CC BY
82
УДК 602
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОВЕДЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА В МАКЕТЕ МЕДИАТОРНОГО БИОТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА
С.В. Возчикова, С.В. Алферов, Н.М. Носова
Разработан биоанод на основе иммобилизованной мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans. Подобраны содержания биокатализатора и сшивающего агента, при которых наблюдается эффективная работа полученного анода. Содержание мембранной фракции составило 0,15 мг/л, а концентрация используемого глутарового альдегида - 0,9 М. Была проведена электрохимическая оценка макета БТЭ на основе полученного биоанода. Величина максимального генерируемого потенциала составила 300±10мВ, операционная стабильность - не менее 10 последовательных измерений генерации потенциала, а долговременная стабильность - 5 суток.
Ключевые слова: биотопливный элемент, биоанод, мембранная фракция, бактерии Gluconobacter oxydans, иммобилизация.
В связи с истощением природных ресурсов ставится задача получения электроэнергии за счет жизнедеятельности объектов живой природы. Одним из решений этой задачи является использование микробного метаболизма в биотопливных элементах (БТЭ). БТЭ - это устройство, преобразующее химическую энергию органических соединений в электричество посредством их окисления микроорганизмами. В отличие от топливных элементов, работающих на водороде или метаноле, БТЭ могут использовать сточные воды биотехнологических производств, что делает их весьма эффективными средствами не только для производства электрической энергии, но и защиты окружающей среды от загрязняющих веществ, содержащихся в данных субстратах [1]. Перспективой применения биотопливных элементов является утилизация органических отходов с целью производства электроэнергии [2, 3]. Однако практическому применению БТЭ препятствуют низкие энергетические характеристики устройств. Изучение закономерностей преобразования энергии микробного метаболизма в электрическую энергию, а также стабилизация работы уже существующих систем и разработка новых элементов микробного топливного элемента являются основными аспектами по улучшению энергетических характеристик разрабатываемых устройств.
Основной задачей биокатализатора БТЭ является преобразование электрохимически неактивного топлива (углеводы, органические кислоты, спирты, а также органические отходы) и содержащиеся в нем химической энергии в электрическую энергию. БТЭ делятся на два типа, в зависимости
от вида биокатализатора: ферментные топливные элементы (ФТЭ) и микробные топливные элементы (МТЭ).
В качестве биокатализатора для БТЭ нашли применение уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans, обладающие особой метаболической системой - мембранной локализацией основных ферментов - дегидрогеназ [4]. Использование целых клеток бактерий в БТЭ устраняет необходимость выделения индивидуальных ферментов. Однако энергетические параметры ферментных топливных элементов значительно выше, чем для БТЭ на основе целых клеток [5,6]. Существует альтернатива использования ферментов в качестве биокатализаторов, получение которых является длительным и материально дорогим процессом, это применение мембранной фракции бактерий G. oxydans.
Ранее был разработан БТЭ на основе биокатализатора в суспендированном виде [1]. Применение такой формы биокатализатора не позволяет использовать его несколько раз, и создает потребность в его постоянном обновлении, что является экономически невыгодным. Иммобилизация биоматериала на поверхности анода позволяет многократно использовать применяемый биокатализатор, что увеличивает долговременную стабильность БТЭ, а также способствует более быстрому и эффективному переносу электронов на электрод [7]. Таким образом, для повышения эффективности работы макета БТЭ существует необходимость в разработке биоанодов длительного действия, содержащих биокатализатор, закрепленный на поверхности электрода.
Целью данной работы являлась проведение энергетической и метрологических характеристик разработанного биоанода биотопливного элемента (БТЭ) на основе иммобилизованной мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans.
Материалы и методы
Культивирование бактерий. В работе использовали бактерии Gluconobacter oxydans БиЬБр. МшМш (ВКМ В-1280) (Всероссийская коллекция микроорганизмов, ИБФМ РАН). Культивирование бактерий проводили на питательной среде следующего состава: Б-сорбит - 200 г/л; дрожжевой экстракт - 20 г/л; дистиллированная вода - 100 мл, рН среды -5,2-5,5, при температуре 28оС, в течение 18-20 ч. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 12000 g 12 мин и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором с рН 6,0.
Получение мембранной фракции бактерий. Разрушение бактерий G. oxydans производили с использованием ультразвукового диспергатора УЗД11-0,1/22 в натрий-фосфатном буферном растворе (рН 6,0). Время обработки ультразвуком составляло 2 мин при подаваемой мощности 100 Вт, рабочей частоте 22 кГц. Полученный лизат центрифугировали при 6500 g в течение 40 мин. Мембранные дегидрогеназы содержались в
надосадочной жидкости. Затем производили центрифугирование при 12300 g в течение 30 мин, что вызывало осаждение мембранной фракции бактерий. Надосадочная жидкость представляла собой цитоплазматическую фракцию. Полученные осадки в микропробирках подсушивали на воздухе, для каждой серии опытов в качестве биокатилизатора в биотопливном элементе использовали новую порцию мембранной фракции.
Иммобилизация мембранной фракции. Иммобилизацию мембранной фракции G. oxydans производили с использованием глутарового альдегида различной концентрации на поверхность графитового электрода (анода). Концентрация сшивающего агента варьировалась от 0,9 М до 2,8 М. Иммобилизация проводилась следующим образом: к 30 мг мембранной фракции добавляли 5 мкл 25 %-го глутарового альдегида, тщательно перемешивали и полученную суспензию наносили на графитовый электрод (высота нанесения 10 мм). Затем электрод с иммобилизованной мембранной фракцией G. oxydans оставляли на 30 мин на воздухе.
Формирование ячейки биотопливного элемента. Ячейка биотопливного элемента представляет собой две взаимосвязанные кюветы, объём анодного отделения равен объему катодного и составляет 3 мл. Электродами служат графитовые стержни диаметром 8 мм, площадь рабочей поверхности электродов - 300 мм . Высота погружения электродов в раствор - 10 мм. Связь кювет осуществляется через отверстие в стенке диаметром 6 мм. Камеры разделялись протонселективной мембраной МФ-4СК («Пластполимер», Санкт-Петербург, Россия) [8]. В качестве фонового раствора использовали 30 мМ натрий-фосфатный буфер рН=6,0, а в качестве медиаторов - 2,6-дихлорфенолиндофенол (концентрация в анолите 150 мкМ), феназинметасульфат (концентрация в анолите 25 мкМ) и гексацианоферрат калия (концентрация в католите 3 мМ). В качестве субстрата биоокисления использовали глюкозу с концентрацией в кювете 10 мМ.
Электрохимические измерения. Измерения потенциала проводили с помощью гальванопотенциостата IPC Micro ("Вольта", Россия). Для этой цели графитовые стержни погружали в электролитическую ячейку. Измерения проводили в натрий-фосфатном буферном растворе (рН 6,0) при постоянном перемешивании раствора магнитной мешалкой. Скорость перемешивания составляла 400 об/мин. Регистрацию ответов на добавку субстрата осуществляли с помощью персонального компьютера и программы управления гальванопотенциостатом IPC 2000 после установления стационарного состояния электрода. Оценку электрических характеристик производили после достижения стационарного значения генерируемого потенциала.
Измеряемым параметром в процессе биокаталитического окисления субстрата в режиме генерации потенциала являлась величина разности потенциалов за время проведения эксперимента.
Обсуждение результатов
Для эффективной работы макета БТЭ необходимо подобрать количество биокатализатора, иммобилизуемого на поверхность анода, при котором будет наблюдаться максимальное значение генерируемого потенциала. Абсолютные значения генерируемых потенциалов в зависимости от содержания иммобилизованного биокатализатора на основе мембранной фракции G. oxydans в макете БТЭ представлены на рис. 1.
160 -140 -120 -100 -
Ш
2 80 -
Ш
60 -40 -20 -0 -
Рис. 1. Абсолютные значения генерируемых потенциалов в зависимости от содержания иммобилизованного биокатализатора на основе мембранной фракции (мг/л) С. охуйат
Из рис. 1 видно, что максимальное значение генерируемого потенциала наблюдается при использовании 0,15 мг/л мембранной фракции. При содержании выше 0,15 мг/л мембранная фракция находится в избытке, по отношению к субстрату, в результате чего снижается величина генерируемого потенциала. Следует отметить, что при использовании иммобилизованного биокатализатора для достижения максимального значения генерируемого потенциала, количество мембранной фракции в 7 раз ниже, чем для суспензии мембранной фракции бактерий G. oxydans, концентрация которой была установлена ранее и составляла 1 мг/л.
Одним из важных энергетических параметров, характеризующих эффективность функционирования биотопливного элемента, является генерируемый потенциал. Была проведена оценка зависимости
1 Т
г
Т---1---1---1--1-—г
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Содержание мембранной фракции, мг/л
генерируемого потенциала от времени для биотопливных элементов, содержащих в своем составе биоаноды, изготовленные при использовании различных концентраций глутарового альдегида.
Из полученных данных, представленных в таблице, следует, что максимальным значением генерируемого потенциала характеризуется элемент, который содержит анод, при создании которого был, использован глутаровый альдегид с концентрацией 0,9 М. Для данного биотопливного элемента генерируемый потенциал в режиме разомкнутой цепи составляет 364 ± 3 мВ, а при замкнутой внешней цепи - 238 ± 6 мВ, время генерации максимального потенциала 45 мин. Полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании этой концентрации глутарового альдегида активность ферментов мембранной фракции достаточно высокая.
Генерируемый потенциал при разомкнутой и замкнутой внешней цепи
Концентрация глутарового альдегида, М Генерируемы м й потенциал, В Время генерации, мин
Разомкнутая внешняя цепь Замкнутая внешняя цепь Разомкнутая внешняя цепь Замкнутая внешняя цепь
0,7 327 ± 4 193 ± 8 61 47
0,9 364 ± 3 238 ± 6 60 45
1,4 243 ± 5 213 ± 2 66 46
1,9 273 ± 6 165 ± 3 65 48
2,8 190 ± 5 79 ± 4 70 50
Сравнительная оценка значений генерированного потенциала для БТЭ на основе различных биокатализаторов показала, что для иммобилизованной мембранной фракции бактерий О. охуйат генерируемый потенциал составил 300±10 мВ. Данный показатель практически в три раза выше по сравнению с суспензией клеток микроорганизмов, для которых значение генерируемого потенциала составляет 120±10мВ, для иммобилизованных целых клеток значение величины генерируемого потенциала - 250±10мВ, а суспензии мембранной фракции - 220±10мВ.
Операционная стабильность является одной из важнейших характеристик работы электрода. Она показывает устойчивость величины генерируемого потенциала при добавлении одной и той же концентрации субстрата при проведении большого числа последовательных измерений. Для определения операционной стабильности было проведено 10 последовательных измерений генерации потенциала с концентрацией глюкозы в анодном отделении 10 ммоль/л (рис. 2).
340 320 300
£С 280 £
ш' 260 240 220 200
0123456789 10 11
Количество измерений
Рис. 2. Операционная стабильность с иммобилизованным биокатализатором на основе мембранной фракции G. oxydans
Количество последовательных измерений, благодаря использованию иммобилизованной мембранной фракции составляет не менее 10.
Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы электрода в течение длительного периода времени. За время стабильной работы иммобилизованного электрода принимается время, в течение которого величина генерируемого потенциала составляла не менее 50 % от первоначальной активности. Долговременную стабильность определяли путём ежедневного измерения величины генерируемого потенциала с концентрацией глюкозы в анодном отделении 10 ммоль/л (рис. 3).
350 300 250 со 200 150 100 50 0
0 2 4 6 8 10
Сутки
Рис. 3. Долговременная стабильность иммобилизованного биокатализатора на основе мембранной фракции G. oxydans
Как можно видеть падение значения генерируемого потенциала ниже на 50% от начального при добавлении субстрата наблюдается после 5 суток, таким образом, иммобилизация мембранной фракции позволяет использовать такой биоанод не менее недели.
Заключение
В ходе проведения исследования был разработан биоанод с иммобилизованной на его поверхности биокатализатором - мембранной фракции бактерий G. oxydans. Установлено, что применение биоанода позволяет проводить не менее 10 последовательных измерений, а значение генерированного потенциала в БТЭ на основе иммобилизованной мембранной фракции бактерий G. oxydans выше, чем для БТЭ на основе других биокатализаторов.
Работа выполнена в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки РФ ГЗ 2014/227 (проект № 1764) и проектной части государственного задания Минобрнауки РФ № 14.2094.2014.
Библиографический список
1. Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans как биокатализаторы в медиаторном биотопливном элементе / С.В. Алферов, О.А. Воеводская, В.Т. Нгуен [и др.] // Сенсорные системы. 2011. Т. 25. № 4. С. 346-351.
2. Microbial fuel cell as new technology for bioelectricity generation: A review / M. Rahimnejad, A. Adhami, S. Darvari [et al.] // Alexandria Engineering J. 2015. V. 54. № 3. P. 745-756.
3. Microbial fuel cells for wastewater treatment / P. Aelterman, K. Rabaey, P. Clauwaert [et al.] // Water Science & Technology. 2006. V. 54. № 8. P. 9-15.
4. Луста К. А., Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. Вып. 4. С. 339-353.
5. Osman M.H., Shah A.A., Walsh F.C. Recent progress and continuing challenges in bio-fuel cells. Part I: enzymatic cells // Biosensors and Bioelectronics. 2011. V. 26. P. 3087-3102.
6. . Osman M.H., Shah A.A., Walsh F.C. Recent progress and continuing challenges in bio-fuel cells. Part II: Microbial // Biosensors and Bioelectronics. V. 26. P. 953-963.
7. Иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans на аноде биотопливного элемента / П.Р. Минайчева, С.В. Алферов, В.А. Арляпов [и др.] // Вода: Химия и экология. 2013. №2. С. 34-41.
8. Тимонов А.М. Твердые полимерные электролиты: структура, свойства и применение // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 8. С. 69-75.
Возчикова Софья Вадимовна, магистрант, vosofya@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Алферов Сергей Валерьевич, канд. хим. наук, доц., s.v.alferovagmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Носова Наталья Михайловная, канд. хим. наук, доц., nata2780ayandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
Electrochemical evaluation of immobilized membrane fraction of bacteria Gluconobacteroxydans in the layout of the biofuel cell
S.V. Vozchikova, S.V. Alferov, N.M. Nosova
A bioanode based on the immobilized membrane fraction of bacteria Gluconobacter oxydans has been developed. Biocatalyst and crosslinking agent contents have been optimized. The content of the membrane fractions was 0.15 mg/L, and the concentration of gluta-raldehyde was 0.9 M. Electrochemical evaluation of the obtained bioanode was carried out. The observed value of the maximum potential was - 300 ± 10 mV, operational stability - not less than 10 consecutive measurements of generation of potential and long-term stability - 5 days.
Key words: Biofuel cell, bioanode, membrane fraction of bacteria Gluconobacter oxydans, immobilization.
Vozchikova Sofia Vadimovna, master student, vosofyaagmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Alferov Sergey Valerievich, PhD, associate professor, s. v.alferovagmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Nosova Natalia Mikhailovna, PhD, associate professor, nata2 780@,yandex. ru, Russia, Tula, Tula State University
