CC BY
119
УДК 616.018.74-008.6-085
ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ НЕСЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИТОРААРГИНАЗЫ L-НОРВАЛИНА И ИНГИБИТОРА ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ-5 ТАДАЛАФИЛА
Э.Н.ДУДИНА1 Т.Г. ПОКРОВСКАЯ2 Е.А. КОНОВАЛОВА1 К.В. САРОЯН2 М.В.СЫТНИК2 С.А. ЛОСЕНОК1 Т.В. ОСТАШКО2 С.В. ХОДОВ1 ИМ. КОЛЕСНИК1
х) Курский государственный медицинский университет
2) Белгородский государственный национальный исследовательский университет
e-mail: dudina.ele@yandex.ru
Коррекция эндотелиальной дисфункции при сердечно-сосудистой патологии сегодня является одним из наиболее перспективных направлений, определяющих вероятность развития сосудистых осложнений и способствующих улучшению прогноза в целом [4]. В патогенезе и клинике артериальной гипертонии, ишемической болезни сердца, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия [6].
Здоровый эндотелий обладает целым рядом разнообразных функций, однако в современной научной литературепод эндотелиальной дисфункцией понимают нарушение баланса между выделяемыми эндотелиальными клетками вазодилаторами и вазоконстрикторами с преобладанием последних [3].
Ведущую роль в развитии эндотелиальной дисфункции играет снижение синтеза и биодоступности оксида азота N0, который обладает не только вазодилатирующим действием, но также является дезагрегантом, угнетает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов и препятствует выделению тканевых факторов, повышающих вероятность тромбообразования, что позволяет рассматривать его в качестве основного антиатерогенного медиатора [1]. Оксид азота также является и основным медиатором эрекции, в процессе развития которой его действие приводит к расслаблению гладкомышечных клеток кавернозных тел, что обеспечивает резкое усиление притока к ним артериальной крови.
Развитие эндотелиальной дисфункции нарушает этот процесс, препятствуя достижению достаточного уровня артериального кровотока в кавернозных телах, что приводит к развитию артериогенной эректильной дисфункции [2]. Эндотелиальная дисфункция в настоящее время рассматривается в качестве ранней, потенциально обратимой стадии атеросклеротического процесса. Таким образом, на уровне полового члена эндотелиальная дисфункция приводит к развитию эректильной дисфункции, а в коронарных сосудах - к развитию ишемической болезни сердца. Это определяет значение эректильной дисфункции в качестве раннего проявления системного сосудистого поражения.
Тадалафил является наиболее перспективным и наименее изученным селективным конкурентным ингибитором фосфодиэстеразы-5 (ФДЭ-5), который, препятствуя разрушению цГМФ, усиливает сосудорасширяющий эффект оксида азота, тем самым может улучшать состояние эндотелиальной функции сосудов.
В результате исследования было показано, что сочетанное применение неселективного ингибитора аргиназы L-норвалина и ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила оказывает выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции.
Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция,
L-норвалин, ингибитор фосфодиэстеразы-5 тадалафил .
ЕИШ
Оксид азота образуется из аминокислоты L-аргинина. Метаболизм L-аргинина в клетках протекает по двум путям [7]. L-аргинин посредством аргиназы гидролизуется в орнитин и мочевину. Другой путь превращения L-аргинина - в оксид азота и цитрулин -катализируется NO-синтазой. Ферменты аргиназа и NO-синтаза конкурируют между собой за общий субстрат L-аргинин [9].
Установлено, что аргиназа - фермент цикла мочевины, обладающий высокой активностью, в тысячи раз превышающей таковую у NO-синтазы [8].
Ингибиторы аргиназы - это вещества природного происхождения, механизм действия которых заключается в блокировании фермента аргиназы, а, следовательно, в нарушении превращения L-аргинина в орнитин и мочевину [10]. Вследствие этого, большее количество L-аргинина расщепляется под действием NO-синтазы с
образованием оксида азота. Тем самым, ингибиторы аргиназы предотвращают
развитие дефицита оксида азота, как одного из важнейших этиологических факторов эндотелиальной дисфункции. Ингибиторы аргиназы могут быть селективными и неселективными. Некоторые из ингибиторов аргиназы уже исследованы invitro [12]. L-норвалин - наименее изученный из неселективных ингибиторов аргиназы.
В клинической практике врач всегда имеет дело с сочетанной патологией. Нозологические формы тесно переплетены друг с другом, имеют общие
патогенетические звенья, и проблема эффективной коррекции органных нарушений требует новых методов и средств [5]. Анализ результатов действия ингибиторов ФДЭ-5 и ингибиторов аргиназы на сердечно-сосудистую систему может позволить определить качественно новые показания для применения этих препаратов.
Если учесть, что многие из традиционных гипотензивных препаратов (диуретики, адреноблокаторы) сами снижают потенцию, исследование
эндотелиопротективных свойств блокатора фосфодиэстеразы-5 тадалафила и его сочетания с ингибитором аргиназы L-норвалином представляется актуальным.
Цель исследования: изучение эндотелиотропных эффектов сочетанного использования ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила и ингибитора аргиназы L-норвалина.
Материалы и методы. Опыты проводили на самцах белых крыс линии Вистар массой 250±50 г. Для моделирования эндотелиальной дисфункции внутрибрюшинно вводился блокатор NO-синтазы ^нитро^-аргинин метиловый эфир^-NAME) в дозе 25 мг/кг/сут в течение 7 дней.
На 8-й день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД). Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену. Показатели гемодинамики - систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) - измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы “Biopac”. Помимо измерения АД проводили ряд функциональных тестов с последующей оценкой изменения параметров гемодинамики (САД, ДАД, ЧСС) в ответ на внутривенное введение раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного (ЭЗВД) [3, 5], а также изменения параметров гемодинамики в ответ на внутривенное введение раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г массы тела животного (ЭНВД) [3,1].
Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющему собой отношение площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП-эндотелий независимой вазодилатации (ЭНВД) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ-эндотелий зависимой вазодилатации (ЭЗВД) [3,5].
Биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции служили TotalNO (NOx) и концентрация С-реактивного белка (СРБ). Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.
Уровень С-реактивного белка определяли иммунотурбидиметрическим методом измерения при длине волны 340 нм, с использованием нелинейной калибровки при
помощи реагентов «Human» (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе «Виталаб Флексор».
Экспериментальные животные были разделены на группы (n=lo): I- интактные; II- с введением L-NAME; III- на фоне L-NAME введение L-норвалина в дозе 10 мг/кг в виде водного раствора внутрижелудочно через зонд однократно в сутки в течение 7 дней; IV- с введением на фоне L-NAME тадалафила в виде водного раствора в дозе 0,09 мг/кг ежедневно один раз в сутки внутрижелудочно через зонд; V- с введением на фоне L-NAME комбинации L-норвалина и тадалафила в дозе 10 мг/кг и 0,09мг/кг соответственно внутрижелудочно, один раз в сутки в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME.
Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе MicrosoftExcel версии 10.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (M) показателей и ошибки среднего (m) в каждой группе животных; данные в тексте и таблицах представлены в виде M±m. «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними путем вычисления вероятности возможной ошибки (p). Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего p<0,05.
Результаты. Влияние L-норвалина и тадалафила, а также их сочетанного применения в дозах 10 мг/кг и 0,09 мг/кг соответственно на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс с моделированием L-NAME-инду-цированной патологии представлены в табл.
Таблица
Изменение показателей гемодинамики и функциональных проб при применении комбинации тадалафила (0,09 мг/кг) с L-норвалином (10 мг/кг) на фоне моделирования L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции (M±m, n=10)
Группы животных Функциональная проба САД мм рт. ст. ДАД мм рт. ст. ЧСС уд/мип. S (усл. ед.) КЭД
Интактные Исходные 137,7±3,7 101,9±4,3 453,8±11,6 1,1±0,1
АХ 84,3±4,5 38,7±2,8 448,з±11,о 1268,о±74,8
НП 83,o±3,7 42,1±4,4 464,l±ll,5 1375,3±93,7
L-NAME (25 мг/кг) Исходные 190,3±6,7* 145,о±з,9* 417,2±11,7 5,4 ±0,6*
АХ 110,6±5,2* 82,8±6,6* 399,8±15,6* 695,з±87,6*
НП 88,7±4,7 50,8±4,2 40l,7±ll,8 3322,7±ll6,7*
L-NAME (25 мг/кг)+ L-норвалин (10 мг/кг) Исходные l8o±4,7* 144,6±5,1* 37l,4±ll** 2,1 ±0,2**
АХ іо6,7±4,9* 56,1±1,8** 344,2±15** 136о,6±126,9**
НП 129,з±5,1** 64,6±2,5* 358,3 ± 12** 2827,2±429,1**
L-NAME (25 мг/кг)+ тадалафил (0,09 мг/кг) Исходные 189,9 ± 8,5* 153,3 ± 6,4* 421,4±26,0 2,9 ±0,1**
АХ 103,2±4,6* 69,6±6,з* 402,1±28,4 1073,5±43,1**
НП 105,6±6,6** 58,о±1,6 429,4±42,2 3059,1±384,3*
L-NAME (25 мг/кг)+ L-норвалин (10 мг/кг)+ тадалафил (0,09 мг/кг) Исходные 174,4±10,9** 111,2±0,7** 449,1±34,8 1,8 ±0,1**
АХ 72,6±4,5** 51,5±3,2** 444,2±39,4** 1205,7±121,4**
НП 93,9±3,6 55,2±3,6 467,5±35,5** 2128,1±197,4**
Примечание: * —р<0,05 в сравнении с интактными, ** — р<0,05 в сравнении с L-NAME.
Значения показателей САД и ДАД в группе интактных животных приняты целевыми значениями артериального давления. Обнаружено, что сочетанное применение тадалафила и L-норвалина, в отличие от монотерапии этими препаратами, обладало гипотензивным эффектом, который достоверно отличался от показателей животных, получавших L-NAME. В то же время целевой уровень АД не достигнут, но значительно приближается к группе интактных животных.
Результаты функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у животных с L-NAME-индуцированной патологией на фоне введения
ЕИШ
L-норвалина (10 мг/кг) и тадалафила (0,09 мг/кг), а также их сочетанного применения позволили установить их значительный эндотелиопротективный эффект, при этом КЭД снижался до 1,8±0,1 усл. ед., что достоверно отличалось от монотерапии тадалафилом (2,9 ± 0,1 усл.ед.). Обращает на себя внимание, что это несколько лучше, чем при монотерапии L-норвалином (2,1±0,2 усл.ед.).
В сочетании с описанными сведениями о благоприятном влиянии комбинированного использования препарата ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила и ингибитора аргиназы L-норвалина на исходные цифры артериального давления полученные данные свидетельствуют об эффективности сочетанного использования тадалафила с L-норвалином для коррекции L-NAME-индуцированной патологии, что позволяло умеренно снизить значения артериального давления при эффективном снижении КЭД.
Введение блокатора эндотелиальной NO-синтазы L-NAME вызывает нарушение синтеза оксида азота, а исследуемая комбинация препаратов восстанавливает необходимый для нормального функционирования эндотелия уровень N0.
Концентрация нитрит-ионов ^0х) под влиянием комбинированного применения тадалафила с L-норвалином увеличивалась статистически достоверно до 4,8±0,2 мкМоль/л и приближалась к показателю интактных животных -7,2±0,6 мкМоль/л. Обращает на себя внимание, что L-аргинин сам значительно увеличивал концентрацию нитрит-ионов N0x до 4,7±0,3 мкМоль/л, монотерапия тадалафилом также оказалась эффективной, и значения составили 4,3±0,2 мкМоль/л. Последнее позволяет предполагать, что оба препарата оказывают влияние на предотвращение падения концентрации нитрит-ионов N0x в плазме лабораторных животных в условиях L-NAME-индуцированного дефицита N0.
В дополнение к позитивным эффектам препаратов, направленных на увеличение уровня оксида азота, нами доказана и противовоспалительная составляющая их эндотелиопротективного действия. Уровень СРБ - важнейшего регулятора иммунных и воспалительных процессов в интактной группе составлял
0,4±0,1 мг/дл. Моделирование семидневной блокады N0-синтазы привело в активации каскада воспалительной реакции и уровень СРБ вырос до 2,4±0,2 мг/дл. Терапия комбинацией обоих препаратов эффективно проявила противовоспалительный эффект, и концентрация СРБ снизилась до 0,9±0,1 мг/дл.
Обсуждение результатов. Изучение роли эндотелия в патогенезе сердечнососудистых заболеваний привело к пониманию концепции о нем как о мишени для профилактики и лечения данных патологий. Нарушение функции эндотелия, как ключевой момент в патогенезе этих заболеваний, приковывает к себе внимание ученых всего мира в течение многих лет. Причиной тому - повсеместное распространение такого рода патологий и отсутствие эффективных средств борьбы с ними.
Основной задачей нашего исследования являлось изучение возможности коррекции моделируемой дисфункции эндотелия в эксперименте комбинацией ингибитора аргиназы L-норвалином с ингибитором ФДЭ-5 тадалафилом.
Изученные нами препараты в виде монотерапии не достигали заданных значений артериального давления и, следовательно, не полностью предотвращали гипертрофию сосудистой стенки, и значит, не могут рассматриваться для лечения в виде монотерапии на модели развития L-NAME-индуцированной гипертензии.
Тот факт, что фармакологическое ингибирование активности аргиназы исправляет дефект в продукции N0 в тканях при сахарном диабете и эректильной дисфункции [11], побудил нас исследовать комбинированное воздействие на системные сердечно-сосудистые эффекты препаратов, влияющих на эректильную дисфункцию сосудистого генеза.
При комбинированном использовании исследуемых исходные цифры артериального давления при моделировании L-NAME-индуцированной артериальной гипертензии были значительно ниже, чем в группах с монотерапией тадалафилом и L-норвалина, и это дает возможность предположить, что в основе эндотелиопротективной эффективности предложенной комбинации лежит влияние на два разных патогенетических звена. С одной стороны, тадалафил, являясь
ингибитором фосфодиэстеразы-5,приводит к восстановлению функционирования адренергической системы в целом, одновременно способствует активации NO синтетазы, увеличивая синтез цГМФ и активность РЕС-1(цГМФ-зависимой протеинкиназы); а с другой - L-норвалин ингибирует фермент, разрушающий субстрат для образования оксида азота, компенсирует нарушения выработки NO в эндотелии.
Таким образом, монотерапия L-аргинином и тадалафилом по проявленным эндотелиопротективным свойствам уступала сочетанному использованию этих препаратов. Более ярко выраженные эффекты сочетанного применения исследуемых веществ связаны с кумулятивными возможностями данной комбинации. L-норвалин увеличивает доступность эндогенных запасов L-аргинина для NO-синтазы, а также повышает активность данного фермента. А введение ингибитора ФДЭ-5 регулирует сигнальные пути, ведущие к активации еNOS и активируют путь NO-цГМФ.
Исследуемая комбинация препаратов, кроме того, модифицирует воспалительные процессы, положительно влияя на сосудистый гомеостаз, что также объясняет механизм их эндотелиопротективного действия.
Таким образом, более рациональным можно считать комбинированное применение ингибитора ФДЭ-5 и ингибитора аргиназы для достижения эндотелиопротективных эффектов.
Рассмотренные выше аспекты этой проблемы могут служить основой для разработки новых профилактических и терапевтических мероприятий, а также дать перспективу их использования в качестве дополнения к существующим методам лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Выводы:
Комбинация L-норвалина в дозе 10 мг/кг и тадалафила в дозе 0,09 мг/кг на фоне L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции обладает выраженным эндотелиопротективным действием, чтовыражается в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов, существенном снижении КЭД, а также в предотвращении снижения концентрации стабильных метаболитов оксида азота.
Исследование выполнено при поддержке гранта Президента РФ № МК-905.2012.4.
Литература
1. Дисфункция эндотелия. Причины, механизмы, фармакологическая коррекция / под ред. Н.Н. Петрищева. - СПб., 2003. - 184 с.
2. Иремашвили, В.В. Значение исследования эндотелиальной функции у больных эректильной дисфункцией : дис.... канд. мед. наук: 14.00.40 / В.В. Иремашвили. - М., 2006. - 188 с.
3. Марков, Х.М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия / Х.М. Марков // Кардиология. - 2005. - Т. 45, № 12. - С. 62-80.
4. Мартынов, А.И. Дисфункция эндотелия у больных гипертонической болезнью / А.И. Мартынов, Н.Г. Аветян, Е.В. Акатова // Кардиология. - 2005. - Т. 45, № 10. - С. 101-104.
5. Микроциркуляция в кардиологии / под ред. В.И. Маколкина. - М.: Визарт, 2004. - 136 с.
6. Намаканов, Б.А. Эндотелиальная дисфункция при артериальной гипертензии -фактор риска сердечно-сосудистых осложнений / Б.А. Намаканов, М.М. Расулов // Кардиоваскуляр. терапия и профилактика. - 2005. - № 6, ч. 2. - С. 98-101.
7. Appleton, J. Arginine: clinical potential of semi-essential amino acid / J. Appleton // Altem. Med. Rev. - 2002. - Vol. 7, № 6. - Р. 512-522.
8. Arginase inhibition restores arteriolar endothelial function in Dahl rats with salt-induced hypertension / F.K. Johnson et al. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2005. - Vol. 288. -P.1057-1062.
9. Ash, D.E. Structure and function of arginases / D.E. Ash // J. Nutr. - 2004. - Vol. 134, № 10. - P. 2760-2764.
10. Inhibition of arginase activity enhances inflammation in mice withallergic airway disease, in association with increases in proteinS-nitrosylation and tyrosine nitration / K. Ckless et al. // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181, № 6. - P. 4255-4264.
НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2012. № 4 (123). Выпуск 17/1
11. Probing erectile dysfunction: S-(2-boronoethyl)-L-cysteine binds to arginase as a transition state analogue and enhances smooth muscle cell relaxation in human penile corpus cavernosum / N.N. Kim et al. //Biochemistry. - 2001. - Vol. 40. - P. 2678-2688.
12. The vascular effects of different arginase inhibitors in rat isolated aorta and mesenteric arteries / N.N. Huynh et al. // Br. J. Pharmacol. - 2009. - Vol. 156. - P. 84-93.
ENDOTHELIOPROTECTIVE EFFECT OF COMBINED USE OF NON-SELECTIVE INHIBITOR ARGINASE L-NORVALINE AND INHIBITOR PHOSPHODIESTERASE-5 TADALAFIL
E.N. DUDINA1 T.G. POKROVSKAYA2 E.A. KONOVALOVA1 K.V. SAROYAN2 M.V.SYTNIK2 S.A. LOSENOK1 T.V. OSTASHKO2 S.V. HODOV1 I.M. KOLESNIK1
1) Kursk State Medical University
2) BelgorodNational Resea^h University
e-mail: dudina.ele@yandex.ru
As a result of research it has been shown, that the combined application of non-selective inhibitor of arginase L-norvaline and inhibitor phosphodiesterase-5 tadalafil expressedendothe- lioprotective action on model of L-NAME-induceddeficiency NO that was expressed in prevalence endothelium dependent relaxations of vessels and decreasing of the coefficient of endothelial dysfunction.
Key words: endothelial dysfunction, L-norvaline, inhibitor phosphodiesterase-5 tadalafil.
