CC BY
107
раздел БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
УДК 635.92:581.143.6
ЭМБРИОКУЛЬТУРА ТЮЛЬПАНОВ © Р. К. Байбурина \ А. Ш. Ахметова 1а, Л. Н. Миронова \ И. Ф. Шаяхметов 2
1 Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450080, ул. полярная, 8.
Тел./факс: + 7 (347) 252 60 33.
E-mail: al_sham@mail.ru 2 Башкирский государственн ый университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел./факс: + 7 (347) 273 67 12.
Разработан перспективный метод использования эмбриональной культуры для получения гибридов селекционных сортов Tulipa L. в условиях лесостепной зоны Башкирского Предуралья. Определены оптимальные сроки выделения и размер зародышей для получения жизнеспособных эксплантов и увеличения коэффициента размножения. Показана зависимость морфогенетических процессов от селекционных особенностей форм Tulipa L. и условий культивирования in vitro.
Ключевые слова: гибридные формы тюльпана, культивирование зародышей in vitro, размножение цветочных культур.
Культура зародышей in vitro является одним из методов, который позволяет при отдаленном скрещивании получать жизнеспособное потомство. Известны работы А. И. Здруйковской-Рихтер, А. В. Отрошко и др. [1-4], использующие культуру репродуктивных органов для ускорения вегетативного размножения плодовых, косточковых и цветочных культур.
Для ускорения селекционного процесса успешно применена культура гибридных зародышей лилий [5], межвидовых гибридов гречихи [6], при отдаленной гибридизации пшеницы с эгилопсом
[7]. Метод также использовался при изучении особенностей регенерационных процессов в культуре изолированных гибридных зародышей трех видов Iris L. — I. hybrida L., I. sibirica L. и I. ensata Thunb
[8]. На основе культивирования сегментов клубнелуковиц, содержащих почку, разработана методика масс-клонального размножения гладиолуса гибридного (Gladiolus hybridus Hort.), позволяющая получить до 15 побегов с одного экспланта [9]. Получение гибридных форм тюльпанов является сложным и трудоемким процессом. Многие опыты по гибридизации являются неудачными потому, что зародыши погибают на ранних стадиях развития вследствие несовместимости эндоспермов и зародышей [10]. Нами было осуществлено 57 принудительных межсортовых скрещиваний, в результате чего только в пяти комбинациях скрещивания получены гибридные семена. Часть семян была использована для культивирования in vitro, остальные - высеяны в открытый грунт. Однако в обоих вариантах прорастания семян не наблюдалось. В связи с этим перед нами была поставлена задача разработать технологию культивирования изолированных зародышей in vitro.
Для этого решались следующие задачи: подбор условий стерилизации исходного растительного материала; изучение сроков изоляции заро-
дышей, наиболее благоприятных для успешного их развития in vitro; определение оптимальных условий культивирования зародышей (состав питательной среды, регуляторы роста, световой и температурный режим) для обеспечения интенсивной пролиферации побегов из изолированных зародышей и формирования микролуковиц.
В качестве исходного материала использовали зародыши семян гибридных форм тюльпана, полученных от пяти комбинаций скрещивания с участием девяти сортов зарубежной селекции: Uncle Tom x Klaudia, New Look x Marietta, Blue Heron x Queen of Nidht, Alladin x Blue Heron, Sherley x Angelique. Использованные сорта принадлежат, согласно международной классификации 1987 г., к 4 классам: Махровые поздние, Лилиецветные, Бахромчатые и Простые поздние. Всего за период исследований было введено в культуру in vitro более 140 зародышей.
Стерилизацию питательных сред и гибридных семян, культивирование растительных тканей в асептических условиях проводили согласно общепринятым методикам [11]. Стерилизацию растительного материала проводили по схеме: промывка невскрывшихся коробочек в мыльном растворе -20 мин, затем в 5%-ом растворе перманганата калия - 15 мин и в проточной воде - 15-20 мин. Семена стерилизовали в 70%-ном растворе этанола при экспозиции 0.5 мин, а затем последовательно в растворах диацида и хлорамина «Б» в концентрации 0.1 и 0.2% при экспозиции 2 и 4 мин соответственно.
С целью определения сроков изоляции мы отбирали зародыши с 40 по 70-й день после опыления.
Изолированные зародыши высаживали на без-гормональную среду Мурасиге-Скуга (MS) [12], дополненную тиамином, пиридоксином, никотиновой и аскорбиновой кислотами в концетрации
34
раздел БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
1.0 мг/л. Содержание сахарозы в питательной среде составило 50 г/л, агара - 5.5 г/л. В условиях in vitro растения культивировали в биологических пробирках при освещении с интенсивностью 103 лк при 16-часовом фотопериоде, температуре воздуха 26°С и 70%-ной относительной влажности. Зародыши культивировали на среде MS в течение четырех недель, далее их пересаживали на питательную среду, дополненную регуляторами роста цитокини-новой и ауксиновой природы.
Для получения микролуковиц, образовавшиеся побеги помещали на питательную среду, из которой исключали регуляторы роста цитокинино-вой природы, НУК (нафтилуксусную кислоту) заменяли на ИМК (индолилмасляную кислоту) в концентрации 0.5 мг/л.
В результате отработки методов дезинфекции семян тюльпана выявлено, что все испытанные варианты стерилизующих растворов перспективны для использования. Максимального числа жизнеспособных (96.8%), минимального числа инфицированных (12.5%) и некротизированных (3.2%) семян удалось достичь при последовательном выдерживании семян в 70%-ном этаноле в течение 0.5 мин и 0.2%-ном растворе диацида в течение 4 мин.
Результаты получения полноценных растений из изолированных зародышей на искусственной питательной среде зависят от многих факторов, в том числе от фазы их развития и сроков изоляции. Для тюльпанов характерно замедленное развитие и дифференциация зародыша [10]. Даже на 30-й день после опыления зародыши тюльпанов плохо просматривались. В связи с этим попытки вычленения их из семени не дали положительных результатов. Лишь на 40-й и 50-е дни сформировались зародыши размером 1.0 мм. Однако вычленение их из семян также было затруднено. Выявлено, что оптимальным сроком изоляции зародышей являются с 50 по 60-е дни после опыления, когда у основной массы семян их размер достигал 2.5-3.5 мм. Результаты приведены в таблице 1.
В варианте скрещивания New Look x Marietta приживаемость зародышей в культуре in vitro размером от 1.0-1.5 мм оказалась ниже (15.4-21.9%), чем у более крупных - 2.5-3.5 мм (от 59.6 до 71.0%). Однако зародыши размером от 4.2 до 6.5 мм были менее жизнеспособными (30.8-33.4%).
Выявлено, что даже в зрелых семенах тюльпана встречаются зародыши разных размеров. Так, на 70-й день изоляции зародышей их размеры колебались от 3.0 до 6.5 мм.
Во всех вариантах опыта к пятому месяцу культивирования на искусственной питательной среде происходило увеличение длины зародышей до 12.0-17.0 мм, процент приживаемости колебался от 34.3 до 89.8 мм (табл. 2).
Таблица 1.
Жизнеспособность зародышей тюльпанов in vitro в зависимости от сроков изоляции (на примере комбинации скрещивания New Look x Marietta).
№ п/п Число дней после опыления Размер зародышей, мм Приживаемость зародышей in vitro, %
1. 40 1.0 ± 0.03 15.4
2. 45 1.5 ± 0.3 21.9
3. 50 2.5 ± 0.25 59.6
4. 55 3.0 ± 0.15 73.2
5. 60 3.5 ± 0.2 71.0
6. 65 4.2 ± 0.3 30.8
7. 70 6.5 ± 0.4 33.4
Таблица 2.
Рост и развитие зародышей тюльпанов in vitro в зависимости от генотипа.
№ п/п Комбинации скрещивания Введено в культуру зародышей, шт. Прижилось зародышей, % Размер зародышей через 5 мес, мм
1. Uncle Tom x Klaudia 30 51.4 12.0 ± 1.3
2. New look x marietta 25 89.8 17.0 ± 1.5
3. Blue heron x queen of night 35 46.9 13.0 ± 0.9
4. Alladin x Blue Heron 30 66.7 13.5 ± 0.8
5. Sherley x Angelique 25 34.3 12.0 ± 1.3
Наиболее интенсивное увеличение размеров отмечалось у гибридов, полученных от комбинаций скрещивания New Look x Marietta, Alladin x Blue Heron и Blue Heron x Queen of Night. Т аким образом, в результате проведенных экспериментов установлено, что приживаемость и рост зародышей зависят от исходного генотипа.
Для стимуляции органогенеза в питательную среду добавляли 6-БАП (6-бензиламинопурин) и НУК, оптимальная концентрация которых была установлена в экспериментах. Наиболее активная пролиферация побегов наблюдалась на эксплантах в питательной среде, содержащей БАП 3.0 мг/л и НУК 0.15 мг/л. Число побегов на эксплант к седьмому месяцу культивирования составило в среднем 5.4, длина побегов - 4.3 см.
В результате последующего 4-6-кратного субкультивирования регенерантов на питательной среде с добавлением БАП и НУК происходила элонгация побегов. К 10-му месяцу они достигли длины 5.0-5.5 см. Для стимуляции процесса формирования микролуковиц из питательной среды исключали цитокинины, НУК заменяли на ИМК. Выращивание растений-регенерантов на питательной среде с 0.5 мг/л ИМК и повышенным содержанием сахарозы (50 г/л) при пониженной температуре 4°С в течение 12 недель в темноте способствовало формированию бульбообразующих побегов. Затем регенеранты переносили в условия фотопе-
риода и выдерживали при температуре 26°С до полного формирования микролуковиц, которое длилось от 30 до 120 дней при указанном выше режиме. Максимальный выход микролуковиц отмечался в комбинации скрещивания Alladin x Blue Heron и составил 39.9% от числа высаженных зародышей. В комбинациях New Look x Marietta, Blue Heron x Queen of Night, Uncle Tom x Klaudia и Sherley x Angelique выход микролуковиц составил соответственно 16.1, 15.4 12.1 и 10.9% (6-8 шт. на эксплант). Продолжительность периода получения микролуковиц из изолированных зародышей тюльпана составила 17-19 месяцев и зависела от генетических особенностей гибридов и условий культивирования in vitro. Сформировавшиеся микролуковицы высаживали в почвенный субстрат, состоящий из дерновой почвы и песка в соотношении 2:1. Приживаемость микролуковиц составила 70-85%.
Таким образом, для разработки метода эмбриокультуры тюльпана in vitro наиболее подходящими являются следующие параметры.
Для получения высокого процента приживаемости эксплантов установлен оптимальный срок изоляции зародышей из семян тюльпанов - 50-60-е дни после опыления. Жизнеспособность эксплантов увеличивается при использовании зародышей размером 2.5-3.5 мм.
Стимуляция органогенеза (пролиферация побегов) достигается добавлением в среду регуляторов роста цитокининовой и ауксиновой природы. Оптимальные концентрации БАП и НУК составляют 3.0 и 0.15 мг/л соответственно. При этом удается получить до 5 побегов из одного экспланта,
тогда как в условиях культуры in vivo из одного семени прорастает лишь одно растение.
Формирование микролуковиц происходит на питательной среде при исключении цитокининов и введении ИМК в концентрации 0.5 мг/л. Для развития регенерантов необходимо повышенное содержание сахарозы - до 50.0 г/л.
Приведенные результаты дают основания предполагать, что эмбриокультура является перспективным способом получения и размножения межсортовых гибридов тюльпана.
ЛИТЕРАТУРА
1. Здруйковская-Рихтер А. И. // Докл. АН СССР. 1985. Т.283, №1. С. 56-67.
2. Здруйковская-Рихтер А. И. // Бюл. Гл. ботан сада. 1997. Вып.175. С. 132-137.
3. Здруйковская-Рихтер А. И., Орехова В. П., Тарасюк Т. М // Бюл. Гл. ботан сада. 1997. Вып. 175. С. 137-141.
4. Отрошко А. В. Лилии. М.: Наука, 1993. С. 93-96.
5. Коршикова Н. Г. // Бюл. Гл. ботан сада. 1981. Вып. 120. С. 77-80.
6. Рубцова М. А., Левенко Б. А., Тараненко Л. К. // Физиол. и биохим. культурн. раст. 1994. Т. 26. №6. С. 563-566.
7. Талат М. М., Калинин А. В., Лапочкина И. Ф. // Бюл. Гл. ботан. сада. 1997. Вып.175. С. 127-131.
8. Вечерника Н. А., Таварткиладзе О. К., Клементьева Л. А., Долганова З. В. // Раст. рес. 2004. Т.40, №4. С. 56-64.
9. Мокшин Е. В., Лукаткин А. С. // Биотехнология. 2005. №1. С. 19-26.
10. Кудрявцева В. М. Селекция тюльпанов. Мн.: Наука и Техника, 1978. -144 с.
11. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. - 96 с.
12. Murashige T., Skoog F. // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, № 13. P. 473-497.
Поступила в редакцию 28.06.2006 г. Поступила в редакцию после доработки 23.11.2007 г.
