CC BY
7УДК 616.992:576.828.8
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЫРАЩЕННЫХ IN VITRO КЛЕТОК TRICHOPHYTON RUBRUM (CASTELL.) SEMON
Савицкая Т.И., Васильева H.B., Мартынов А.А., Степанова А.А., Разнатовский К.И.
НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов,2007
Изучена ультраструктура клеток вегетативного мицелия Т. rubrum, штамм PKIHF-1209, выделенного от пациента с онихомикозом и выращенного на агаризированной среде Чапека. Выявлены различия в гифальном составе и особенностях морфогенеза клеток воздушного и субстратного мицелия. Приведено детальное описание латеральных клеточных стенок, септ и их порового annajmma.
Ключевые слова: вегетативный мицелий, поровмй аппарат септ, Trichophyton ruhrum, ультраструктура
THE ELECTRON-MICROSCOPIC INVESTIGATION OF TRICHOPHYTON RUBRUM (CASTELL.) SEMON, GROWN IN VITRO
Savitskaya T.I., Vasilyeva N.V., Martynov A.A., Stepanova A.A., Raznatovskiy K.l.
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia
€> Collective of authors, 2007
The ultrastructure of T. rubrum hypltal cells strain PKfTTF-1209 (vegetative mycelium), isolated on Czapek agarfront patient with onychomycosis has been investigated. It was shown that there are the differences in hypltal composition and the cells morphogenetic characteristic property of aerial and substrate mycelium. The minute description of lateral cell walls, septes and septal pore apparatus are given.
Key words: vegetative mycelium, septal pore apparatus, Trichophyton rubrum, ultrastructure
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы регистрируют статистически значимый прогрессирующий рост заболеваемости онихомикозами, возбудителем которых является Т. rubrum. Особенности ультраструктуры клеток Т. rubrum, выращенного in vitro, частично изучены ранее с использованием методов сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Однако органеллография и, в целом, морфогенез клеток вегетативного мицелия этого вида в условиях культуры оставались недостаточно изученными; это и составило цель настоящего исследования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изучали Т. rubrum, штамм PKI IFF-1209, из коллекции НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб MAI Ю, выделенный от больного онихомикозом (А.О., 14.01.2004 г.). Культуры гриба выращивали на агаризированной среде Чапека в термостате при 27 °С и исследовали через 5, 10, 20 и 30 суток выращивания. Способы подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии приведены нами ранее [1].
Колонии Т. rubrum, выросшие через пять дней после посева, были белого цвета и 0,5 см в диаметре. Через 10 суток выращивания цвет воздушного мицелия оставался белым, а субстратного - пурпурно-красным; при этом диаметр колоний возрастал, в среднем, до 1,0 см. Через 20 и 30 дней окраска колоний была прежней, а диаметр увеличивался соответственно до 4,0 и 5,0 см.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Воздушный мицелий. Клетки гиф варьировали в диаметре от 0,9 до 1,5 мкм, располагались хаотично и довольно рыхло относительно друг друга (Рис. 1а); выявляли, помимо интактных клеток, стареющие и полностью отмершие. В центральной и средней части пятидневной колонии гриба небольшой процент клеток воздушного мицелия находился на разных стадиях старении и отмирания. С возрастом культур гриба частота встречаемости последних двух типов клеток воздушного мицелия существенно возрастала в направлении от центра к периферии колонии.
Клетки воздушного мицелия содержали два ядра эллипсоидной формы (0,8x1,2 мкм), расположенные по одному у латеральной клеточной стенки. Ядрышко - одно, мелкое (0,3 мкм), эксцентричное, слабо контрастное. Нуклеоплазма сходной электронной плотности с цитозолем; хроматин диффузного типа. Характерные для содержимого растущих клеток многочисленные мелкие вакуоли, как правило, были собраны в группы и отличались разнообразием формы и содержимого. Чаще всего выявляли вакуоли со светлым и фибриллярным содержимым. По мере роста клеток отмечали усиление степени их вакуолизации за счет формирования одной светлой центральной вакуоли, содержащей обрывки мембран
разной конфигурации.
Митохондрии (0,3-0,5 мкм) - в небольшом числе, одиночные, округлые или слегка эллипсоидной формы, с матриксом умеренной электронной плотности и редкими светлыми кристами. Другие орга-неллы не обнаружены. Запасные вещества отсутствовали. В тоже время клетки воздушного мицелия Г mentagrophytes var. interdigitale в условиях in vitro аккумулировали небольшое число запасных веществ в форме липидных включений [2].
Для цитозоля была характерна высокая электронная плотность. Плазмалемма клеток ровная, плотно примыкала к тонкой (0,08 мкм), светлой клеточной стенке гранулярной структуры.
Субстратный мицелий. По мере роста клеток гиф субстратного мицелия диаметр их увеличивался, варьируя в пределах от 2,0 до 3,5 мкм. Клетки субстратного мицелия располагались беспорядочно и плотно относительно друг друга (Рис. 2 б, в). Плотность распределения гиф мицелия этого типа возрастала по мере роста и дифференциации колонии гриба. В составе субстратного мицелия выявили два типа зрелых гиф — с темным и светлым цитозолем. Клетки с темным цитозолем появлялись одновременно со сменой окраски подошвенной стороны (foot side = FS) колоний гриба с белого на красный цвет (Рис. 1в). Электронная плотность темных клеток гиф субстратного мицелия была настолько высокой, что ядра, органеллы и запасные вещества в них не были различимы. Это могло быть обусловлено аккумуляцией красного пигмента непосредственно в цитозоле некоторых клеток гиф субстратного мицелия.
В содержимом клеток гиф со светлым цитозолем локализовались два ядра (0,5x0,6 мкм) эллипсоидной формы. Ядрышко — одно, небольших размеров (0,4 мкм), эксцентричное, составлено из гранул и фибрилл, представленных в равной мере (Рис. 2 г). Нуклеоплазма, как и цитозоль, умеренной электронной плотности. Хроматин, в основном, диффузного типа; конденсированный - в виде тонкого периферического ободка, приуроченного к ядерной оболочке, которая имела слегка волнистый контур.
Вакуоли клеток субстратного мицелия отличались большим разнообразием форм и их содержимого (Рис. 1 з-к), в котором выявляли тонко-фибриллярный материал разной электронной плотности и обрывки мембран разной морфологии и протяженности. В составе растущих клеток наблюдали вакуоли мелкие (Рис. 1 з) и средних размеров (Рис. 1 и), тогда как в зрелых, как правило, - несколько крупных (Рис. 1 к) или одну центральную. Последняя формировалась за счет слияния мелких вакуолей, что отмечено выше и для клеток гиф воздушного мицелия. В отличие от Т. rubrum, гифы субстратного мицелия Т. mentagrophytes var. interdigitale [2] в условиях культуры не содержали вакуолей, что, в сочетании с высоким индексом их ветвления, было причиной формирования коротких клеток, располагающихся плотно относительно друг друга, наподобие ложной ткани.
Многочисленные митохондрии распределены по площади среза клетки довольно равномерно, крупные (0,4-0,6 мкм). Они находились в плотном контакте между собой и оболочкой ядра. Форма их округлая, эллипсоидная и гантелевидная. Матрикс ор-ганелл умеренной электронной плотности содержит частые, длинные, беспорядочно ориентированные кристы (Рис. 1 д). Из компонентов эндомембран ной системы крайне редко отмечали короткие, слегка извилистые цистерны агранулярного эндоплазматичес-кого ретикулума, приуроченные к клеточной стенке. Микротельца и микротрубочки отсутствовали.
Запасные вещества в форме липидных включений и розеток гликогена выявляли в небольшом числе зрелых клеток субстратного мицелия в колониях гриба через 20 и 30 дней после посева. Редкие липидные включения локализовались одиночно или в небольших группах. Они варьировали в диаметре (0,2-0,5 мкм), имели неровный контур и умеренную электронную плотность (Рис. 1 е). Гликоген количественно преобладал над липидами. Розетки гликогена (0,1-0,2 мкм) были умеренной электронной плотности и находились в тесном контакте друг с другом. Их наиболее крупные скопления формировались в промежутке между ядрами и латеральной клеточной стенкой (Рис. 1ж). Последовательность синтеза запасных веществ ориентировочно была следующей: вначале происходило накопление липидных включений, а затем - розеток гликогена. Сходный набор запасных веществ ранее был выявлен нами в клетках субстратного мицелия Т. mentagrophytes var. interdigitale [2].
Цитозоль умеренной электронной плотности насыщен свободными рибосомами. Плазмалемма слегка извилистая. Клеточная стенка, как правило, тонкая (0,2 мкм), двухслойная: верхний слой тонкий (0,03 мкм), темный и гомогенный, а нижний — более широкий, умеренной электронной плотности и фибриллярной текстуры. В отличие, например, от Т. violaceum, некоторые клетки гиф субстратного мицелия Г. rubrum имели локальные светлые утолщения (0,6—0,8 мкм) клеточной стенки (Рис. 2 к, м).
Формирование макроконидий. Способность культур Т. rubrum формировать макро- и/или микроконидии зависит от нггаммовой принадлежности. В культурах исследуемого штамма было обнаружено только небольшое число макроконидий; их образование отмечали через 20 дней после посева. Закладка макроконидий происходила одновременно на латеральной поверхности зрелой гифы погруженного мицелия. Первоначально клеточная стенка формировала латеральные выросты (Рис. 2 ж; 3 a-в) с апикальным ростом. В момент, когда латеральный вырост достигал 2/3 своей длины, в его основании закладывалась отделительная (базальная) септа (Рис. 2 з, и; 3 г). В этот период верхняя половина макроконидии имела диаметр вдвое больший, чем ее базальная часть. В содержимом такой макроконидии были видны мелкие и средних размеров вакуоли, содержащие скоп-
ления тонко-гранулярного вещества (Рис. 2 з; 3 г). Ядра и другие органеллы не выявляли из-за высокой плотности цитозоля. Закончившие рост макроконидии (40-50x6,0-7,0 мкм) — трехклеточные, с конусообразными апексом и основанием (Рис. 2 л; Зе). Характерные для этого вида гриба 5-6-клеточные макроконидии в культурах исследуемого нами штамма отсутствовали. В сегментах зрелых макроконидий основной объем занят крупной вакуолью. Вблизи септ и латеральных клеточных стенок отмечали скопления небольшого числа мелких (0,2-0,3 мкм) светлых липидных включений. Зрелые макроконидии у ранее изученного нами Т. mentagrophytes var. interdigitale [2], в отличие от макроконидий изученного нами штамма Т. rubrum, не имели вакуолей и содержали намного больше запасных веществ в форме липидных включений и розеток гликогена.
Клеточная стенка макроконидий - тонкая (0,1 мкм), однослойная, тонко-гранулярная. Отделение зрелых макроконидий от клеток вегетативного мицелия происходило после лизиса базальной септы (Рис. 3 ж).
Мы полагаем, что одной из возможных причин формирования клетками субстратного мицелия изучаемого штамма небольшого числа трехклеточных макроконидий может быть скудность запасных веществ в цитозоле. К примеру, у ранее исследованного нами штамма Т. mentagrophytes var. interdigitale [2] насыщенность запасными веществами клеток вегетативного мицелия обусловливала обильное кони-диальное спороношение. Очевидно, что способность формировать конидии культурами разных штаммов Т. rubrum, а также их количество и качество находятся в прямой зависимости от способности клеток их вегетативного мицелия синтезировать запасные вещества.
Поровый аппарат септ Клетки воздушного и субстратного мицелия отделены друг от друга однослойными клиновидными светлыми септами (Рис. 2 а-д), с толщиной у латеральной клеточной стенки 0,07 (0,06-0,08) мкм, а в средней части - 0,04 (0,03-
0,05) мкм. В центре сеп г имела место сквозная пора диаметром 0,12 (0,10-0,14) мкм, вблизи которой располагались тельца Воронина в числе от 1 до 6-7 (Рис. 2 е). Чаще всего были септы, вблизи которых наблюдали 4 тельца Воронина, локализующиеся на некотором удалении от септ и септальных пор (Рис. 2 г). Реже встречали септы с одним тельцем Воронина, прикрывающим просвет их поры (Рис. 2 в), либо с двумя тельцами, находящимися по разные стороны от септы и прикрывающими просвет поры (Рис. 2 б). В просвете пор таких септ отмечали темные гомогенные пробки небольшой толщины (Рис. 2 б, в; обозначены стрелками). В тоже время в порах септ с тельцами Воронина, не перекрывающими их просвет (Рис. 2 а, г), толщина пробок была намного больше. В стареющих клетках гиф мицелия выявляли септы без телец Воронина, но с тонкой гомогенной плотной пробкой в содержимом поры (Рис. 2 д, стрелка).
Форма телец Воронина - сферическая; средний диаметр - 0,17 мкм (0,15-0,20 мкм). Содержимое телец — гомогенное, высокой электронной плотности (Рис. 2 а-е); снаружи они окружены темной трехслойной ограничивающей мембраной.
Септы макроконидий — прямые, светлые, с узкой
0,5 (0,3-0,7) мкм центральной порой в растущих конидиях и сплошные — в зрелых. Они в два раза более тонкие (в среднем, 0,02 мкм), чем септы вегетативного мицелия (Рис. 2 з, л); пробки в порах и тельца Воронина вблизи них всегда отсутствовали.
Заметим, что, несмотря на принадлежность к одному роду, Т. rubrum существенно отличался от Т. mentagrophytes var. interdigitale по толщине септ, размерам и строению телец Воронина. Так, септы в зрелых клетках последнего вида были тоньше в 3 раза, а тельца Воронина - в 2,4 раза крупнее. Кроме того, содержимое телец Воронина у Т. mentagrophytes var. interdigitale имело четко выраженную кристаллическую структуру. Отметим, что изученные нами виды рода Aspergillus не различались между собой по размерам телец Воронина септальных пор [1, 3-5]. Возможно, что у представителей рода Trichophyton особенности строения порового аппарата септ являются видоспецифичным признаком, но для окончательного решения этого вопроса необходимо дальнейшее расширение числа исследуемых объектов.
Нами выявлены различия в гифальном составе воздушного и субстратного мицелия выращенных in vitro клеток Т. rubrum-. в составе последнего, помимо светлых гиф, были гифы с темным содержимым. 11рисутствие последних определяло красную окраску FS культур гриба. Показано, что клетки гиф воздушного и «светлые» субстратного мицелия Т. rubrum сходны между собой по размерам и форме ядер, уровню развития вакуома и компонентов эндомем-бранной системы, а также структуре латеральных клеточных стенок. Основные признаки дифференциации «светлых» клеток гиф субстратного мицелия описаны выше по тексту.
В период старения клеток субстратного мицелия Т. rubrum, в них наблюдали дальнейшее усиление вакуолизации, резкое снижение числа органелл и лизис запасных веществ, что коррелировало с переходом колоний гриба к формированию макроконидий.
ВЫВОДЫ
1. Зрелые клетки гиф мицелия Г rubrum содержат два слабо хроматизированных интерфазных ядра; субстратный мицелий с возрастом темнеет (приобретает красную окраску).
2. Светлые клетки гиф воздушного и субстратного мицелия Т. rubrum сходны между собой по размерам и форме ядер, уровню развития компонентов эндо-мембранной системы и структуре латеральных клеточных стенок; основными признаками дифференциации светлых клеток гиф субстратного мицелия являются усиление уровня вакуолизации, увеличение числа митохондрий и синтез запасных веществ.
Рис. 1. Ультраструктура клеток воздушного (а) и субстратного (б-к) мицелиев Trichophyton rubrum,
выросшего в условиях in vitro:
а - общий вид клеток воздушного мицелия; б - общий вид клеток субстратного мицелия колонии белого цвета с подошвенной стороны (foot side = FS); в - общий вид клеток субстратного мицелия колонии с FS пурпурно-красного цвета; г - интерфазное ядро с ядрышком; д - митохондрия; е-липидные включения; ж - скопления розеток гликогена вблизи интерфазного ядра; з - фрагмент растущей клетки с мелкими вакуолями; и - фрагмент растущей клетки с вакуолями средних размеров; к - общий вид клетки в период старения. Ув.:а -х4800; б, в -х7200; г-х19000; д-х56000;
е-з-х12000; и, к-х14500.
Условные обозначения (здесь и на рис. 2 и 3).
В - вакуоль; Гл - гликоген; КГ -клетка гифы; Л - латеральный вырост клетки; ЛВ - липидное включение;
М - митохондрия; Мк- макроконидия; ОС - отделительная септа; С - септа; ТВ - тельце Воронина; ТК-темная клетка; УКС - утолщение клеточной стенки; ЭР - эндоплазматический ретикулум; Я - ядро; Яд - ядрышко.
Рис. 2. Фрагменты зрелых клеток субстратного мицелия Trichophyton rubrum, выращенного in vitro: а - е - строение септ и телец Воронина (стрелкой показаны пробки); ж - начальный этап формирования латерального выроста клеточной стенки; з - общий вид растущей макроконидии с вакуолями и отделительной септой; и - фрагмент основания растущей макроконидии с отделительной септой; к, м - клетки гиф субстратного мицелия с локальными утолщениями клеточной стенки; л - общий вид зрелой макроконидии.
Ув.:а-д-Х67000;е-Х20000;ж, л-х10000; з-к-х7200; м-7000.
ЛВ
І
в
-
Ъ'оЩ
Гл
Рис. 3. Морфогенез макроконидии Trichophyton rubrum (схема) а - в - формирование латерального выроста клеточной стенки вегетативного мицелия; г - формирование отделительной септы в основании растущей макроконидии; д - макроконидия в период закладки септ; е - закончившая рост макроконидия с вакуолями, липидными включениями и сплошными септами; ж - зрелая макроконидия после отделения
от клетки вегетативного мицелия.
3. Между клетками мицелия Т. rubrum формиро- 4. Для исследованного штамма Т. rubrum было хавались однослойные светлые клиновидные септы. В рактерно формирование небольшого числа трехкле-
качестве обязательных компонентов порового ап- точных макроконидий, бедных запасными вещества-
парага септ выявлены крупные темные гомогенные ми. Слабое конидиальное спороношение находилось
тельца Воронина округлой формы в числе от 1 до 7 в прямой зависимости от низкого содержания запаси пробки разнообразной морфологии. Септы зрелых ных веществ в клетках субстратного мицелия,
макроконидий - тонкие, прямые, сплошные, без сопутствующих компонентов порового аппарата септ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Степанова А.А., Синицкая И.А.Ультраструктура клеток Aspergillus niger van. Thieghem. Вегетативный мицелий // Ж. 11роблемы мед. микологии . — 2003. — Т.5, №4. — С. 32-39.
2. Степанова А.А., Синицкая И.А. Ультраструктура Trichophyton mentagrophytes var. interdigilale // Тез. докл. 7-х Кашкинских чтений, CI16., 2(Х)4. - С. 119-120.
3. Степанова А.А., Синицкая И.А. Субмикроскопическое изучение клеток вегетативного мицелия Aspergillus fumigatus Fres. // Ж. 11роблемы мед. микологии. - 2004. - Т.6, №3. - С. 34-40.
4. Степанова А.А., Синицкая И.А.Ультраструктура клеток вегетативного мицелия Aspergillus flavus Link, выращенного in vitro II Ж. Проблемы мед. микологии. - 2006. - Т.8, №1. - С. 40-45.
5. Степанова А.А., Синицкая И.А. I (отология клеток вегетативного мицелия Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboshi, выращенного in vitro II Ж. Проблемы мед. микологии. - 2006. - Т.8, №3. - С. 22-28.
Поступила в редакцию: 27.03.07 Рецензент: А. Е. Васильев
