CC BY
124
■■■■■ ммм 4.
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 118-121
Эктромелия лабораторных мышей и методы её диагностики
Э.Х. Абдрашитова, Л.А. Конопленко
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Ш
Описаны клинические признаки эктромелии лабораторных мышей, патолого-анатомичес-кие изменения, методы выделения и идентификации вируса, диагностика заболевания.
Ключевые слова: эктромелия, лабораторные мыши, клинические признаки, диагностика, идентификация.
В настоящее время, несмотря на прогресс в технологии лабораторного животноводства, в питомниках у лабораторных животных можно обнаружить более 20 вирусов различных таксономических групп. Отсутствие патогенов, изначально установленное в вивариях при формировании колонии животных, не исключает последующего появления инфекции, даже при соблюдении всех мер предосторожности. Поэтому без проведения мероприятий по систематическому вирусологическому контролю невозможно обеспечить качество животных и предотвратить искажение результатов из-за невыявленных инфекций лабораторных животных.
Данная работа посвящена характеристике и методам диагностики эктромелии (оспы) мышей, вспышка которой может возникнуть в случае нарушения барьерной системы и проникновения диких грызунов в помещения лабораторных животных [1, 2, 3, 5].
Вирус эктромелии относится к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae. Это крупный вирус, имеющий сложную структуру Форма блочная, размер 250-300 х 150200 нм. Вирус покрыт внешней оболочкой с ворсинками. Вирион содержит двухцепочечную ДНК и белок [4]. Вирус устойчив к эфиру и фенолу, долго сохраняется в глицерине. Но даже сравнительно невысокая температура (55 ОС) убивает его в течение 30 мин.
118
К заболеванию чувствительны животные всех возрастов, однако, чувствительность разных линий мышей различна. Наиболее тяжело поражаются линии мышей СВА/Lac, DBA/2, BAIB/c, а линия C57BL/6 относительно резистентна и часто инфицирована латентно [1]. Инфекция передается алиментарным, аэрогенным, контактным путями, встречается также трансплацентарная передача вируса и трансмиссивная.
Заболевание может протекать латентно, остро и подостро. Животные с латентной формой не проявляют никаких признаков заболевания. Инфекция в этом случае может активизироваться с помощью различных факторов, например при облучении, транспортировке, заражении другими возбудителями, экспериментальной нагрузке.
При молниеносной форме клинические симптомы не успевают проявиться, и гибель мышей наступает неожиданно и быстро. Подострая форма представляет классическую форму эктромелии. В таких случаях у животных, преимущественно на голове, хвосте и лапах развиваются кожные поражения. Кожа отёчна, гипереми-рована, с мелко очаговыми геморрагиями, которые покрываются сухими корочками. В последующем на пальцах, ушах и хвосте образуются очаги некроза, покрытые тёмно-бурыми корочками, которые затем отпадают. Иногда происходит ампутация конечностей или фаланг пальцев и хвоста.
ш
Эктромелия лабораторных мышей и методы её диагностики
Острая форма заболевания сопровождается интенсивным поражением внутренних органов. На вскрытии печень бледножёлтая или серо-жёлтая, пёстрая из-за чередования некротических и геморрагических участков. Селезёнка иногда увеличена с очагами некрозов, В кишечнике — некротический энтерит, в ряде случаев тотально распространяющийся на всю стенку, с массивными фибринозными наложениями и кровоизлияниями. В очень тяжёлых случаях в лёгких развивается острая диффузная пневмония некротически-геморрагического характера.
При хронической форме заболевания поражения внутренних органов непостоянны и неспецифичны. Можно наблюдать только гиперплазию селезёнки и лимфатических узлов. В очагах поражения кожи, в дегенерирующих эпителиальных клетках могут встречаться крупные цитоплазматические тельца — тельца Маршала. Они наблюдаются и в поджелудочной железе. В клетках других тканей развиваются характерные цитоплазматические включения, часто многочисленные, так называемые включения Като типа А и В. Во включениях типа В с помощью флюоресцирующих антител обнаруживается вирусный антиген. Включения встречаются в эпителиальных клетках и фибробластах многих органов.
Лабораторная диагностика эктромелии основывается на использовании следующих методов исследования:
1) серологические тесты реакции диффузной преципитации и реакции торможения гемагглютинации;
2) метод иммунофлюоресценции;
3) метод иммуноферментного анализа;
4) выделение возбудителя на куриных эмбрионах;
5) электронная микроскопия.
Реакция диффузной преципитации в агаре (РДП) используется для обнаружения и идентификации антигена, а также обнаружения и титрования антител к вирусу оспы в исследуемых сыворотках. Суть этого ме-
тода заключается в том, что одноимённые специфические антиген и антитело, помещённые на определённом расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют и образуют при встрече друг с другом преципитат в виде белых полос. Каждая из этих линий соответствует только одной системе антиген-антитело. В случае несоответствия антигена и антитела, полосы преципитации не появляются.
Для постановки РДП необходима следующие ингредиенты: испытуемый вирусосодержащий материал (везикулярная, пустулёзная жидкости кожных элементов или корочки от больных животных с подозрением на оспу) или испытуемые сыворотки; стандартные специфические сыворотки и специфический антиген для диагностики вирусов оспенной группы; нормальные сыворотки мышей; 1%-ный агаровый гель, который должен быть прозрачным, достаточно плотным, стерильным, со слабощелочным pH.
Дно чашек Петри покрывают расплавленным агаром, в котором (после его затвердевания) вырезают лунки. Центральную лунку заполняют сывороткой, содержащей антитела к искомому антигену. В периферические лунки вносят испытуемый материал (искомый антиген) и нормальную контрольную сыворотку. Инкубируют во влажной камере в течение 24— 48 часов. Появление линий преципитации указывает на наличие антигена.
Для определения наличия антител к вирусу оспы в сыворотке крови испытуемых мышей центральную лунку заполняют специфическим антигеном, а периферические — исследуемыми сыворотками. Контролем служат лунки с нормальной и специфической сывороткой. Реакция считается положительной, если между лунками с антигеном и испытуемыми сыворотками образуются линии преципитации.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на способности антител подавлять гемагглютинирующую актив-
11111
Э.Х. Абдрашитова, Л.А. Конопленко
ность соответствующего вируса. К смеси вирус оспенной группы + исследуемая сыворотка добавляют эритроциты, которые при отсутствии специфических антител в сыворотке будут агглютинированы вирусом.
Для постановки РТГА при индикации вирусов эктромелии необходимы следующие составляющие: вирусосодержащий материал, специфические и исследуемые сыворотки, физиологический раствор, эритроциты петуха-донора из вивария.
Методика состоит из нескольких этапов и заключается в следующем.
Исследуемые сыворотки мышей, разведенные в физиологическом растворе в соотношении 1:5, инактивируют при 56 ОС в течение 30 мин. Далее сыворотки разводят двукратно, начиная с 1:10 до 1:1280. С этой целью в лунки плашки вносят по 0,025 мл физиологического раствора. В первую лунку ряда вносят 0,025 мл исследуемой сыворотки и раститровывают (смешивают, переносят 0,025 мл предыдущего разведения в следующую лунку, перемешивают и т.д.).
В приготовленные разведения сыворотки добавляют 0,025 мл тест-антигена в рабочем разведении. Титр антигена определяют непосредственно перед постановкой РТГА. После встряхивания, в каждую лунку добавляют по 0,025 мл суспензии эритроцитов. Плашки вновь встряхивают и выдерживают в покое при комнатной температуре в течение 1 часа.
Учитывают опыт: титр данной сыворотки с использованием данного антигена — это максимальное её разведение, которое полностью ингибирует гемагглютинацию.
Одновременно с постановкой основного опыта РТГА ставят контроль известной положительной сыворотки к вирусу оспы и контроль рабочей дозы тест—антигена.
Метод иммунофлюоресценции или метод флюоресцирующих антител (МФА) относится к экспресс-методам и позволяет быстро обнаружить вирус в патологическом материале. Основу метода составляет
120
реакция между антигеном и специфическим по отношению к нему антителом. Меченые флюорохромом противовирусные антитела при нанесении на исследуемый мазок прочно связываются с гомологичным антигеном, образуя светящийся комплекс антиген—антитело. Если антиген не соответствует антителу, находящемуся в данной сыворотке, то при промывании препарата такие антитела легко смываются.
Для постановки прямой реакции иммунофлюоресценции готовят на предметных стёклах мазки-отпечатки из содержимого кожных поражений и органов больных эктромелией мышей. Окрашивают фиксированные препараты флюоресцирующим иммуноглобулином, отмывают в двух порциях 0,01 М раствора фосфатного буфера с pH 7,2—7,4, помещают под покровное стекло и исследуют под люминесцентным микроскопом.
Результаты считают положительными, если в исследуемом препарате обнаруживают клетки, имеющие ярко-зелёное свечение в цитоплазме. В качестве обязательного контроля берут препараты из материалов, не содержащих искомого вируса оспы, и препараты, обработанные мечеными антителами, гетерологичными по отношению к искомому вирусу. В контрольных препаратах специфическая флюоресценция не выявляется.
Метод иммуноферментного анализа (ЭЛИЗА) используют для выявления антигена ортопоксвирусов в везикулярной и пустулёзной жидкостях, суспензии корочек и других материалов, взятых от больных животных. Суть метода та же, что и у МФА, с той лишь разницей, что специфические антитела мечены ферментом (обычно пероксидазой).
Схема такова. Стенки лунок микротит-ратора из тест-набора с адсорбированным на них оспенным гамма-глобулином отмывают для удаления избытка специфических антител. Затем добавляют испыту-
I I I I I
Эктромелия лабораторных мышей и методы её диагностики
емый материал, содержащий антиген, который связывается с антителами, адсорбированными в лунках. В лунки добавляют антитела, меченные ферментом, специфические для вирусного антигена. Они соединяются с ранее образовавшимся комплексом антиген-антитело. После инкубации избыток удаляют промыванием. Для выявления иммунного комплекса добавляют индикатор фермента, который гидролизуется фиксированным ферментом с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена. Оптическая плотность, определяемая на спектрофотометре, прямо пропорциональна количеству фермента, фиксированному в лунке. Последнее соответствует количеству искомого антигена в опытной пробе.
Использование куриных эмбрионов для выделения и культивирования вируса эк-тромелии — наиболее доступный и удобный метод.
Используют развивающиеся куриные эмбрионы, которые в возрасте 11-13 дней заражают суспензией, приготовленной из патологического материала. Инокуляцию производят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО). Очаги поражения на оболочке изучают на тёмном фоне. Для пассирования вируса из оболочки готовят суспензию. Обычно в серии пассажей выделенный вирус образует на ХАО характерные множественные очаги поражения с геморрагическим центром.
Патологические очаги исследуют методом электронного микроскопирования. При-
готовленные препараты подвергают негативному контрастированию раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и просматривают в электронном микроскопе. Диагноз считается положительным при наличии в препаратах одиночных или расположенных группами оспенных вирионов характерной блочной формы с закруглёнными краями, размером 250-300 х 150-200 нм, с белковой оболочкой, образованной трубчатыми филаментами диаметром 9 нм.
В заключение необходимо отметить, что систематическое проведение контроля вирусной контаминации лабораторных животных и тестирование их на носитель-ство различных вирусов позволяет своевременно проводить коррекцию их статуса по соответствующему стандарту
Литература
1. Ефимов В.И., Лаукайтис В.А. Серологический скрининг вирусных инфекций, методы и результаты. Лаб. животные, 1993. Т. З. № 1, с. 15-21.
2. Майборода А.Д. Линейные мыши и свойственные им вирусы как объекты для моделирования в вирусологии. Вестник АМН СССР, 1983, № 9, с. 68-71.
3. Майборода А.Д. Вирусные инфекции лабораторных мышей и их распространение. Вопр. вирусол., 1984, № 1, с. 8-13.
4. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. В кн. Ветеринарная вирусология. М.: Колос, 1984, с. 46-48.
5. Diniz S., Frindade J.S., Fonseca F.J., Kroon E.J. Surto de variola murina em camundongs suicos em bioterio: relato de caso. Arg. Brasil. Med. Veter Zootech. 2001, v. 53, No. 2, 152-156.
ECTROMELIA VIMS OF LABORATORY MICE AND METHODS OF DIAGNOSIS E.Kh. Abdrashitova. L.A. Konoplenko
Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Clinical signs of the ectromelia of laboralory mice, pathological and anatomical changes, methods of virus isolation and identification, and diagnosis of disease are described.
Key words: ectromelia, laboratory mice, clinical signs, diagnosis, identification.
