CC BY
168
вают технологические параметры (порядок смешивания компонентов, особенности процессов грануляции, влажность гранулята, время смешивания и сушки, давление прессования) и др.
С помощью метода «тест растворения» обоснована возможность получение таблеток препарата лоратадина, методом прямого прессования, подобран оптимальный состав вспомогательных веществ, обеспечивающий переход в раствор через 45 мин не менее 75% лоратадина, что позволило ввести эту норму в проект ФСП на таблетки лоратадина. Концентрация лоратадина (нг/мл) в сыворотке крови кроликов при приеме сравниваемых лекарственных форм представлена в табл. 1. Для количественного определения лоратадина использовали метод ВЭЖХ [3, 4, 5]. Рассчитаны средние значения, стандартные отклонения и доверительные интервалы (а=0,05).
В табл. 2 приведены рассчитанные по полученным кривым основные фармакокинетические параметры Стах, Ттах, ЛиС(о-да), Т1/2, кеі и отношение Стах/ЛиС(о-да), отражающие степень, скорость всасывания и элиминацию лоратадина.
Таблица 2
Значения основных фармакокинетических параметров лоратадина после однократного перорального введения кроликам в дозе 3,7 мг/кг
№ кролика T1/2 Cmax Tmai kel AUC(o-œ) С^/ AUCri-m)
Лоратадин ООО «AHKИTAФAPM», Россия
1 2,1048 43,15 1 0,3293 117,2511 0,3680
2 2,0441 101,72 1 0,3391 244,3588 0,4163
3 2,1950 46,84 1 0,3158 133,5735 0,3507
4 1,9652 114,13 1 0,3527 287,7886 0,3966
5 2,1007 63,03 1 0,3300 158,1874 0,3985
6 1,9932 109,21 1 0,3478 264,1125 0,4135
Среднее 2,0672 79,68 1 0,3358 200,8787 0,3967
Стандартное отклонение 0,0767 29,54 0 0,0124 66,8188 0,0238
Доверит. интервал 0,0614 23,63 0,0099 53,4651 0,0190
картин
1 2,1632 67,61 1 0,3204 169,8875 0,3980
2 2,0291 89,47 1 0,3416 221,4476 0,4040
3 2,1124 70,26 1 0,3281 191,9470 0,3660
4 1,9970 116,36 1 0,3471 301,0279 0,3865
5 2,0523 82,75 1 0,3377 208,0444 0,3978
6 2,0427 94,60 1 0,3393 236,1280 0,4006
Среднее 2,0661 86,84 1 0,3357 221,4137 0,3922
Стандартное отклонение 0,0555 16,33 0 0,0089 41,3459 0,0129
Доверительный интервал 0,0444 13,07 0,0071 33,0830 0,0103
Из приведенных в табл. 2 данных, показывающих динамику изменения концентрации лоратадина в сыворотке крови кроликов после приема обеих лекарственных форм в дозе 3,7 мг/кг, следует, что зависимость концентрации лоратадина в крови кроликов после введения разработанного препарата и «Кларитин» носит аналогичный характер. Оценку относительной биодоступности разработанной лекарственной формы лоратадина проводили путем сравнения значений максимальной концентрации (Стах), времени ее достижения (Ттах), периода полуэлиминации (Т1/2), площади под фармакокинетической кривой (АиСооо) и отношения Стах/АиСо-оо. Максимальная концентрация Стах достигается через ~ 1 час после введения препаратов и составляет 79,68±23,63 нг/мл для изучаемого препарата и 86,84±13,07 нг/мл для препарата сравнения. Время достижения максимальной концентрации Ттах для обоих препаратов составляет 1 час.
Таблица 3
Параметры оценки биоэквивалентности изучаемых лекарственных препаратов лоратадина
№ кролика f = auca/ auc
1 0,6382 0,6902
2 1,1369 1,1035
3 0,6667 0,6959
4 0,9808 0,9560
5 0,7617 0,7604
6 1,1544 1,1185
Среднее 0,8898 0,8874
Стандартное отклонение 0,2117 0,1810
Доверительный интервал 0,1694 0,1448
где А - таблетки «Лоратадин»; Б - таблетки «Кларитин»
Период полуэлиминации Т1/2 после введения изучаемого препарата данный параметр составил 2,0672±0,0614 ч, после введения препарата сравнения - 2,0661±0,0444 ч. Площадь под фармакокинетической кривой АИС0-оо для изучаемого препарата равна 200,8787±53,4651 нг-ч/мл, для препарата сравнения 221,4137±33,0830 нг*ч/мл. Отношение Стах/АИС0-оо составило
0,3967±0,0190 и 0,3922±0,0103 для изучаемого препарата и пре-
парата сравнения соответственно. Из вышеприведенных результатов видно, что перечисленные фармакокинетические параметры не имеют между собой достоверных отличий.
В табл. 3 приведены параметры f ' и f ", позволяющие оценить биоэквивалентность изучаемых лекарственных препаратов лоратадина.Средние величины f (88,98%) и f (88,74%) укладываются в пределы 80-125%, а различия между Cmax/AUC(o.») для сравниваемых препаратов (табл. 3) при p>0,95 недостоверны. Таким образом, можно сделать вывод, что таблетки лоратадина (ООО «АНКИТАФАРМ», Россия) и таблетки «Кларитин» («Schering-Plough Labo N.V.», Бельгия) биоэквивалентны.
Выводы. На основании проведенных исследований обоснована технология таблеток лоратадина методом прямого прессования, подобран оптимальный состав вспомогательных веществ, установлены нормы качества таблеток лоратадина, которые включены в проект ФСП. Проведенное на кроликах исследование сравнительной фармакокинетики и относительной биодоступности лекарственных форм лоратадина (таблетки по 0,01 г) показало, что процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения лоратадина при применении таблеток лоратадина (ООО «АНКИТАФАРМ», Россия) и таблеток «Кларитин» («Schering-Plough Labo N.V.», Бельгия) одинаковы и лекарственные формы являются биоэквивалентными.
Литературы
1.Алексеева, С.К. /С.К. Алексеева, С.Н. Суслина, И.А. Зимина // «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)»: тез. научно-практ. конф., Ростов-на-Дону, 2006. С. 80.
2.Езерский, М.Л. Методы определения технологических характеристик фармацевтических порошков. Насыпной вес, объемная плотность, сыпучесть, угол откоса, слипаемость, сопротивление сдвигу // Хим.-фармац. ж. 1977. Т. 11 № 8. С. 98-114.
3.Kunicki, P.K. Determination of loratadine in human plasma by high-performance liquid chromatographic method with ultraviolet detection / P.K. Kunicki // Chromatogr. B. Biomed. Sc.i App. l 2001. May 755:331-5.
4.Hilbert, J Pharmacokinetics and dose proportionality of loratadine / J. Hilbert, E. Radwanski, R. Weglein // J. Clin. Pharmacol. 1987. Sep 27:694-8.
5.Matzke, G.R. / G.R. Matzke, C.E. Halstenson, J.A. Opsahl // J. Clin. Pharmacol. 1990. Apr 30:364-71.
УДК 618.19-005-1; 612.662;611.664
ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЕНСТРУАЛЬНОЙ КРОВИ И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ
А.А. ХАДАРЦЕВ, Д.В. ИВАНОВ, Э.М. НАУМОВА, Д.А. ХАСАЯ*
Ключевые слова: эндометриальные стволовые клетки
Стволовые клетки (СК) - это недифференцированные клетки, которые могут делиться и размножаться, сохраняя недифференцированный статус, и смогут впоследствии дифференцироваться в специализированные клетки тканей. Впервые термин СК применил в 1909 г. российский ученый А.А. Максимов, предположивший, что все форменные элементы крови происходят от единой клетки-предшественника [31]. Исследования в этом направлении привели в середине 20 века к экспериментальному обнаружению в костном мозге гемопоэтических СК. Затем в клиническую практику была внедрена пересадка костного мозга доноров для лечения гематологических заболеваний.
Дальнейшие исследования показали, что СК присутствуют практически во всех органах и тканях взрослых млекопитающих и служат резервом для регенерации тканей в случае их повреждения. Наибольший интерес для применения в медицине представляют эмбриональные, гемопоэтические и мезенхимальные СК.
Эмбриональные СК (ЭСК), способны к практически бесконечному существованию ex vivo в специальных условиях без потери качества [53]. Для поддержания в недифференцированном состоянии ЭСК экспрессируют специфические факторы транскрипции Oct-3/4 [38-40, 59] Дех-1 [32], Nanog [10] и Sox-2 [39, 59]. Являясь тоти- и плюрипотентными, ЭСК способны к спон-
* ГОУ ВПО « Tульский государственный университет»
танной и индуцируемой дифференцировке в производные всех трёх зародышевых листков. Но их использование сопряжено с рядом технических и этических трудностей, которые, по состоянию на 2009 год остаются в значительной мере неразрешёнными.
Взрослые (неэмбриональные) СК, к которым относятся ге-мопоэтические (ГСК), мезенхимальные (МСК), нейральные, миогенные и ряд других, в сравнении с ЭСК обладают ограниченным сроком дееспособности ex vivo и суженными возможностями дифференцировки. Взрослым СК свойственна тканеспецифичная дифференцировка, но возможно они под действием направляющих факторов способны к дифференцировке в «неродственные» типы клеток - трансдифференцировке [37].
Поскольку взрослые СК являются недифференцированными клетками, их морфологическая идентификация затруднена. Фракционирование взрослых СК базируется на их множественной лекарственной резистентности и осуществляется с помощью проточной цитофлуометрии. Взрослые СК, но не их потомки и дифференцированные клетки, экспрессируют белки ABC/MDR, которые препятствуют включению в клетку интравитальных красителей (родамин-123, Hoechst 33342). Маркеры, которые несут многие взрослые СК, не являются уникальными, и не позволяют выделить чистую культуру. Но они могут быть использованы для получения обогащенных популяций взрослых СК. На большинстве ГСК представлен антиген CD34, на МСК -Stro-1, в цитоплазме нейральных СК - нестин. В обогащенной популяции взрослых СК присутствуют и их ранние коммитиро-ванные потомки - прогениторные клетки. Выбор направления дифференцировки СК зависит от факторов индуцирующего микроокружения. В системе in vitro при использовании линиеспецифических индукторов (цитокины, моделируемый внеклеточный матрикс) удается получить специализированные соматические клетки заданной линии дифференцировки [2].
Несмотря на наличие доступа к ЭСК, многие лаборатории выбрали изучение взрослых СК не столько по этическим соображениям, сколько из-за практических аспектов и требований повседневного прогресса, необходимого для развития клеточной терапии. Исходя из относительной простоты изоляции, потенциала экспансии, стабильного фенотипа, транспортабельности, предпочтительными для использования в регенеративной медицине оказались МСК. Это ускорило изучение взаимодействия аллогеных МСК с иммунной системой хозяина, а также возможностей использования МСК в клинической практике [7].
К значимым ограничениям широкого использования МСК можно отнести необходимость получения для нужд терапии значительного числа клеток, и желательность их получения как можно менее инвазивным способом. Оба препятствия казались практически непреодолимыми, до тех пор, пока сразу несколько групп исследователей не обратило внимания на возможность получения СК из менструальной крови. Открытие было основано на предположении, что СК могут присутствовать в менструальной крови, так как они были ранее обнаружены в эндометрии [11, 13, 16, 50]. Эндометрий матки человека содержит эндометриальный слизистый слой, который относится к высоко регенерирующим тканям, и располагается на плотном миометрии. Эндометри-ально-миометриальное сочленение достаточно неравномерное и не имеет подслизистого слоя, отделяющего эндометриальную железистую ткань от находящихся ниже гладкомышечных клеток миометрия [56]. Эндометрий и субэндометриальный миометрий происходят из Мюллеровских желез во время эмбриогенеза, в то время как слои миометрия происходят во время фетального периода и развиваются из других источников [41, 56]. Эндометрий подразделяется структурно и функционально на две главные зоны, где верхняя, или функциональная, содержит железы, распространяющиеся от поверхности эпителия и поддерживающиеся стромой, и нижняя или базальная состоящая из базального слоя желез, плотной стромы и лимфоидных агрегатов [42, 45, 51, 56]. Обе зоны как функциональная, так и базальная в дальнейшем подразделяются на два морфологически разных слоя [4, 27, 33, 45], хотя другие исследователи считают различие между 4 слоями менее очевидным и предпочитают концепцию поляризации микроокружения [52, 56]. Клеточный состав эндометрия включает в себя люминальный и железистый эпителий, стромальные фибробласты, эндотелиоциты и лейкоциты. Эндометрий человека проходит более чем 400 циклов регенерации, дифференциации и отторжения за время репродуктивного периода [21, 26, 33]. Каждый месяц 4-7 мм слизистой ткани вырастает в течение 4-10
дней в первой половине пролиферативной стадии менструального цикла [33]. Важно отметить, что концепция регенерации эндометрия подтверждается расположением СК именно в базальном эндометрии, что было установлено много лет назад [43, 45, 48]. При изучении пролиферации эндометриальных клеток были обнаружены зональные различия, которые показали постепенное замещение эпителиальных и стромальных клеток прогениторны-ми СК, располагающимися в базальном эпителии в области эндометриально-миометриального соединения [14, 17, 42, 44]. Позже был установлен дисбаланс между индексом пролиферации эндометриальных желез в базальном и функциональном слоях во время пролиферативной и секреторной фаз цикла у макак при использовании фосфорилированного гистона Н3, как пролиферирующего маркера [8]. Такой уровень тканевого новообразования сопоставим с клеточным возобновлением в высокорегенерирую-щих тканях, таких как кроветворные ткани костного мозга, эпидермис, эпителий кишечника, где взрослые СК замещают выбывающие клетки для сохранения тканевого гомеостаза [18, 29]. Дальнейшие косвенные доказательства существования эндометриальных стволовых/прогениторных клеток представлены в результатах экспериментальных исследований приматов, и в клинических исследований, когда эндометрий полностью восстанавливался и функционировал во время беременности после почти полностью удаленного эндометриального слоя [23, 58]. В других клинических исследованиях установлено наличие регенерирующих эндометриальных слоев у женщин после электрохирургической абляции, применявшейся для лечения меноррагии [55], и даже возникновение беременности [3]. Клинические исследования подтверждают присутствие взрослых СК в эндометрии. Эти утверждения основаны на получении оссификатов после беременности и источником оссификатов являются не фетальные ткани, а хроническое воспаление и травма [5]. Именно воспаление и травма активизируют включение МСК в регенерацию тканей [62]. Кроме того, такие ткани как гладкая мускулатура, кости и хрящи - также обнаруживаются в эндометрии [6, 32, 49].
Более поздние работы свидетельствуют о возможности изолировать из эндометрия и культивировать 2 типа клеток: эпителиальные прогениторы и МСК [19]. Также сообщается о маркере плюрипотентности Oct-4 (POU5F1), обнаруженном в некоторых клетках стромы человеческого эндометрия [30]. Поскольку СК были обнаружены в эндометрии, возникло предположение, что они также могут быть обнаружены в отторгаемом вместе с менструальной кровью эндометрии. Но при изучении СК, выделенных из менструальной крови (МенСК), оказалось, что они представляют собой неоднородную группу клеток, и некоторые субпопуляции, отличающиеся от СК, полученных из интактного эндометрия, а также от МСК. Опубликованные в 2007-2008 году работы Cui et al. (2007), Meng et al. (2007), Patel et al. (2008), Р.А. Мусина и соавт. (2008), A. Umezawa, H. Makino (2008), N. Hida (2008) положили начало новому направлению в получении и использовании СК в терапевтических целях.
Следует отметить, что ещё 2004 году заявку на выданный в 2006 году патент «Стволовые клетки, полученные из отслоившегося при менструации эндометрия, способ их получения и применение» подала группа российских учёных [2]. Изобретение предусматривает применение отслоившегося при менструации эндометрия для получения СК, т.е. описывает новый источник и способ получения СК из отслоившегося при менструации эндометрия. Согласно изобретению, СК «полученные из отслоившегося при менструации эндометрия, могут быть использованы в косметологии, например для общего омоложения организма, омоложения кожи, лечения и/или укрепления волос; в стоматологии, например для лечения и/или укрепления десен и/или лечения и/или коррекции зубов; в травматологии, например в терапии ожогов, ран, повреждений кожи и/или переломов; и в терапии дегенеративных заболеваний, например невралгии, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, ишемической болезни сердца или конечностей, воспалительных заболеваний и заболеваний кожи, а также для создания банка стволовых клеток».
Но текст данного документа в широкой печати не публиковался. Первыми представили работу, описывающую выделение клеток эндометрия из менструальной крови, Cui et al. (2007). Причём в этом исследовании процедура получения МенСК носила сугубо прикладной характер: авторы просто использовали этот метод для получения МСК эндометрия, опираясь на общеизвестный факт, что в менструальной крови содержатся клетки оттор-
гающегося эндометрия. Сама работа посвящалась изучению возможности экспрессии человеческого дистрофина. Они успешно культивировали множество первичных клеток, изолированных из менструальной крови, и обнаружили как минимум 2 морфологически разные группы: маленькие веретенообразные клетки и большие палочкообразные. Профиль маркеров МенСК, обнаруженных авторами, представлен в табл. 1.
Таблица 1
Профиль маркеров менструальных стволовых клеток
Surface ЕМ-Е6/Е7/ Menstrual Surface ЕМ-ЕЄ/Е7/ Menstrual
marker hTERT-2 cells blood cells marker hTERT-2 cells blood cells
CD13 + ++ CD55 ++ ++
CD14 CD59 t+
CD29 +4 4-М- CD73 •H-f +
CD31 CD90 ++ ■m
CD34 CD105 ++
CD44 ♦♦♦ 4-й- c-kit
CD4d * CD133
CD50 - HLA-ABC ++ ++
CD54 + 44 HLA-DR
Уникальный фенотип МенСК был связан с гистологическими и эмбриологическими отличиями эндометрия [15].
Таблица 2
Фенотипическая характеристика эндометриальных клеток
Маркер Значимость Экспрессия
CD14 Маркер моноцитов Negative
CD34 Маркер гемопоэтических стволовых клеток Negative
CD38 Маркер дифференцирующихся стволовых гемопоэтических клеток Negative
CD45 Маркер лейкоцитов Negative
CD133 Гемопоэтический/ангиобластный маркер Negative
STRO-1 Маркер мезенхимальных стволовых клеток Negative
SSEA-4 Маркер эмбриональных стволовых клеток Negative
Nanog Маркер эмбриональных стволовых клеток Negative
CD9 Маркер МСК, ассоциированный с ангиогенезом [28] Positive
CD29 Молекула адгезии на мезенхимальных и стволовых клетках печени [ 12] Positive
CD59 Белок ингибирующий комплемент, обнаруживается на МСК [25] и стволовых гемопоэтических клетках 8Р-популяции костного мозга [47] Positive
CD73 Экто-5'-нуклеотидаза, вовлеченная в миграцию МСК Positive
CD41a Рецептор для фибриногена, обнаруженный на МСК и тромбоцитах Positive
CD44 Рецептор гиалуроновой кислот, обнаруженный на тканевых стволовых клетках и МСК Positive
CD90 Маркер Т-клеток, гемопоэтических и МСК Positive
CD105 Маркер МСК Positive
Oct-4 Маркер эмбриональных стволовых клеток Positive
Meng et al. (2007) выделяли из менструальной крови моно-нуклеарные клетки и изучали субпопуляцию прилипающих клеток. Выделенные клетки оказались способны выдерживать в тканевой культуре более 68 удвоений без нарушений кариотипа. Индекс пролиферации был значительно выше, чем у контрольной культуры МСК пуповинной крови, удвоение после 20 удвоений наступало каждые 19,4 часа, в сравнении с 1,5-2 сутками у двух контрольных линий пуповинной крови. Была обнаружена способность выделенных СК дифференцироваться в клетки 9 линий всех трех зародышевых листков: мезодермальные - миоциты, остеоциты, эндотелий, адипоциты, кардиомиоциты; эктодермальные - нейрональные клетки; и эндодермальные - гепатоци-ты, панкреатические клетки, клетки дыхательного эпителия. Дифференцировка была подтверждена иммуногистохимически: образовавшиеся тканевые клетки экспрессировали соответствующие этим тканям маркеры. Клетки, находившиеся в контрольной среде, без дополнительной стимуляции, не экспрессировали маркеры дифференциации.
После 68 удвоений клетки сохраняли способность продуцировать присущий им ряд маркеров (табл. 2). Полученные клетки продуцировали MMP3, MMP10, GM-CSF,, angiopoetin-2, и
РПОЕ-ББ й 10-100000 раз больше, чем 2 контрольные линии МСК пуповинной крови.
Таблица 3
Характеристика секреции протеинов эндометриальными регенеративными клетками
Factor BioE* MYZb** ERC-1 ERC-2
MMP3 0# 0 106227 234638
MMP10 0 0 5250 8944
GM-CSF 0 452 15630 972
PDGF-BB 0 0 12 61
ANG-2 0 0 11 34
Примечание: # - все концентрации даны в пикограммах на миллион клеток; * - коммерческая контрольная линия; ** - контрольная линия, выделенная авторами.
Обнаружены следующие особенности СК, выделенных из менструальной крови: высокий индекс пролиферации в сравнении с контрольными линиями МСК пуповинной крови; отсутствие способности экспрессии маркера МСК STRO-1; способность к экспрессии маркера ЭСК Oct-4; высокая экспрессия матричных металлопротеаз. Выделенные клетки не экспрессируют свойственные эндометриальным СК маркеры CD34 и CD45. Patel et al. (2008) также обнаружили высокую скорость удвоения МенСК, которая составляла 24-36 часов. Из начальных 50 000 клеток за 26 дней было получено 48 000 000 клеток. Клетки оставались диплоидными, без хромосомных аберраций, как было установлено при определении кариотипа на 12 пассаже. Более того, RT-PCR анализ показал, что МенСК на 12 пассаже экспрессируют мультипотентный маркер Oct-4, но не SOX-2 или Nanong.
Полученные группой Patel данные об экспрессии маркеров принципиально различаются от данных, опубликованными группами Cui и Meng по позитивной реакции на экспрессию плюри-потентного маркера SSEA-4 и c-kit (CD 117), которые также были колокализованы на изолированном клоне МенСК. Была обнаружена экспрессия маркеров CD 166, CD49f MHC I, и умеренная экспрессия CXCR4, ответственного за хоуминг СК. Негативная реакция отмечена на маркеры MHC II и LIN.
МенСК, исследованные группой Patel, дифференцировались в клеточные линии: мезодермальные - адипоциты, хондро-циты, остеоциты, кардиомиоциты; эктодермальные - олигодендроглия, астроциты. МенСК сохраняли более чем 50% теломераз-ной активности даже на 12 пассаже при сравнении с ЭСК, что выше, чем у МСК дериватов костного мозга. Группой Meng теломеразная активность не изучалась. МенСК, выделенные группой Patel, имели сходные характеристики с СК человеческого эндометрия по ряду показателей: экспрессии c-kit (CD117) [13], по экспрессии Oct-4 [30], по клональному размножению [20], а также с СК эндометрия мышей по c-kit (CD117) и Oct-4 [9]. Авторы придерживаются версии о происхождении МенСК из СК эндометрия. Наличие эмбриональных маркеров SSEA-4 и Oct-4 объясняет высокую скорости размножения этих клеток.
Р.А. Мусина и соавт. (2008) отнесли выделенные МенСК по экспрессируемым маркерам, потенциалу дифференциации и морфологическим признакам к МСК, отметив при этом в качестве особенных признаков высокую клоногенную активность и низкую способность к дифференцировке в адипоциты. А. Umezava and Н. Makino (2008) на основании собственных исследований относят менструальную кровь к источникам получения МСК. Несмотря на относительно недавнюю историю обнаружения МенСК, уже появились попытки изучения их практического использования. Сш et al. (2007) в той же публикации, которая открыла тему изучения менструальной крови как источника СК, исследовали предполагаемые эндометриальные прогениторы, полученные из образцов эндометриальной ткани, на предмет восполнения мышечной дегенерации у мышей с mdx-моделью миопатии Дюшенна. По замыслу авторов, имплантированные клетки должны были предоставлять человеческий дистрофин в дегенеративные мышцы иммунодефицитных mdx-мышей. Авторы изучили извлечённые из менструальной крови клетки, чтобы установить, могут ли первично культивированные нетрансфор-мированные клетки также восполнить дистрофичные мышцы. In vivo перенос извлечённых из менструальной крови клеток в дистрофичные мышцы иммунодефицитных mdx-мышей восстанавливал экспрессию дистрофина сарколеммой. Имплантируемые клетки были помечены enhanced-green-флуоресцентным белком и раздельное состояние человеческих и мышиных ядер заставляло предположить, что человеческий дистрофин экспрес-
сируется благодаря слиянию миоцитов хозяина и имплантированных клеток. Анализ in vitro показал, что эндометриальные прогениторные клетки и клетки, извлечённые из менструальной крови, могут эффективно трансдифференцировать в миобла-сты/миоциты, сливаясь с мышиными миобластами C2C12 при совместном культивировании in vitro и начинать экспрессировать дистрофин после слияния. На основании проведённого эксперимента авторы заключают, что эндометриальные прогениторные клетки и дериваты менструальной крови могут переносить дис-трофин в дистрофичные миоциты через слияние и трансдифференциацию in vitro и in vivo.
Toyoda et al. (2007) также обратили внимание на миогенный потенциал клеток, извлечённых из менструальной крови, отметив её высокую репликативную активность и способность трансдиф-ференцировать в миоциты с неожиданно высокой частотой. Это свойство МенСК позволяет спасать дистрофичные миоциты у мышей с wdx-моделью миопатии Дюшенна.
Murphy et al. (2008) считают аллогенные МенСК «лекарством с полки» для лечения критической ишемии нижних конечностей, опираясь на следующие свойства этих клеток: высокий уровень продукции ростовых факторов и металлопротеаз; способность ингибировать воспалительный ответ и отсутствие им-муногенности; способность к размножению без утраты способности к дифференциации и нарушения кариотипа.
Hida et al. (2008) обнаружили, что МенСК после соответствующей индукции начинают спонтанно делиться, демонстрируя кардиомиоцит-специфичное действие. Кардиальные тропонин-1-позитивные кардиомиоциты образуются in vitro в 27-32% случаев. МенСК пролиферируют в среднем 28 поколений без влияния на кардиомиогенную трансдифференцировочную способность, и экспрессируют м-РНК из GAZA-4 перед кардиомиогенной индукцией. Предполагают, что большая часть кардиомиогенных клеток МенСК происходит из отслоившихся маточных эндометриальных желез, так как МСК, полученные из моноклональных эндометриальных желез в 76-97% случаев трансдифференцируют в кардиальные клетки in vitro. МенСК были позитивны по CD29, CD105 и негативны по CD34, CD45. Трансплантированные МенСК значительно улучшали нарушенную функцию сердца, уменьшали площадь инфаркта миокарда на модели у бестимусных крыс, ткань из кардиомиоцитов МенСК наблюдалась в зоне инфаркта миокарда in vivo. Авторы делают вывод о МенСК как о новом, мощном и доступном источнике для кардиальной клеточной терапии. Han et al. (2009) изучали способность неманипулиро-ванных МенСК изменять рост глиомы, с использованием агрессивной C6/LacZ7 (C6) модели у СД-крыс. В основе идеи эксперимента были положены результаты предыдущих исследований на животных, которые показали, что избирательный тропизм МСК к глиоме может быть использован в качестве средства селективной доставки цитотоксических средств.
Эндометриальные регенеративные клетки являются популяцией клеток мезенхимального типа, которые обладают способностью к плюрипотентной дифференциации и характеризуется уникальными поверхностными маркерами и продукцией факторов роста. Эндометриальные регенеративные клетки вводили внутривенно, или внутрь опухоли. В результате показано значительное ингибирование глиомы: уменьшение объема на 49% после внутривенного введения (р < 0,05), и около 46% после введения внутрь опухоли (р < 0,05). Редукция опухоли была связана с ингибированием ангиогенеза и сокращением числа CD133 позитивных клеток в инкраниальной опухоли. Несмотря на ангиогенный потенциал МенСК в модели ишемии задней конечности, эти данные подтверждают парадоксальную способность МенСК ингибировать опухоли. Авторы считают необходимым провести дополнительные исследования для определения качественных различий между физиологическим ангиогенезом, который, как представляется, поддерживается МенСК, и ангиогенезом опухоли, который, как оказалось, ингибируется МенСК.
Наконец Zhong et al. (2009) описали 4 случая использования МенСК внутривенно и интратекально у пациентов с рассеянным склерозом. Донорами менструальной крови послужили здоровые, некурящие женщины-добровольцы 18-30 лет. Исследование проводилось в рамках начальной стадии изучения безопасности препарата. Исследование продолжалось более года, за это время не было отмечено иммунологических реакций и побочных эффектов связанных с лечением. Эти предварительные данные говорят о возможности клинического использования МенСК и
являются основанием для дальнейшего изучения этого нового типа СК. При анализе опубликованных материалов нам удалось выделить способы получения эндометриальных клеток. Так, группа австрийских ученых по руководством K.E. Schwab получала клетки эндометрия после гистерэктомии у женщин в возрасте от 31 до 52 лет. Операцию выполняли в пролиферативной фазе эндометрия, 5 мм слой эндометрия впоследствии собирался в среду, содержащую раствор Дульбеко, набор антимикотических антибиотиков, ксеногенную сыворотку. Выделение клеток проходило с использованием коллагеназы, механического расщепления и применением магнитного сортинга.
L. Lynch и его коллеги из Университетского госпиталя в Дублине получали клеточный материал с помощью кюретажа при выскабливании матки и помещением клеточного материала в среду Хенкса с антибиотиками и ксеногенной сывороткой. В лаборатории материал отмывался от резидуальной крови и размещался в р-р с энзимами на 20 мин. при 37°С. В дальнейшем материал пропускали через марлевый фильтр и повторно отмывали, причем удалось добиться получения 1млн клеток в мл.
Японские исследователи из Университета Фукуока под руководством K. Kato также получали материал из тканей матки после выполненной гистерэктомии у женщин в возрасте 37-49 лет. Клеточная суспензия была получена после механической и энзимной обработки тканей. В дальнейшем ее пропускали через марлевый фильтр и культивировали. В России группа ученых под руководством Р. А. Мусиной из НЦ акушерства, гинекологии и перинтологии РАМН, Москва, получали эндометриальные клетки инвазивным путем с помощью биопсии тканей матки. В дальнейшем выполнялись работы по культивированию клеток.
По сообщениям, R. Dimitrov из института биологии и иммунологии репродукции Болгарской Академии наук получал совместно с коллегами эндометриальные ткани после гистерэктомии у женщин в возрасте 32-52 года, выполненной по поводу аденомиоза матки, во время пролиферативной и секреторной фазы. Образцы помещались в ксеногенную сыворотку с антибиотиками и доставлялись в лабораторию, где эндометрий бережно отделялся от миометрия и разделялся механическим путем на небольшие фрагменты, которые помещались в раствор коллаге-назы и выдерживался при 37°С в течение 1 часа. В дальнейшем после фильтрации и центрифугирования начинали культуральные работы. C. Matthai и коллеги получали клеточный материал из тканей матки после гистерэктомии, выполненной у лиц в возрасте 29-51 год, в независимости от дня менструального цикла.
В своих работах S. Kyo и коллеги из Университета в Каназаве (Япония), получали эндометриальные ткани у женщин в возрасте 42-52 лет также после выполнения экстирпации матки, которая выполнялась по причине миоматозного поражения. В данном случае выполнялась операции в поздний период менструального цикла, ткани помещались в среду Дульбеко с коллагена-зой и диоксирибонуклеазой. X. Meng из института биокоммуникационных исследований (Wichita, USA) собирал у здоровых женщин во время менструального цикла эндометриальные клетки, используя урологические колпачки. Содержимое колпачка переливалось в 5 мл пробирки, содержащие антибиотики, раствор фосфатного буфера и ЭДТА. В дальнейшем клетки разделялись с помощью градиента Фиколла, затем культуральные работы выполнялись на чашках Петри, содержащих среду ДМЕМ, антибиотики, ксеногенную сыворотку. Подобную методику получения эндометриальных клеток описал и Z. Zhong из госпиталя в Changsha (Китай), у молодых здоровых женщин в возрасте 18-30 лет в условиях стационара. Стерильный специально разработанный колпачок вводился во влагалище и оставался там в течение 30-60 минут. После этого содержимое колпачка переливалось в специальный собирающий контейнер, который перемещался в стерильное помещение, где выполнялись работы по очистке и выделению клеток. В своих исследованиях авторы отмечали, что существует определенная взаимосвязь между качеством, жизнеспособностью, активностью клеток, фазой менструального цикла и возрастом женщины.
Все приведенные методы получения выполнимы в условиях стационаров и не позволяют широко тиражировать методику.
Литература
1Мусина Р.А., Де Велльен Л.А., Фелицына С.Б. Стволовые клетки, полученные из отслоившегося эндометрия, способ их получения и применения // Бюллетень ЕАПО. 2006. № 3 (заявка 2004000031 (Ru) 2004.08.11).
2.Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М. Стволовые клетки. От фундаментальных исследований к клинике // Вестник «МЕДСИ». 2008. №1. С. 38-43.
3.Abbott J.A., Garry R. The surgical management of menor-rhagia//Human Reproduction Update, 2002. Vol.8, №1 Р.68-78.
4.Biervliet et al., A successful cycle of IVF-ET after treatment of endometrial ossification; case report and review //Journal of Obstetrics and Gynaecology, Vol. 24, Issue 4 June 2004 , Р. 472-473.
5.Bird and Willis The production of smooth muscle by the endometrial stroma of the adult human uterus.// J Pathol Bacteriol 1965 Jul;90(1):75-81.
6.Bobis S., Jarocha D., Majka M. Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinical applications Folia Histochemica et citobi-ologica. 2006. Vol. 44(4). P. 215-230.
7.Brenner AV, Wang Z, Kleinerman RA, Lei S, Metayer C, Wang W, Lubin JH. .Menstrual and reproductive factors and risk of lung cancer among
Chinese women, Eastern Gansu Province, 1994-1998.//___________J Epidemiol. 2003
Jan;13(1):22-8
8.Cervello I., Martinez-Conejero J.A., Horcajadas J.A., Pellicer A., Simon C. Identification, characterization and co-localization of label-retaining cell population in mouse endometrium with typical undifferentiated markers // Hum. Reprod. 2007. Vol. 22. P. 45-51.
9.Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. Vol. 113. P. 643-655.
10. Chan R.W., Schwab K.E., Gargett C.E. Clonogenicity of Human Endometrial Epithelial and Stromal // Cells Biol Reprod. 2004 Jun. Vol. 70(6). P.1738-1750.
11.Chiba T., Zheng Y.W., Kita K., Yokosuka O., Saisho H., Onodera M., Miyoshi H., Nakano M., Zen Y., Nakanuma Y., Nakauchi H., Iwama A., Tanigu-chi H. Enhanced Self-Renewal Capability in Hepatic Stem/Progenitor Cells Drives Cancer Initiation // Gastroenterology. 2007.
12.Cho N.H., Park Y.K., Kim Y.T., Yang H., Kim S.K. Lifetime expression of stem cell markers in the uterine endometrium // Fert. and Steril. 2004. Vol. 81(2). P. 403-407.
13.Conti CJ, Gimenez-Conti IB, Conner EA, Lehman JIM, Gerschenson LE. Estrogen and progesterone regulation of proliferation, migration, and loss in different target cells of rabbit uterine epithelium.// Endocrinology. 1984 Feb;114(2):345-51.
14.Cui C.H., Uyama T., Miyado K., Terai M., Kyo S., Kiyono T., Umezawa A. Menstrual blood-derived cells confer human dystrophin expression in the murine model of Duchenne muscular dystrophy via cell fusion and myogenic transdifferentiation // Mol Biol Cell. 2007 May. Vol. 18(5). P. 1586.
15.Du H., TaylorH.S. Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis // Stem Cells. 2007. Vol. 25(8). P. 2082-2086.
16.Ferenczy A, Bertrand G, GelfandMM. Proliferation kinetics of human endometrium during the normal menstrual cycle.// Am J Obstet Gynecol. 1979 Apr 15;133(8):859-67.
17.Fuchs E., Segre J.A. Stem cells: A new lease on life // Cell. 2000. Vol. 100. P. 143-155.
18.Gargett C.E., Schwab K.E., ZillwoodRM., Nguyen H.P., Wu D. Isolation and culture of epithelial progenitors and mesenchymal stem cells from human endometrium // Biol Reprod. 2009 Jun. Vol. 80(6). P. 1136-1145.
19.Gargett C.E. Identification and characterisation of human endometrial stem/progenitor cells // Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2006 Jun. Vol. 46(3). P.250-253.
20.Gargett C.E. Uterine stem cells: what is the evidence? // Hum Reprod Update. 2007. Vol. 13. P. 87-101.
21.Han X., Meng X., Yin Z., Rogers A., Zhong J., Rillema P., Jackson J.A., Ichim T.E., Minev B., Carrier E., Patel A.N., Murphy M.P., Min W.P., Riordan N.H. Inhibition of intracranial glioma growth by endometrial regenerative cells // Cell Cycle. 2009, Feb 15. Vol. 8(4). P. 606-610.
22.Hartman, 1944.
23.Hida N., Nishiyama N., Miyoshi S., Kira S., Segawa K., Uyama T., Mori T., Miyado K., Ikegami Y., Cui C., Kiyono T., Kyo S., Shimizu T., Okano T., Sakamoto M., Ogawa S., Umezawa A. Novel cardiac precursor-like cells from human menstrual blood-derived mesenchymal cells // Stem Cells. 2008. Vol. 26. P. 1695-1704.
24.Izadpanah R., Joswig T., Tsien F., Dufour J., Kirijan J.C., Bunnell
B.A. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques // Stem Cells Dev. 2005, Aug. Vol. 14(4). P. 440.
25.Jabbour H.N., Kelly R.W., Fraser HM., Critchley H.O.D. Endocrine regulation of menstruation // Endocrine Rev. 2006. Vol. 27. P. 17—46.
26.Kaiserman-Abramof IR, Padykula HA. Angiogenesis in the postovulatory primate endometrium: the coiled arteriolar system.// Anat Rec. 1989 Aug;224(4):479-89.
27.Kim Y.J., Yu J.M., Joo HJ., Kim H.K., Cho H.H., Bae Y.C., Jung J.S. Role of CD9 in proliferation and proangiogenic action of human adipose-derived mesenchymal stem cells // Pflugers Arch. 2007, Aug 1.
28.Li L., Xie T. Stem cell niche: structure and function // Annu Rev Cell Dev Biol. 2005. Vol. 21. P. 605-631.
29Matthai C., Horvat R., Noe M., Nagele F., Radjabi A., van Trotsen-burg M., Huber J., Kolbus A. Oct-4 expression in human endometrium // Mol Hum Reprod. 2006 Jan. Vol. 12(1). P. 7-10.
30.Maximov A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammzelle der verschiedenen Blutelemente in der embryonalen Entwicklung und im postfetalen Leben der Säugetiere // Cellular Therapy and Transplantation (CTT). 2009. Vol. 1, No. 3, Originally published in: Folia Haematologica 8.1909, 125-134.
31 .Mazur MT, Kraus FT. Histogenesis of morphologic variations in tumors of the uterine wall.//_Am J Surg Pathol. 1980 Feb;4(1):59-74.
32McLennan C.E., Rydell A.H. Extent of endometrial shedding during normal menstruation // Obst. et Gynecol. 1965. Vol. 26. P. 605-621.
33Meng X., Ichim T.E., Zhong J., Rogers A., Yin Z., Jackson J., Wang H., Ge W., Bogin V., Chan K.W., Thebaud B., Riordan N.H. Endometrial regenerative cells: A novel stem cell population // Journal of Translational Medicine. 2007. Vol. 5. P. 57.
34Murphy M.P., Wang H., Patel A.N., Kambhampati S., Angle N., Chan K., Marleau AM., Pyszniak A., Carrier E., Ichim T.E., Riordan N.H. Allogeneic endometrial regenerative cells: An «Off the shelf solution» for critical limb ischemia? // Journ. of Translational Medicine. 2008. P. 645.
35Musina R.A., Belyavski A.V., Tarusova O.V., Solovyova E.V., Sukhikh G.T. Endometrial mesenchymal stem cells isolated from the menstrual blood // Bull Exp Biol Med. 2008, Apr. Vol. 145(4). P. 539-543.
36Musina R.A., Egorov E.E., Beliavskii A.V. Stem cells: properties and perspectives of therapeutic use // Mol Biol. 2004. Vol. 38(4). P. 563-577.
37.Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith А. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct-4 // Cell. 1998. Vol. 95. P. 379-391.
38NishimotoM., Fukushima A., Okuda A., Muramatsu M. The gene for the embryonic stem cell coactivator UTF1 carries a regulatory element which selectively interacts with a complex composed of Oct-3/4 and Sox-2 // Mol. Cell. Biol. 1999. Vol. 19. P. 5453-5465.
39.Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat. Genet. 2000. Vol. 24. P. 372-376.
40. Noe M, Kunz G, Herbertz M, Mall G, Leyendecker G. The cyclic pattern of the immunocytochemical expression of oestrogen and progesterone receptors in human myometrial and endometrial layers: characterization of the endometrial-subendometrial unit.// Hum Reprod. 1999 Jan;14(1):190-7.
41.Okulicz WC, Ace CI, Scarrell R. Zonal changes in proliferation in the rhesus endometrium during the late secretory phase and menses.// Proc Soc Exp Biol Med. 1997 Feb;214(2):132-8.
42.Padykula HA, Coles LG, McCracken JA, King NW Jr, Longcope C, Kaiserman-Abramof IR. A zonal pattern of cell proliferation and differentiation in the rhesus endometrium during the estrogen surge // Biol Reprod. 1984 Dec;31(5):1103-18.
43.Padykula HA, Coles LG, Okulicz WC, Rapaport SI, McCracken JA, King NW Jr, Longcope C, Kaiserman-Abramof IR. The basalis of the primate endometrium: a bifunctional germinal compartment.// Biol Reprod. 1989 Mar;40(3):681-90.
44.Padykula HA. Regeneration in the primate uterus: the role of stem cells.//_Ann N Y Acad Sci. 1991;622:47-56.
45.Patel A.N., Park E., Kuzman M., Benetti F., Silva FJ., Allickson J.G. Multipotent menstrual blood stromal stem cells: isolation, characterization, and differentiation // Cell Transpl. 2008. Vol. 17. P. 303-311.
46.Preffer F.I., Dombkowski D., Sykes M., Scadden D., Yang Y.G. Lineage-negative side-population (SP) cells with restricted hematopoietic capacity circulate in normal human adult blood: immunophenotypic and functional characterization // Stem Cells. 2002. Vol. 20(5). P. 417-427.
47.Prianishnikov VA. Functional-morphological model of organization of the epithelium of normal, hyperplastic and neoplastic human endometrium// Arkh Patol. 1979;41(1):60-6.
48.Roth E, Taylor HB. Heterotopic cartilage in the uterus.// Obstet Gynecol. 1966 Jun;27(6):838-44.
49.Schwab K.E., Chan R.W.S., Gargett C.E. Putative stem cell activity of human endometrial epithelial and stromal cells during the menstrual cycle // Fert. and Steril. 2005. Vol. 84(2). P. 1124-1130.
50.Spencer JA, Hacker SL, Davis EC, Mecham RP, Knutsen RH, Li DY, Gerard RD, Richardson JA, Olson EN, Yanagisawa H. Altered vascular remodeling in fibulin-5-deficient mice reveals a role of fibulin-5 in smooth muscle cell proliferation and migration.// Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22;102(8):2946-51. Epub 2005 Feb 14.
51.Tabibzadeh S. Human endometrium: an active site of cytokine production and action.// Endocr Rev. 1991 Aug;12(3):272-90.
52.Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swier-giel J.J., Marshall V.S., Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998, Nov 6. Vol. 282(5391). P.1145-1147.
53.Toyoda M., Cui Ch., Umezawa A. Myogenic transdifferentiation of menstrual blood-derived cells // Acta Myol. 2007, Dec. Vol. 26(3). P. 176-178.
54.Tresserra F, Grases P, Ubeda A, Pascual MA, Grases PJ, Labastida R. Morphological changes in hysterectomies after endometrial ablation.// Hum Reprod. 1999 Jun;14(6):1473-7.
55.Uduwela AS, Perera MA, Aiqing L, Fraser IS. Endometrial-myometrial interface: relationship to adenomyosis and changes in pregnancy.// Obstet Gynecol Surv. 2000 Jun;55(6):390-400.
56.Umezawa A., Makino H. Cell source for regenerative medicine // Nippon Rinsho. 2008, May. Vol. 66(5). P. 865-872.
57. Wood C, Rogers P. A pregnancy after planned partial endometrial resection.// Aust N Z J Obstet Gynaecol. 1993 Aug;33(3):316-8.
58.Yuan H., Corbi N., Basilico C., Dailey L. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3/4 // Genes Dev. 1995, Nov 1. Vol. 9(21). P. 2635-2645.
59.Zhong J.F., Weiner L.P., Jin Y., Lu W., Taylor C.R. A real-time pluri-potency reporter for human stem cell // Stem Cells Dev. 2009.
60.Zhong Z., Patel A.N., Ichim T.E. et al. Feasibility investigation of allogeneic endometrial regenerative cells // Published online. 2009 Febr 20.
61.Van Os R, Kamminga LM, de Haan G. Stem cell assays: something old, something new, something borrowed.// Stem Cells. 2004;22(7):1181-90.
