CC BY
58
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
113
УДК 612.017.1
Т.Н. Сергеева, В.Г. Сергеев, О.А. Вежеева
ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МОЗГА КРЫС В МОДЕЛИ ИНДУЦИРОВАННОЙ АУТОИММУННОЙ СИНУКЛЕОПАТИИ
Перенос крысам аутологичных интраперитонеальных макрофагов, предварительно стимулированных in vitro бактериальным липополисахаридом (ЛПС), вызывает ультраструктурные изменения черной субстанции и полосатого тела, свидетельствующие об инициации нейродегенеративных процессов в этих областях мозга. У животных экспериментальной группы появляются нейроны с крупными цитоплазматическими включениям и достоверно растет число нейронов черной субстанции в состоянии функциональной гипертрофии. Количество дегенерирующих пресинаптических окончаний и атрофических аксонов в области проекции этих нейронов также достоверно превышает аналогичные показатели у животных контрольной группы.
Ключевые слова: болезнь Паркинсона, альфа-синуклеин, нейродегенерация, синапс, макрофаги, липополисахарид.
Болезнь Паркинсона (БП) - одно из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний, наблюдаемых не менее чем у 1% пожилых людей [1]. Клинически БП характеризуется прогрессирующими двигательными нарушениями (замедленность движений, тремор покоя, повышенный тонус мышц и постуральная нестабильность), которые в основном, связаны с дегенерацией дофами-нергических нейронов черной субстанции мозга и падением секреции дофамина (ДА) в области проекций этих нейронов [2].
Ключевую роль в механизмах патогенеза болезни Паркинсона играет белок альфа-синуклеин. В норме этот белок встраивается в стенку синаптических пузырьков и участвует в процессе их слияния с пресинаптической мембраной в момент транссинаптической передачи межклеточного сигнала. Гиперпродукция или модификация альфа-синуклеина ведет к его полимеризации, агрегации и образованию крупных цитоплазматических включений в телах нейронов, видимых в световой микроскоп и описываемых как тельца Леви. Предполагается, что нарушения метаболизма этого белка запускают цепь событий, приводящих в конечном итоге к нейрональной дегенерации [3].
Следует отметить, что гибель нейронов черной субстанции и образование в оставшихся нейронах телец Леви наблюдаются лишь на последних стадии болезни Паркинсона. Последние клинические и экспериментальные данные позволяют утверждать, что дегенеративные процессы, определяющие клинические особенности этих заболеваний, начинаются на синоптическом уровне задолго до выраженной дегенерации ДА нейронов [4; 5]. В подавляющем числе случаев болезни Паркинсона у человека и в экспериментальных моделях паркинсонизма у животных в пресинаптических окончаниях нейронов обнаруживаются агрегаты альфа-синуклеина, и одновременно с этим наблюдается редукция числа пре-синаптических структур [4] и постсинаптических дендритных шипиков [6-13].
Логично полагать, что на ранних этапах болезни Паркинсона не гибель клеток, а дефицит аль-фа-синуклеина, связываемого в пресинаптические агрегаты, является причиной ранних клинических проявлений этого заболевания. Позже синаптическая дисфункция может осложниться прогрессирующей гибелью самих дофаминергических нейронов.
С практической точки зрения вышесказанное означает, что патологические изменения ультраструктуры синапсов, а также аксонов нейронов, проецирующихся в область полосатого тела, могут служить ранним маркером доклинических стадий болезни Паркинсона. В нашем исследовании мы использовали этот критерий для оценки эффективности и воспроизводимости разработанной нами модели паркинсонподобных нарушений у крыс, основанной на индукции у них аутоиммунного ответа на альфа-синуклеин. Основываясь на том, что альфа-синуклеин синтезируется, помимо нейронов, в макрофагах и лимфоцитах крови [14; 15], причем макрофаги интенсифицируют синтез альфа-синуклеина в ходе процессинга бактериальных антигенов [16], мы ранее продемонстрировали способность активированных макрофагов крыс инициировать гуморальный иммунный ответ против альфа-синуклеина и нейровоспаление в эксперименте с переносом животным аутологичных макрофагов, стимулированных in vitro бактериальным липополисахаридом (ЛПС) [17].
Целью данного исследования стало нахождение ультраструктурных признаков процесса нейро-дегенерации, как в черной субстанции мозга, где расположены дофаминергические нейроны, так и в области полосатого тела, куда проецируются эти нейроны, в модели ЛПС-индуцированной аутоиммунной синуклеопатии у крыс.
Материалы и методика исследований
Исследование выполнено на 12 самцах крыс линии Вистар, массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях. От каждого животного методом интраперитонеального смыва получали взвесь лейкоцитов. Для этого внутрибрюшинно вводили 20 мл забуференного физиологического раствора и после пятиминутного массажа отбирали его шприцем. Полученную клеточную взвесь (содержащую, главным образом, лимфоциты и макрофаги) помещали в отдельные чашки Петри со средой ЯРМ1 в концентрации 1 х 106 клеток на пробу. После 30-минутной инкубации при температуре +370 заменяли культуральную среду на свежую порцию. Таким образом, в чашках Петри оставались, главным образом, адгезированные к поверхности пластика макрофаги и дендритные клетки. Продолжали инкубировать клетки при температуре +370 в течение 24 часов, причем к половине проб в питательную среду добавляли ЛПС в концентрации 0,12 мкг/мл.
Через 24 часа инкубирования клетки, культивировавшиеся в чашках Петри, снимали с поверхности пластика раствором Версена с добавлением 0,25%-го раствора трипсина, отмывали и вводили животному, от которого они ранее были получены. Через 8 недель после клеточного переноса мозг крыс отбирался для электронномикроскопического исследования. Для этого животных наркотизировали эфиром, проводили интракардиальную перфузию смесью 3%-го глутарового альдегида и 4%-го параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4), извлекали мозг; области мозга, содержащие черную субстанцию и полосатое тело, дофиксировали в 1%-м водном растворе осмия. Промывали кусочки в 0,1М фосфатном буфере (рН=7,4), обезвоживали в спиртовых растворах восходящей концентрации и заключали в эпон и аралдит. Полутонкие срезы (1 мкм), окрашенные метиленовым синим, использовали для окончательной идентификации необходимых областей и заточки пирамид для ультратонкой резки. Ультратонкие срезы собирали на медные сеточки и окрашивали последовательно водным раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца. Срезы исследовали с помощью электронного микроскопа Philips-420 (Голландия).
Для морфометрического исследования численной плотности синапсов и аксонов фотографировали случайным образом по 30 участков нейропиля полосатого тела для каждой пробы площадью 10000 мкм2 при увеличении х3800. Подсчитывали общее число синапсов и аксонов, а также число патологически измененных синапсов и аксонов.
Статистический анализ проводили при помощи компьютерной программы «Statistica 6.0». Исследуемые величины определяли как среднее арифметическое ± стандартная ошибка средней. Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью t критерия Стьюдента и теста Манна - Уитни.
Результаты и их обсуждение
Структурные перестройки миелизированных аксонов в области полосатого тела крыс контрольной и экспериментальной групп. Качественный анализ ультраструктуры миелизированных аксонов в области полосатого тела мозга крыс показал, что наряду с множеством аксонов с хорошей сохранностью ультраструктуры миелиновых оболочек как в контроле, так и в экспериментальной модели паркинсонизма встречаются три основных типа повреждений миелиновой оболочки.
Для части миелинизированных аксонов было характерно локальное расслоение ламелл миели-новой оболочки, сопровождающееся снижением их электронной плотности (рис.1а, 5). Наблюдались также «грыжеподобные» выпячивания части миелиновой оболочки внутрь миелинизированного отростка. Такие участки были довольно крупными, состояли из многочисленных плотноупакованных ламелл миелина и сохраняли связь с миелиновой оболочкой аксона (рис.1б, выделено стрелкой). Изменения 3-го типа (атрофия аксона) характеризовались набуханием периаксиального глиального отростка, резким уменьшением диаметра аксона и смещением его от центра волокна к миелиновой оболочке. Часто в таких случаях миелиновая оболочка была очень тонкой и состояла всего из нескольких ламелл (рис.1в, выделено стрелкой).
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2011. Вып. 4
Рис.1. Морфологические изменения миелиновых волокон полосатого тела мозга крыс контрольной и экспериментальной групп (объяснение в тексте). Длина линии = 1 мкм
При количественном анализе не было выявлено различий между контролем и экспериментальными группами по общей численной плотности аксонов. Численная плотность аксонов с патологией миелиновых оболочек 1-го и 2-го типа имеет тенденцию к росту в экспериментальной группе животных, но не достигает достоверного уровня (для всех параметров р > 0,13, и-тест Манна - Уитни).
Однако количество миелиновых аксонов с патологией 3-го типа была достоверно выше в модели индуцированной синуклеопатии по сравнению с контролем. У животных экспериментальной группы количество аксонов на стандартной площади с нарушениями по третьему типу патологии превышало аналогичный показатель на 96,4±19,1% (р < 0,001).
Структурные изменения синапсов в области полосатого тела в модели индуцированной синуклеопатии. Анализ состояния синаптических контактов в области полосатого тела контрольных и экспериментальных животных продемонстрировал тот факт, что моделирование паркинсонизма вызывает значительную перестройку аксодендритных синапсов этой области. Только у экспериментальных животных обнаруживаются расширенные аксодендритные синаптические окончания со значительным накоплением в них синаптических пузырьков (в 9,3±1,8% числе аксонов от всех подсчитанных на стандартной плащадке). Синаптические пузырьки упакованы в таких синапсах очень плотно, образуя сплошной конгломерат (рис. 2).
Кроме подобного рода изменений в полосатом теле экспериментальных животных обнаружены случаи дегенерации аксонов по «темному типу». Дегенерирующие аксоны имели высокую электронную плотность, набухшие митохондрии; мембрана плотно упакованных синаптических пузырьков в них зачастую прерывалась, что может свидетельствовать об их разрушении (рис. 3). Число дегенерирующих пресинаптических локусов относительного общего их числа составило, в среднем, 4,8±0,9%.
Структура нейронов черной субстанции крыс в модели индуцированной синуклеопатии. Только в группе животных с индуцированным нарушением метаболизма синуклеина, в цитоплазме нейронов черной субстанции обнаруживались видимые структурные изменения. Электронномикро-скопическое исследование подтвердило наличие цитоплазматических включений в части нейронов черной субстанции этих крыс, аналогичное тельцам Леви, которые наблюдаются при развитии си-нуклеопатий (рис. 4).
Рис. 2. Структура аксодендритных синапсов в полосатом теле крыс с ЛПС - индуцированной синуклеопа-тией. Пресинаптические расширения содержат плотноупакованные синап-тические пузырьки и разрушенные митохондрии (выделены стрелкой). Длина линии = 1мкм
Рис. 3. Дегенерирующий аксоденд-ритный синапс в нейропиле полосатого тела крыс с индуцированным паркинсонизмом (выделены толстыми стрелками). Разрушенные митохондрии выделены тонкой стрелкой, миелиновый аксон с расхождением ламелл обозначен звездочкой. Длина линии = 1 мкм
Количество нейронов с подобными включениями, подсчитанное на стандартной площади, составило 2,4% от общего числа нейронов черной субстанции. Следует отметить, что в большинстве случаев мы не наблюдали значительных изменений в морфологии нейронов черной субстанции, однако в группе животных с индуцированным нарушением метаболизма альфа-синуклеина в части нейронов (8,5 ± 1,2% от общего числа) встречались клетки с признаками значительной функциональной гиперактивности (рис. 5). О ней мы судили по повышенной электронной плотности цитоплазмы, расширению пери-нуклеарного пространства и увеличению просветов гранулярной эндоплазматической сети. Важно отметить, что в таких нейронах не всегда обнаруживались цитоплазматические включения.
Рис. 4. Цитоплазматическое включение в нейроне черной субстанции мозга крыс с индуцированной синук-леопатией (выделено стрелкой). Длина линии = 80нм
Рис. 5 Электронная микрофотография гипертрофированного нейрона черной субстанции крыс в модели индуцированной синуклеопатии. Обозначения: тонкие стрелки- набухшие митохондрии; толстые стрелки - расширенные перинуклеарные пространства; звездочки-
расширенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети. Длина линии = 100 нм
БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ
2011. Вып. 4
Таким образом, перенос крысам аутологичных интраперитонеальных макрофагов, предварительно стимулированных in vitro бактериальным липополисахаридом, вызывает ультраструктурные нейродегенеративные изменения черной субстанции и полосатого тела мозга, что может рассматриваться как аргумент в пользу гипотезы о вовлеченности иммунной системы в развитие синдрома паркинсонизма.
Выводы
1. Перенос животным аутологичных макрофагов, стимулированных in vitro бактериальным эндотоксином, ведет к достоверному увеличению числа патологически измененных миелиновых аксонов, которые характеризуются расслоением ламелл миелина, набуханием периаксиального глиаль-ного отростка и существенным уменьшением диаметра аксона, что свидетельствует об атрофии и дегенерации части аксонов в полосатом теле.
2. В области полосатого тела животных, перенесших трансфекцию аутологичных ЛПС-стимулированных макрофагов, достоверно увеличивается количество дегенерирующих пресинапти-ческих окончаний.
3. В группе животных с индуцированной аутоиммунной синуклеопатией достоверно растет число нейронов с признаками функциональной гипертрофии и цитоплазматическими включениями, сходными по структуре с тельцами Леви.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Dluzen D.E, McDermott J.L. Gender differences in neurotoxicity of the nigrostriatal dopaminergic system: implications for Parkinson's disease // J. Gend. Specif. Med. 2000. Sep-Oct. №3 (6). Р. 36-42.
2. Bernheimer H. et al., Clinical, morphological and neurochemical correlations // J. Neurol Sci. 1973. Dec. Vol. 20, №4. P. 415-455.
3. Hsu L. J., Sagara Y., Arroyo A. et al. a-Synuclein рromotes mitochondrial deficit and oxidative stress // Amer J. of Pathol. 2000. Vol. 157, №2. P. 401-410.
4. Nikolaus S, Antke C, Muller H.W. In vivo imaging of synaptic function in the central nervous system: I. Movement disorders and dementia // Behav Brain Res. 2009. Vol. 204. P. 1-31.
5. Linazasoro G. Classical Parkinson disease versus Parkinson complex - reflections against staging and in favour of heterogeneity // Eur J. Neurol. 2007. Vol. 14. P. 721-728.
6. Schulz-Schaeffer W.J. The synaptic pathology of a-synuclein aggregation in dementia with Lewy bodies, Parkinson's disease and Parkinson's disease dementia // Acta Neuropathol. 2010. Vol. 120 (2). P. 131-143.
7. Zaja-Milatovic S. et al. Selective dendritic degeneration of medium spiny neurons in dementia with Lewy bodies // Neurology. 2006. Vol. 66. P. 1591-1593.
8. Ingham C.A. et al. Spine density on neostriatal neurones changes with 6-hydroxydopamine lesions and with age // Brain Res. 1989. Vol. 503. P. 334-338.
9. Solis O. et al. G. Alterations in dendritic morphology of the prefrontal cortical and striatum neurons in the unilateral 6-OHDA-rat model of Parkinson's disease // Synapse. 2007. Vol. 61. P. 450-458.
10. Day M., Wang Z., Ding J., et al. Selective elimination of glutamatergic synapses on striatopallidal neurons in Parkinson disease models // Nat Neurosc. 2006. Vol. 9. P. 251-259.
11. Deutch A.Y. Striatal plasticity in parkinsonism: dystrophic changes in medium spiny neurons and progression in Parkinson's disease // J. Neural Transm. 2006. Vol. 70. P. 67-70.
12. Patt S. et al. Pathological changes in dendrites of substantia nigra neurons in Parkinson's disease: a Golgi study // Histol Histopathol. 1991. Vol. 6. P. 373-380.
13. Zaja-Milatovic S., Milatovic D., Schantz A.M. et al. Dendritic degeneration in neostriatal medium spiny neurons in Parkinson disease // Neurology. 2005. Vol. 64. P. 545-547.
14. Jakes R. et al. Identification of two distinct synucleins from human brain // FEBS Lett. 1994. Vol. 345, №1. P. 27-32.
15. Kim S. et al. Alpha-synuclein induces apoptosis by altered expression in human peripheral lymphocyte in Parkinson's disease // FASEB J. 2004. Vol. 18(13). P. 1615-1517.
16. Tanji K., Mori F., Imaizumi T. Upregulation of a-synuclein by lipopolysaccharide and interleukin-1 in human macrophages // Pathology International. 2002. Vol. 52, №9. Р. 572-577.
17. Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Аутоиммунные механизмы паркинсонподобных нарушений у крыс // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о земле. 2011. Вып. 1. С. 81-87.
Поступила в редакцию 15.09.11
T.N. Sergeeva, V.G. Sergeev, O.A. Vezheeva
Electron-microscopic studies of rat brain neurodegenerative changes in the model of autoimmune synucleopathie
Adopted transfer intraperitoneal autologous macrophages pre-stimulated in vitro by bacterial lipopolysaccharide (LPS), causes neurodegenerative ultrastructural changes in the substantia nigra and the striatum of the rats brain. Experimental animals significantly increase the number of neurons in the substantia nigra in the state of functional hypertrophy and large neuronal cytoplasmic inclusions. The number of degenerating presynaptic terminals and atrophic axons in the area of the projection of these neurons also significantly exceeds similar indices in the animals of the control group.
Keywords: parkinson disease, alpha-synuclein, macrophages, lipopolysaccharide, synapse, neurodegeneration.
Сергеева Татьяна Николаевна, старший преподаватель ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1) E-mail: [email protected]
Sergeeva T.N., senior lecturer Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]
Сергеев Валерий Георгиевич,
доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет»
426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
E-mail: [email protected]
Вежеева Ольга Александровна, аспирант ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1) E-mail: [email protected]
Sergeev V.G., doctor of biology, professor Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]
Vezheeva O.A., graduate student Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1 E-mail: [email protected]
