic conjunctivitis due to enterovirus 70. J. Neurol.Neurosurg. Psychiatry, 1983, 46: 599-610.
10. Chen SC, Chang HL, Yan TR et al. An eightyear study of epidemiologic features of enterovirus 71 infection in Taiwan. Am. J. Trop.Med. Hyg.,
2007, 77: 188-191.
11. Ho M, Chen ER, Hsu K et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan. Taiwan Enterovirus Epid. Work. Group. N. Engl. J. Med., 1999, 341: 929-935.
12. Huang CC, Liu CC, Chang YC et al. Neurologic complications in children with enterovirus 71 infection. N. Engl. J. Med., 1999, 341: 936-942.
13. Yang F, Ren L, Xiong Z et al. Enterovirus 71 outbreak in the Peopl's Republic of China in 2008. J. Clin. Microbiol., 2009, 47: 2351-2352.
14. Yu H, Chen W, Chang H et al. Genetic analysis of the VP1 region of enterovirus 71 reveals the emergence of genotype A in central China in
2008. Virus Genes., 2010, 41: 1-4.
15. Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровиру-сами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. ВОЗ. Женева. 2005.
16. Морозова Н.С., Чернявская О.П., Ясинский А.А., Воронцова Т.В. Эпидемиологический надзор за энтеровирусной (неполио) инфекцией в Российской Федерации. Медицинская вирусология, 2009. XXVI: 37-38.
17. Морозова Н.С., Чернявская О.П., Михайлова Ю.М. и др. Энтерови-русная (неполио) инфекция в Российской Федерации в сезон 2013 года. ЗНиСО, 2014, 10(259): 34-37.
18. Melnick JL, Rennick V, Hampil B et al. Lyophilized combination pools of enterovirus equine antisera: preparation and test procedures for the identification of field strains of 42 tnteroviruses. Bull. Wld. Hlth Org., 1973, 48: 263-268.
19. Гутман Н.Р., Менткевич Л.М., Кропотова Н.С. и др. Экспериментальные данные по получению диагностических сывороток к некоторым вирусам кишечной группы. Научные основы производства полиоми-елитной вакцины. Труды института препаратов против полиомиелита. 1959: 293-301.
20. Суптель Е.А. К методике выделения и идентификации вирусов Коксаки. Сб. Вакцины и сыворотки. Материалы по производству. 1970. 13: 75-80
21. Козлов В.Г. Научно-методические и экспериментальные основы усовершенствования производства энтеровирусных диагностических сывороток. Медицинская вирусология, 2009, XXVI: 31-33.
22. Козлов В.Г. Поликлональные энтеровирусные диагностические сыворотки нового поколения. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2014, 3: 51-56.
23. National Foundation for Infantile Paralysis. Preparation and use of ECHO virus rabbit antisera for types 1 to 14 and Coxsackie virus antisera for types B1 to B5 and A9, prepared by Microbiological Associations Inc. 1957.
24. Козлов В.Г., Викторова Е.Г. Оценка эффективности и реактогенно-сти эмульсионных адъювантных систем при изготовлении поликло-нальных энтеровирусных диагностических сывороток. Вопросы вирусологии, 2011, 2: 41-46.
25. Козлов В.Г., Ожерелков С.В., Санин А.В., Кожевникова Т.Н. Адъюван-ты в современной медицине и ветеринарии. ЖМЭИ, 2014, 1: 91-101.
26. Козлов В.Г., Викторова Е.Г., Набатников П.А. Цитотоксические свойства кроличьих энтеровирусных диагностических сывороток. Особенности и локализация. Вопросы вирусологии, 2009, 1: 22-27.
27. McNabb TM, Koh TY, Dorrington KJ, Painter RH. Structure and function of immunoglobulin domains. V. Binding of immunoglobulin G on fragments to placental membrane preparations. J. Immunol., 1976, 117: 882-888.
28. Козлов В.Г., Ивин Ю.Ю., Грачев В.П. Применение человеческой плаценты для очистки нормальных и иммунных сывороток животных. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2015, 20(5): 48-51.
