CC BY
10
УДК 547.484.22
DOI: 10.17122/bcj-2018-2-46-49
Г. А. Файзуллина (магистрант), А. И. Масленников (магистрант), А. О. Ленкова (асп.), А. В. Зорин (к.х.н., в.н.с.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ АЛКИЛОВЫХ ЭФИРОВ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В ПРИСУТСТВИИ КЛЕТОК HANSENULA SP.
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
G. A. Faizullina, A. I. Maslennikov, A. O. Lenkova, A. V. Zorin, V. V. Zorin
ENANTIOSELECTIVE REDUCTION OF ALKYL ESTERS OF PYRUVIC ACID IN THE PRESENCE OF HANSENULA SP.
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: chemist.518@mail.ru
Показана способность дрожжевой культуры Hansenula sp. к энантиоселективному восстановлению пропилового, бутилового и амилового эфиров пировиноградной кислоты до соответствующих эфиров 25-гидроксипропионовой кислоты. Установлено, что эфиры пировиног-радной кислоты под действием клеток Hansenula sp. при 30—32 оС в течение 48 ч переходят в пропиловый, бутиловый и амиловый эфиры 25-(—)-гидроксипропионовой кислоты с выходами 35, 97, 99 % и оптической чистотой 98, 95 и 99 % ее, соответственно. Энантиоселек-тивное восстановление бутилового эфира пиро-виноградной кислоты протекает с более высокой скоростью, и выход бутилового эфира 25-(—)-гидроксипропионовой кислоты уже в течение 6 ч составляет 95%.
Ключевые слова: алкиловые эфиры пировиноградной кислоты; алкиловые эфиры 2-гидроксип-ропионовой кислоты; энантиоселективное восстановление; культура дрожжей НатепЫа sp.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки России в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности (№ 4.6451.2017/8.9).
Энантиомерно чистые 2-гидроксикарбоно-вые кислоты являются ценными строительными блоками, которые широко используются в органическом синтезе 1-2.
Алкиловые эфиры 25-(—)-гидроксипропи-оновой кислоты используются в синтезе раз-
The ability of the yeast culture Hansenula sp. to the enantioselective reduction of propyl, butyl and amyl esters of pyruvic acid to the corresponding esters of 2S-hydroxypropionic acid. It was established that esters of pyruvic acid under the action of cells Hansenula sp. pass at 30—32 0C for 48 hours in propyl, butyl and amyl esters of 2S-(—)-hydroxypropionic acid with yields of 35, 97, 99 % and optical purities of 98, 95 and 99 % respectively. Enantioselective reduction of butyric ester of pyruvic acid proceeds at a higher rate, and the yield of butyl 2S-(—)-hydroxypropionic acid ester was 95% for 6 h.
Key words: alkyl ethers of pyruvic acid; alkyl esters of 2-hydroxypropionic acid; enantioselective reduction; culture of yeast Hansenula sp.
Дата поступления 11.04.18
The work was supported by the Ministry of Education and Science of Russia within the framework of the basic part of the state task in the field of scientific activity (№4.6451.2017/8.9).
личных инсектицидов, противогрибковых и противоопухолевых агентов, а также являются промежуточными соединениями при получении зарагозовой кислоты — средства для лечения гиперхолестеринемии .
Ранее нами было показано, что дрожжевые культуры микроорганизмов Rhodotorula glutinis ВКПМ Y3576 и Pichia anomala 80-11
энантиоселективно восстанавливают алкило-вые эфиры пировиноградной кислоты (пропи-ловый, бутиловый и амиловый) с выходами 56—96 % и 29—98 % и достаточно высоким энантиомерным избытком 81—93 % ее и 76—96 % ее, соответственно 4.
С целью поиска новых доступных и эффективных биокатализаторов для энантиосе-лективного восстановления алкиловых эфиров пировиноградной кислоты нами исследована биомасса дрожжей Иапзвпи1а зр.
О
ОН
ОЯ Натвпы1а зр.
ОЯ
О 1а-в
О 2а-в
2S-(-)
Я = С3Н7 (1а, 2а); С4Н9 (1б, 2б); С5Нц (1в, 2в).
Установлено, что пропиловый 1а, бутиловый 16 и амиловый 1в эфиры пировиноград-ной кислоты под действием дрожжевой культуры Иапзвпи1а зр. при температуре 30—32 оС в течение 48 ч в аэробных условиях в 0.1М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 г/л субстрата и 25 г/л биомассы, восстанавливаются в соответствующие алкиловые эфиры 2-гидроксипропионовой кислоты 2а—в (табл. 1).
Таблица 1
Выходы алкиловых эфиров 2-гидроксипропионовой кислоты при восстановлении алкиловых эфиров пировиноградной кислоты в присутствии микроорганизмов Нвпввпи/в вр. при 30-32 оС, в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7)
Время, ч Выходы продуктов, %
2а 2 б 2в
0.25 5 36 31
0.50 8 72 47
0.75 10 79 60
1 18 84 71
2 21 92 92
6 30 95 95
12 32 96 97
24 34 96 99
48 35 97 99
72 28 97 99
Биовосстановление пропилового эфира пировиноградной кислоты культурой микроорганизмов Иапзвпи1а зр. протекает с образованием пропилового эфира 2-гидроксипропио-новой кислоты (2а) в течение 48 ч с выходом 35%. Ранее было показано, что в присутствии клеток Ккоёо1оти1а дЫИтз ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 выход 2а составил 56 и
29 %, соответственно 4 При увеличении продолжительности биотрансформации (72 ч) наблюдается протекание обратной реакции с частичным окислением 2а и образованием исходного субстрата 1а.
Восстановление бутилового эфира пиро-виноградной кислоты 16 культурой Иапзвпи1а зр. протекает с большей скоростью, и выход продукта 26 уже за 30 мин достигает 72%, а при восстановлении 16 в течение данного времени клетками КНоёо1оти1а дЫИтз ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 — 29 и 39 % соответственно 4. С увеличением продолжительности восстановления до 6 ч выход 26 во всех случаях заметно возрастает до 95, 88 и 92 %, соответственно.
Амиловый эфир пировиноградной кислоты 1в восстанавливается дрожжами Иапзвпи1а зр. в течение 48 ч с выходом 99%, в то время как культуры КНоёо1оти1а д1иИп1з ВКПМ У3576 и Р1еМа апота1а 80-11 осуществляют восстановление этого субстрата с выходами 89 и 88 %, соответственно уже за 1 ч 4.
Исследование оптических свойств продуктов 2а—в показало, что культура Иапзвпи1а зр., также как и КНоёо1оти1а дЫИтз ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11, осуществляет энантиоселективное восстановление алкило-вых эфиров пировиноградной кислоты с образованием алкиловых эфиров 25-(—)-гидро-ксипропионовой кислоты .
Оптическая чистота пропилового (2а), бутилового (26) и амилового (2в) эфиров 254—)-гидроксипропионовой кислоты при восстановлении пировиноградной кислоты с помощью Иапзвпи1а зр. в течение 48 ч составила 98, 95 и 99 % вв, соответственно.
Таким образом, из сопоставительного анализа редуцирующих свойств различных культур микроорганизмов следует, что наиболее эффективной культурой для восстановления пропило-вого эфира пировиноградной кислоты 1а является КНоёо1оти1а дЫИтз ВКПМ У3576, с наибольшим выходом пропилового эфира 25-(—)-гидроксипропионовой кислоты (2а) 4
Культура микроорганизмов Иапзвпи1а зр. является наиболее перспективным биокатализатором для энантиоселективного восстановления бутилового эфира пировиноградной кислоты 16. В течение 48 ч выход бутилового эфира 25-(—)-гидроксипропионовой кислоты (26) достигает 97% при оптической чистоте продукта 95% ее.
Культуры КНоёо1оти1а д1иИп1з ВКПМ У3576 и Р1еН1а апота1а 80-11 восстанавливают амиловый эфир пировиноградной кислоты (1в) с высоким выходом амилового эфира 25-(—)-гид-
роксипропионовой кислоты (2в) уже в течение 1 ч (88—89 %) 4, в то время как для восстановления амилового эфира пировиноградной кислоты клетками дрожжей Hansenula sp. с высоким выходом 2в (99%) требуется значительно большее время биотрансформации (48 ч).
Строение продуктов подтверждено методами ЯМР 1Н- и 13С-спектроскопии, хромато-масс-спектрометрии и поляриметрии.
Экспериментальная часть
Спектры ЯМР 1Н и ЯМР 13С записаны в CDCl3 на приборе Bruker АМ-300 (300.13 МГц (1Н) и 75.47 МГц (13С)) и Bruker АМ-500 (600.30 МГц (1Н) и 159.96 МГц (13С)). Химические сдвиги в спектрах ЯМР 1Н измеряли относительно ТМС, в спектрах ЯМР 13С — относительно сигнала растворителя (77.0 м.д.). Хромато-масс-спектральный анализ проводили на приборе GCMS-QP2010S Shimadzu (электронная ионизация при 70 эВ, диапазон детектируемых масс 33—500 Да). Хроматогра-фический анализ продуктов проводили на программно-аппаратном комплексе Хроматэк-Крис-талл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором, газ-носитель — гелий (1.1 мл/мин), энанти-оселективная колонка Astec CHIRALDEX™ B-PM (30 м х 0.25 мм х 0.12 мкм). Удельное вращение полученных продуктов ([a]D продукта) измеряли на автоматическом поляриметре АА-55 Optical Activity Ltd. (А=589 нм). Стандартная величина удельного вращения бутилового эфира 25-(—)-гидроксипропионо-вой кислоты [a]D20= —130 5.
Пировиноградную кислоту и ее алкило-вые эфиры синтезировали по известным методикам 6 7. Выходы алкиловых эфиров пировиноградной кислоты составили 83—91 %.
Пропиловый эфир пировиноградной кислоты 1а. Спектр ЯМР *Н, 5, м. д.: 0.98т (3Н, СН3), 1.65-1.78 м (2H, СН2), 2.43 с (3Н, СН3), 4.18 т (2Н, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5С, м. д.: 10.66 (1С, CH3), 21.86 (1С, CH2), 26.65 (1С, CH3), 67.61 (1С, CH20), 169.82 (1С, C00-), 189.78 (1С, C=O).
Бутиловый эфир пировиноградной кислоты 16. Спектр ЯМР *Н, 5, м.д.: 0.91 т (3Н, СН3), 1.35-1.53 м (2Н, СН2), 1.54-1.68 м (2Н, СН2), 2.43 с (3Н, СН3), 4.13 т (2Н, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5С, м. д.:13.64 (1С, CH3), 18.94 (1С, CH2), 26.47 (1С, CH3), 30.37 (1С, CH2), 64.84 (1С, CH20), 169.82 (1С, C00-), 189.78 (1С, C=0). Масс-спектр, m/z (IomH,
%): 173 (15), 145 (8), 117 (20), 89 (14), 61 (100), 57 (51), 56 (7), 55 (4), 43 (21), 41 (29).
Амиловый эфир пировиноградной кислоты 1в. Спектр ЯМР *Н, 5, м. д.: 0.89 т (3Н, СН3), 1.17-1.21 м (2Н, СН2), 1.32-1.34 м (2H, СН2), 1.58-1.69 м (2H, СН2), 2.15 с (3Н, СН3), 4.14 т (2H, СН20). Спектр ЯМР 13С, 5С, м. д.: 14.00 (1С, CH3), 21.87 (1С, CH3), 22.22 (1С, CH2), 28.23 (1С, CH2), 28.32 (1С, CH2), 62.39 (1С, CH20), 169.98 (1С, C00-), 186.05 (1С, C=0). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 131 (9), 71 (42), 70 (7), 61 (65), 55 (12), 44 (8), 43 (100), 42 (15), 41 (25), 39 (6).
Культуру дрожжей Hansenula sp. выра-
4
щивали на универсальной среде .
Биовосстановление алкиловых эфиров пи-ровиноградной кислоты осуществляли при температуре 30—32 0С в 0.1М фосфатном буфере (pH 7), содержащем 5 г/л субстрата и 25 г/л биомассы, при перемешивании в течение 48 ч, после чего биомассу дрожжей отделяли центрифугированием (10 мин при 7000 об/ мин). Фугат экстрагировали этилацетатом (3х30 мл), объединенные экстракты сушили Na2S04 и концентрировали.
Пропиловый эфир 25'-(—)-гидроксипро-пионовой кислоты (2а). Спектр ЯМР !Н, 5, м.д.: 0.92 т (3Н, СН3), 1.36 д (3Н, СН3), 1.591.71 м (2H, СН2), 4.09 т (2Н, СН20), 4.174.24 м (1H, СНОН). Спектр ЯМР 13С, 5С, м.д.: 10.19 (1С, CH3), 20.30 (1С, CH3), 21.84 (1С, CH2), 66.55 (1С, CH0H), 66.91 (1С, CH20), 175.59 (1С, C00-). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 75 (5), 59 (2), 56 (1), 46 (3), 45 (100), 44 (4), 43 (28), 42 (3), 41 (12), 39 (3).
Бутиловый эфир 25'-(—)-гидроксипропи-оновой кислоты (26). Спектр ЯМР 1Н, 5, м. д.: 0.95 т (3Н, CH3), 1.36-1.47 м (2Н, CH2),1.4U (3Н, CH3), 1.71-1.77 м (2Н, CH2), 4.18 т (2Н, CH20), 4.24-4.29 м (1Н, CH0H). Спектр ЯМР 13С, 5С, м.д.: 13.39 (1С, CH3), 18.95 (1С, CH2), 20.37 (1С, CH3), 30.66 (1С, CH2), 65.51 (1С, CH20), 66.69 (1С, CH0H), 174.91 (1С, C00-). Масс-спектр, m/z (IomH, %): 85 (8), 75 (4), 57 (22), 56 (13), 55 (4), 45 (100), 44 (3), 43 (7), 41 (20), 39 (3).
Амиловый эфир 25'-(—)-гидроксипропио-новой кислоты (2в). Спектр ЯМР !Н, 5, м. д.: 0.89 т (3Н, CH3), 1.14-1.31 м (4Н, 2CH2), 1.36 д (3Н, CH3), 1.51-1.65 м (2Н, CH2), 4.13 т (2Н, CH20), 4.16-4.24 м (1Н, CH0H). Спектр ЯМР 13С, 5С, м. д.: 13.89 (1С, CH3), 20.34 (1С, CH3), 22.19 (1С, CH2), 28.4 (1С, CH2), 29.37 (1С, CH2), 65.46 (1С, CH20), 66.49 (1С, CH0H), 175.59 (1С, C00-).
Литература
1. Chen X., Wu Q., Zhu D. Enzymatic synthesis of chiral 2-hydroxy carboxylic acids // Process Biochemistry.- 2015.- V.50.- Pp.759-770.
2. Yeon Soo Lee, Joo Hee Hong, Nan Young Jeon, Keehoon Won, and Bum Tae Kim. Highly enantioselective acylation of rac-alkyl lactates using Candida antarctica lipase B // Organic Process Research & Development.- 2004.- V.8.-Pp.948-951.
3. Magauer T. Chiral pool synthesis: chiral pool synthesis from hydroxy acids: lactic acid, tartaric acid, malic acid, and 2-methyl-3-hydroxypropionic acid // Comprehensive Chirality 1st Edition.- Elsevier Ltd., 2012.- Pp. 268-324.
4. Файзуллина Г.А., Ленкова A.O., Нигметзянова Д. P., Зорин А. В., Зорин В. В. Энантиоселектив-ное восстановление алкиловых эфиров пировиноградной кислоты // Баш. хим. ж.- 2018.-Т.25, №1.- С.73-76.
5. Каталог фирмы Sigma-Aldrich, Inc. «(-)-Butyl L-lactate» Электронный ресурс, режим доступа: https: //www.sigmaaldrich.com/catalog/ product/aldrich/69819.
6. Синтезы органических препаратов. Сборник I / под ред. Казанского Б. А.- М.: Государственное издательство иностранной литературы, 1949.-С. 345.
7. Archer S., Pratt M.G. A-(3,4-Dicarboxy)-furanvaleric and -acetic asids //J. Am. Chem. Soc.- 1944.- V.66.- Pp.1656-1659.
References
1. Chen X., Wu Q., Zhu D. [Enzymatic synthesis of chiral 2-hydroxy carboxylic acids]. Process Biochemistry, 2015, vol.50, pp.759-770.
2. Yeon Soo Lee, Joo Hee Hong, Nan Young Jeon, Keehoon Won, and Bum Tae Kim. [Highly enantioselective acylation of rac-alkyl lactates using Candida antarctica lipase B]. Organic Process Research & Development, 2004, vol.8, pp.948-951.
3. Magauer T. [Chiral pool synthesis: chiral pool synthesis from hydroxy acids: lactic acid, tartaric acid, malic acid, and 2-methyl-3-hydroxypropionic acid]. Comprehensive Chirality 1st Edition. Elsevier Ltd., 2012, pp. 268-324.
4. Faizullina G.A., Lenkova A.O., Nigmetzyanova D.R., Zorin A. V., Zorin V.V. Enantioselektivnoe vosstanovlenie alkilovykh efirov pirovinogradnoi kisloty [Enantioselective reduction of alkyl esters of pyruvic acid] Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2018, vol.25, no.1, pp.73-76. doi: 10.17122/bcj-2018-1-5-73-76.
5. [The company's catalog Sigma-Aldrich, Inc. «(—)-Butyl L-lactate»] https://www.sigmaaldrich. com/catalog/product/aldrich/69819.
6. Sintezy organicheskikh preparatov Sbornik I [Synthesis of organic preparations. Issue I]. Ed. Kazanskii B.A. Moscow, Gosudarstvennoe izdatel'stvo inostrannoi literatury Publ., 1949, p.345.
7. Archer S., Pratt M.G.[A-(3,4-Dicarboxy)-furanvaleric and -acetic asids]. J. Am. Chem. Soc., 1944, vol.66, pp.1656-1659.
