CC BY
65
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICOCHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 542.06
DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2018-8-4-73-82
ЭКСТРАКЦИОННОЕ ВЫМОРАЖИВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ НОВОГО ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ПОЛУЧЕНИЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
© В.Н. Бехтерев***, В.И. Маляровская**
* Сочинский государственный университет
354024, Российская Федерация, г. Сочи, ул. Советская, 26а
** Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур 354002, Российская Федерация, г. Сочи, ул. Яня Фабрициуса, 2/28
РЕЗЮМЕ. Эффективность воздействия на организм растительных лечебных препаратов и биологически активных добавок (БАД) к пище зависит от их компонентного состава, содержания действующих веществ. Для производства БАД довольно часто применяется экстракция. Однако применяемые технологические схемы для повышения селективности извлечения вынуждены включать дополнительные этапы сепарации и очистки.
Целью данного исследования было повышение избирательности выделения стероидных сапонинов из растений на примере иглицы (Ruscus ponticus), экстракт которой широко используют для лечения ряда расстройств. В основу нового подхода к получению биологически активных веществ иглицы в лабораторных условиях был положен метод экстракционного вымораживания в сочетании с центрифугированием. Возможность удаления сахаридов из исходного извлечения предложенным способом базировалась на ранее полученных экспериментальных данных и разработанной теоретической модели. Предложенная технология подробно описана. В результате с помощью спектро-фотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено, что способ позволяет на этапе экстракции значительно снизить содержание моно- и дисахаридов в конечном продукте по сравнению с используемым в настоящее время методом получения сухого экстракта иглицы на основе этанольного извлечения. Кроме того, разработанная технология исключает этапы фильтрации и обезвоживания экстракта.
Ключевые слова: экстракционное вымораживание, иглица понтийская (Ruscus ponticus), сапонины, сахариды.
Информация о статье. Дата поступления 30 июля 2018 г.; дата принятия к печати 25 ноября 2018 г.; дата онлайн-размещения 29 декабря 2018 г.
Для цитирования: Бехтерев В.Н., Маляровская В.И. Экстракционное вымораживание в качестве нового технологического подхода к получению растительных биологически активных веществ // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2018. Т. 8, N 4. С. 73-82. DOI: 10.21285/2227-2925-2018-8-4-73-82
FREEZE-EXTRACTION TECHNOLOGIES FOR OBTAINING BIOLOGICALLY-ACTIVE SUBSTANCES OF PLANT ORIGIN
© V.N. Bekhterev***, V.I. Malyarovskaya*
* Sochi State University
26a, Sovetskaya St., Sochi, 354024, Russian Federation
** All-Russian Scientific and Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops 2/28, Jan Fabricius St., Sochi, 354002, Russian Federation
ABSTRACT. The effectiveness of herbal medicine preparations and dietary supplements is determined by their composition, especially in terms of active ingredient content. Dietary supplements are frequently produced by plant extraction methods. However, the desired selectivity of extraction can only be achieved with the application of additional separation and purification stages.
The purpose of this study was to increase the selectivity of steroidal saponin extraction from plants on the example of ruscus (Ruscus ponticus), the extract of which is widely used to treat a number of disorders. The presented new approach to the production of biologically active substances from ruscus under laboratory con-
ditions is based on the method of fractional freezing in combination with centrifugation. The possibility of using the proposed technology for extracting saccharides from the original extract has been confirmed by the previously obtained experimental data and the developed theoretical model. The proposed technology is described in detail. The methods of spectrophotometry and high-performance liquid chromatography have shown that the content of mono- and disaccharides in the final product obtained by the presented technology is significantly lower that that obtained by the conventional ethanol extraction. Another advantage of this technology consists in the elimination of the extract filtration and dehydration steps. Keywords: fractional freezing, Ruscus ponticus, saponins, saccharides
Information about the article. Received July 30, 2018; accepted for publication November 25, 2018; available online December 29, 2018.
For citation: Bekhterev V.N., Malyarovskaya V.I. Freeze-extraction technologies for obtaining biologically-active substances of plant origin. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2018, vol. 8, no. 4, pp. 73-82. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-29252018-8-4-73-82
ВВЕДЕНИЕ
Терапевтическая ценность лекарственных препаратов из растений давно и хорошо всем известна. Она определяется входящими в их состав биологически активными веществами (БАВ), которые после детального установления их биохимических свойств применяются в качестве пищевых БАД или становятся прототипами синтетических лечебных препаратов. Различные БАВ (витамины, ферменты, минеральные соли, микроэлементы и др.), содержащиеся в растениях, оказывают на организм человека то или иное воздействие и в целом обеспечивают нормальное течение обменных процессов.
Поэтому и сегодня интерес к растениям как источникам БАВ не снижается. В этой связи актуальны поиск новых способов получения БАВ и расширение спектра растений в качестве их ресурса.
Количество БАВ в растениях зависит от его вида, условий произрастания, времени сбора, способа сушки и т.д. Перечень применяемых ме-
тодов выделения природных органических веществ из растительных объектов широк. Эффективность того или иного метода зависит от химической природы целевых компонентов, физико-химических характеристик экстракционной системы, в том числе особенностей объекта исследования. Разработка новых способов экстракции обусловлена, прежде всего, необходимостью повышения ее селективности, снижения химического и термического воздействия на экстрактивные вещества, улучшения экономических показателей.
В табл. 1 условно выделено и рассмотрено несколько технологических подходов к экстракции БАВ из растительного материала.
Следует отметить, что после получения экстрактов указанными способами далее необходимо осуществить ряд трудоемких операций: отделить дисперсные частицы и водную часть (обезвоживание), сконцентрировать экстракт. Это требует значительного количества химической посуды и лабораторной техники.
Таблица 1
Методы экстракции БАВ из лекарственных растений
Table 1
Methods of extraction from medicinal plants
Способ Достоинства Недостатки Ссылка
Извлечение кипящим растворителем, Cокслет-экстракция Высокая эффективность Высокая температура, препятствующая получению термолабильных БАВ [1, 2]
Сверхкритическая флюидная экстракция Селективность, низкая температура процесса, низкая токсичность экстрагента (обычно СО2) Недостаточная эффективность извлечения веществ низкой и средней полярности, сложное техническое оснащение [3]
Ультразвуковая экстракция Извлечение термически нестабильных веществ, сокращение времени экстрагирования Неполнота извлечения, вредное действие УЗ на оператора [4]
Микроволновая экстракция Сокращение времени экстракции и количества экстрагента Сложное аппаратурное оформление [5]
Субкритическая экстракция Укоренная экстракция, высокая эффективность извлечения, малый расход экстрагента Неприемлем для извлечения термически нестабильных веществ, сложное аппаратурное оформление [6]
В предложенном в 2007 г. способе экстракционного вымораживания (ЭВ) - extractive freezing-out (EF), перечисленные процедуры объединены в одну стадию, что выгодно отличает его от перечисленных выше методов [7-10].
Данный метод, сочетая одновременно экстракцию и вымораживание, основан на перераспределении целевых веществ между жидкой органической фазой незамерзающего растворителя и кристаллизующейся водной частью экстракционной системы. В исследуемый водо-содержащий образец добавляют смешивающийся с водой растворитель, например ацето-нитрил, ацетон, или ограниченно растворимую органическую жидкость, например, этоксиэтан, бутанол, с последующим охлаждением и замораживанием водной части пробы [7-9]. В итоге в незамерзающий органический растворитель, выделяющийся отдельной жидкой фазой на поверхности льда, переходят извлекаемые органические вещества.
Применению ЭВ способствует ряд его важных качеств. В отличие от обычного вымораживания [11], когда замораживается часть водного раствора или вытяжки, ЭВ обладает избирательностью [8, 12], а также возможностью устранения ионного фона и растворенных неорганических веществ. Существенным достоинством ЭВ перед сорбцией [13] и твердофазной экстракцией [14] является отсутствие затруднений при исследовании дисперсных систем [15, 16], что важно при работе с растительными объектами. Эффективностью и избирательностью можно управлять, варьируя рН среды, полярность экстрагента и температуру. Экстракционное вымораживание позволяет использовать гидрофильные экстрагенты без дополнительной модификации пробы, в том числе «высаливания». А экстракты, получаемые с применением ацетонитрила, совместимы с обращенно-фазо-вым вариантом ВЭЖХ-анализа. Следует добавить, что разъединение отдающей и принимающей фаз при ЭВ в отличие от традиционной жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) [17] необычайно просто и заключается лишь в декантации полученного экстракта с поверхности застывшего льда.
В дальнейшем для повышения эффективности отделения экстракта от водной кристаллической части метод ЭВ был модифицирован: процесс осуществляют одновременно с центрифугированием пробы, т.е. в поле центробежных сил [18-20]. Процедура ЭВ без центрифугирования сопровождается образованием жидких микровключений и множества трещин в объеме льда, куда за сч ет капиллярных сил частично втягивается жидкая органическая фаза, т.е. экстракт. По этой причине снижение доли экстрагента в исходном образце его смеси с водой, начиная с объемного соотношения аценонитрил : вода = 1 : 3,3, приводит к тому, что уже вся масса экстракта оказывается включенной в объем льда [10]. И, как следствие, несмотря на высокую степень извлечения экстрагируемых веществ, невозможно было достичь степени концентрирования более 3-4 крат. Выполняя ЭВ в условиях центрифугирования образца, удается избежать растрескивания льда. В этом случае уже можно достичь соотношения экстрагента с водным раствором в исходной смеси 0,4:10 и, следовательно, повысить степень концентрирования целевых веществ до 25-крат и выше [19, 20].
Для объяснения установленных закономерностей, а также количественной оценки способности целевого вещества распределяться между водной матрицей и экстрагентом предложена модель, базирующаяся на подобии процесса ЭВ и адсорбции [10]. Предполагалось, что во время охлаждения смеси исследуемого водного раствора с экстрагентом молекулы извлекаемого вещества выталкиваются на поверхность образующихся кристаллов воды, после чего они десорби-руются в объем незамерзающей органической жидкой фазы органического растворителя. Одновременно протекает и обратный процесс: молекулы экстрагируемого вещества сорбируются поверхностью кристаллов льда. Для описания устанавливающегося равновесия между содержанием аналита в получаемом экстракте и на поверхности кристаллов льда применена модель Ленгмюра локализованной мономолекулярной адсорбции на однородной поверхности. Схему-механизм процесса можно представить в виде квазихимической реакции:
Занятый адсорбционный центр
Свободный адсорбционный центр
Молекула в жидкой фазе (экстракте)
В таком случае для константы равновесия
Keq справедливо уравнение:
Keq =
Corg Х Cs
(1)
где согд - концентрация вещества в жидкой фазе, экстракте, мкг-см-3; с5 - концентрация свободных адсорбционных центров, см2; *с3 - концентрация занятых адсорбционных центров, см-2.
С увеличением доли экстрагента в исходной смеси растет объем экстракта [7-10]. Согласно условию экстракционного равновесия (1) это должно сопровождаться возрастанием числа десорбирующихся с твердой поверхности молекул экстрагируемого компонента, что ведет к повышению концентрации свободных адсорбционных центров. В первом приближении такую зависимость концентрации свободных адсорбционных центров от объема экстрагента
+
*
c
s
можно представить в виде:
cs = a ' Vextr
(2)
где а — коэффициент пропорциональности, см- ; Уех{г - объем добавленного в пробу экстра-
3
гента, см .
Аналогично концентрация занятых адсорбционных центров растет пропорционально общему количеству целевого вещества в образце, т.е. его исходной массе в пробе М0:
С = ß • M0,
(3)
где ß - коэффициент пропорциональности,
-1 -2 мкг -см .
Замена трудноизмеряемых параметров cs и *cs вполне конкретными характеристиками условий экстракции, исходной массой экстрагируемого вещества в пробе M0 и объемом экстрагента Vextr, учитывая (2) и (3), приводит к уравнению:
eq ßx M0
откуда
, Keq xß Corg |X
V.
extr
Mo 1_ I Mo
- Keq x\ V.
extr
(4)
(5)
где К*ед = Р • Кед /а
Большой массив экспериментальных результатов [8, 10] свидетельствует в пользу предложенной модели ЭВ. Полученные коэффициенты распределения К*ед существенным образом зависели от природы экстрагируемых веществ. Установлено, что рост гидрофильности извлекаемого из водной матрицы вещества сопровождается снижением его коэффициента распределения К%, а следовательно, и эффективностью его выделения в экстракт.
В таком случае, основываясь на данной модели процесса и ставя целью повышение избирательности выделения сапонинов иглицы из первичного экстракта, можно рассчитывать, что наиболее гидрофильные вещества, в том числе сахариды, останутся в кристаллизующейся водной части пробы во время экстракционного вымораживания с центрифугированием (ЭВЦ).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В настоящей работе ЭВЦ использовано для выделения стероидных сапонинов из иглицы пон-тийской, реликтового растения третичного периода, распространенного в Крыму и на Кавказе. В медицине сапонины применяются для профилактики и лечения варикозного расширения вен, оказывая положительное влияние на реологию крови и стенки кровеносных сосудов [21]. Процесс ЭВЦ осуществляли с использованием криоэкс-трактора (ООО «ХИМБИОМЕД», Россия), ранее примененного в работе [16].
Высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на аналитическом комплексе-хрома-
тографе «Accela-600» (Thermo Scientific) в пробах диодно-матричным детектированием определяли рускогенин, а сахариды - рефрактометрическим детектированием. Спектрофотометрически на приборе SPECORD-40 (Analytik Jenа) оценивали общее сравнительное содержание сапонинов в образцах. Для концентрирования экстрактов и удаления растворителя применяли вакуумно-ротационный испаритель «Rotavapor R215» (Buchi) и сушильный шкаф-термостат с механической конвекцией FD 53 (Binder).
После оптимизации процедуры предложенная технология экстракции сапонинов из иглицы состояла из следующих стадий:
1) смесь высушенных на воздухе измельченных корней и корневищ массой 50 г. Помещали в коническую стеклянную колбу с обратным водяным холодильником; добавляли 300 мл 70%-ного раствора ацетонитрила в воде и проводили извлечение БАВ из биоматериала в кипящем экстрагенте в течение 2 ч;
2) охладив полученный экстракт до комнатной температуры по »12 мл переносили в закрываемые полиэтиленовыми пробками пеницилли-новые флаконы, при необходимости уравнивая на весах с точностью 0,01 г путем добавления экстракта;
3) флаконы с экстрактами помещали в ротор центрифуги лабораторной установки криоэкстрак-тора [16] для проведения этапа экстракционного вымораживания в поле центробежных сил; осуществляли выделение БАВ методом ЭВЦ при -28+2 °С в условиях вращения ротора 4000 об./мин в течение 20 мин, отделяя ацетонитрильное извлечение с БАВ от замерзшей водной фазы, которую после размораживания собирали в отдельной емкости и снова подвергали ЭВЦ (п. 2);
4) все полученные ацетонитрильные фракции объединяли в круглодонной колбе и концентрировали, удаляя растворитель на вакуумноро-тационном испарителе до объема »10 мл (давление 220-250 мБар, температура не более 45 °С);
5) отгоняемый ацетонитрил использовали для повторной экстракции (п. 2) 250 мл, добавляя воду и растворитель до необходимой кондиции (70% ацетонитрил в воде);
6) повторный экстракт также подвергали обработке по методу ЭВЦ (п. 2-5); объединив его с первым экстрактом (п. 5) и поместив в фарфоровую чашку; окончательно удаляли растворитель на воздухе в сушильном шкафу-термостате с механической конвекцией при 45 °С (время стадии около 24 ч);
В итоге получали 0,55 + 0,03 г сухого экстракта в виде светло-коричневого порошка.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Получаемые способом ЭВЦ ацетонитрильные экстракты практически не содержат воды, поскольку ее растворимость в ацетонитриле при -28 °С не превышает 4% [22].
:: Z! ■ ■ 2.Q 2: 2] 2 ■ - ■ ■ ■ e.q е f ■ : ■ ■ : :
а
ив ..........I..........Н...........h..........\....................Н...........i-..........i...........h.........
01iii5S7i 5 10
ь
Рис. 1. ВЭЖХ-хроматограмма водной (а) и ацетонитрильной (Ь) частей экстракта корней иглицы понтийской после процедуры ЭВЦ в режиме определения сахаридов
Fig. 1. HPLC-chromatogram of water (a) and acetonitrile (b) parts of the extract of the pontier needle root after the EEC procedure in the mode of determining the saccharides
Исследование ацетонитрильных экстрактов иглицы и водной части пробы на стадии ЭВЦ с целью определения сахаридов осуществляли методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием по методике, приведенной в руководстве Р 4.1.1672-031, в условиях:
- температура детектора - 36 °С;
- температура колонки - 35 °С;
- элюент - 20%-ный ацетонитрил в дистиллированной воде;
- скорость потока - 800 мкл/мин;
- колонка с аминопропильной фазой Restek Ultra Amino Columns (USP L8) 3 ^m (100 А), длиной 100 мм, внутренним диаметром - 3 мм;
- объем инжектируемой пробы - 10 мкл.
Оценку уровня суммарного содержания сапонинов в сухом экстракте проводили применяемым во Франции фотометрическим методом
Р 4.1.1672-03. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище; утв. и введено в действие главным государственным санитарным врачом РФ, первым заместителем министра здравоохранения РФ Г.Г. Онищенко 30.06.2003 г. R 4.1.1672-03. Rukovodstvo po metodam kontrolya kachestva i bezopasnosti biologicheski aknivnykh dobavok k pishche [R 4.1.1672-03. Guidelines for quality control and safety of dietary supplements]. Approved 30.06.2003.
«French Pharmacopoeia, 2007» [23]. Метод основан на регистрации поглощения продуктов взаимодействия сапонинов с концентрированной серной кислотой в области 395 нм после добавления ее к экстрактам, которое прямо пропорционально концентрации суммы сапонинов в образце. Измерения проводили на спектрофотометре.
На рис. 1 представлены ВЭЖХ-хроматограм-мы анализа углеводного состава полученных экстрактов подземной части иглицы после процедуры ЭВЦ, в том числе водной и ацетонитрильной фракции. Как видно из хроматограммы, исследование ацетонитрильных экстрактов иглицы и водной части пробы на стадии ЭВЦ позволило установить, что основная масса моно- и дисаха-ридов во время данного этапа остается в водной части извлечения.
Действительно, из хроматограмм, представленных на рис. 1, и данных, приведенных в табл. 2, следует, что в результате процедуры ЭВЦ содержание фруктозы в 7 раз, глюкозы более чем в 2 раза и сахарозы в 1,6 раза в водной фракции ЭВЦ-экстракта выше, чем в ацетонит-рильном экстракте. На наш взгляд, это связано с большой гидрофильностью углеводов. Известно, что из-за обилия гидроксильных групп в молекулах сахаридов они чрезвычайно легко растворяются в воде и хуже - в органических растворителях. Полученный результат объясним и в рамках рассмотренной выше теоретической моде-
ли ЭВ [8, 10], базирующейся на схожести данного процесса и адсорбции. С точки зрения данной модели вещества, молекулы которых имеют гидроксильные группы, как например, у са-харидов, в большей степени сорбируются на поверхности кристаллов воды, поскольку она подобна поверхности полярного сорбента и, соответственно, хуже извлекаются в органический экстракт при экстракционном вымораживании.
Таким образом, применение ЭВ на этапе извлечения целевых компонентов позволяет отделять, по крайней мере, углеводы от остальных фракций БАВ, оставляя их преимущественно в водной фазе: концентрация фруктозы, глюкозы и сахарозы в водной части существенно выше, чем в ацетонитрильной фракции.
Произведена также оценка содержания стероидных сапонинов, в том числе рускогенина, в получаемом сухом экстракте. С использованием стандартного образца рускогенина (HANGZHOU DINGYAN CHEM CO., LTD, CHINA) оптимизированы условия ВЭЖХ-разделения. Хроматограм-ма стандартного раствора рускогенина приведена на рис. 2.
Полученная калибровочная зависимость величины площади хроматографческого максимума рускогенина от его концентрации в растворе описывалась линейной функцией, коэффициент корреляции которой R = 0,9995.
На рис. 3 и 4 приведены спектры поглощения образцов сухого экстракта иглицы одинаковой массы, полученные по традиционной технологии экстракцией этанолом [1] и методом ЭВЦ.
Определение сахаридов методом ВЭЖХ в полученных фракциях экстракта после ЭВЦ ацетонитрильного экстракта иглицы понтийской (Ruscus ponticus)
Таблица 2
HPLC determination of saccharides in extract fractions after EHC of the pontic iglice (Ruscus ponticus) acetonitrile extract
Table 2
Экстракт Содержание сахарида, %
фруктоза глюкоза сахароза
Ацетонитрильная фракция (органическая фаза) экстракта 0,04 0,17 0,13
Водная часть экстракта 0,28 0,36 0,21
PA Name Reten ion Time
Area Heigh ® Ю N <0 Ю
fS (O
с TÍ
<D CT О О (A 3
ю (О ю CS Д
affeine) JO e41í)i "ö C3 Ä Ti 2 'ö и те (5 О
^ <0 C5 U 1 1 £ О 1) (Л n
Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограмма стандартного раствора рускогенина в ацетонитриле 80 мкг/мл: элюент - 75%-ный ацетонитрил в воде; скорость - 0,8 мл/мин; детектирование на Я = 210 нм; колонка с сорбентом Kromasil С18 (5 мкм) длиной 120 мм,внутренний диаметр - 2,1 мм
Fig. 2. HPLC chromatogram of a standard solution of ruskogenin in acetonitrile (80 jg/ml): eluent -75% acetonitrile in water; speed - 0,8 ml/min; detection at Я = 210 nm; a column with Kromasil C18 sorbent (5 jm) with a length of 120 mm, internal diameter - 2,1 mm
140
В0
я 60
40
20
0
3
4
5
6
8
4
Этанольный экстракт
Рис. 3. Спектр поглощения образца сухого экстракта иглицы понтийской, полученного по традиционной технологии при извлечении этиловым спиртом [1]: длина оптического пути - 1,0 см, относительно H2SO4 (конц.)
Fig. 3. Absorption spectrum of Pontius Eagle dry extract, obtained according to the traditional ethyl alcohol extraction[1]: optical path length 1,0 cm, relative to H2SO4 (conc.)
АН-экстракт свободных сапонинов
190 290 390 490 590
нм
Рис. 4. Спектр поглощения образца сухого экстракта свободных сапонинов из иглицы понтийской (30-кратное разбавление раствора), полученных по технологии эВц при извлечении ацетонитрилом: длина оптического пути - 1,0 см относительно H2SO4 (конц.)
Fig. 4. Absorption spectrum of free saponins dry extract from Pontic velvet (30-fold dilution of the solution), obtained by the EEC technology during acetonitrile extraction: the optical path length 1,0 cm relative to H2SO4 (conc.)
В табл. 3 сведены результаты определения рускогенина и сравнительной оценки общего содержания суммы свободных неконъюгиро-ванных сапонинов (так как при экстракции из биоматериала гидролиза не проводили) по оптической плотности при 395 нм, в конечных сухих экстрактах, на основании спектрофотомет-рических измерений по методике [23].
Из приведенных в табл. 3 данных следует, что содержание суммы сапонинов в экстрактах, полученных с помощью ЭВЦ, существенно выше аналогичного показателя для сухого экстракта, полученного традиционным путем (эта-
нольное извлечение): с учетом 30-кратного разбавления ЭВЦ-продукта и в соответствии с оценкой по оптической плотности - более чем в 8 раз. Подтверждением является и то, что содержание сапонина рускогенина в сухом экстракте по предложенной ЭВЦ-технологии в 29 раз выше, чем в продукте этанольной вытяжки, полученной по известному методу [1]. На наш взгляд, полученный результат достигнут благодаря снижению уровня содержания сахаридов в сухом экстракте при использовании метода ЭВЦ на стадии извлечения, что было продемонстрировано выше.
Таблица 3
Спектрофотометрическая оценка уровня содержания суммы сапонинов и определение рускогенина методом ВЭЖХ в сухих экстрактах образцов иглицы понтийской, произрастающей в районе г. Сочи
Table 3
Spectrophotometry assessment of total saponins and determination of ruskogenin by HPLC in dry extracts from Pontian needlefish growing in Sochi region
Анализируемый образец Масса навески, г Оптическая плотность, А, е.о.п. (395 нм) Рускогенин, % (ВЭЖХ)
Этанольный экстракт, получаемый по традиционной технологии [1] 0,0217 0,194 0,001
Ацетонитрильнй экстракт свободных сапонинов, получаемый по ЭВЦ-технологии 0,0219 1,601 0,029
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, предложено новое технологическое решение для получения природных БАВ, в частности, сапонинов из иглицы понтий-ской, на основе метода экстракционного вымораживания в режиме одновременного центрифугирования. На этапе извлечения целевых компонентов из подземной части растения удалось отделить углеводную составляющую из общей массы выделяемых природных органических веществ
1. Томашевская О.Ю., Даргаева Т.Д., Сокольская ТА. Изучение качественного состава и определение содержания фенольных соединений в корневищах иглицы шиповатой (Ruscus aculeatus L.) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2009. N 2. С. 42-44.
2. Guvenc A.^ Satir E., Coskun M. Determination of Ruscogenin in Turkish Ruscus L. Species by UPLC // Chromatographia Supplement. 2007. V. 66. P. 141-145.
3. Лунин В.В. СКФ-технологии и их развитие в мире // Сверхкритические флюиды. Теория и Практика. 2006. Т. 1. N 1. С. 3-8.
4. Romanik G., Gilgenast E., Przyjazny A., Kaminski M. Techniques of preparing plant material for chromatographic separation and analysis // Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2007. V. 70. P. 253-261.
5. Маркин В.И., Чепрасова М.Ю., Базарнова Н.Г. Основные направления использования микроволнового излучения при переработке растительного сырья (Обзор) // Химия растительного
и сконцентрировать в сухом экстракте стероидные сапонины. Выполненная оценка содержания суммы сапонинов в получаемом экстракте по предложенной ЭВЦ-технологии свидетельствует о том, что их концентрация значительно выше, чем дает применяемый в настоящее время метод экстракции этанолом. Сокращено количество этапов, расходных материалов и химической посуды, поскольку технология не требует фильтрации экстракта, удаления дисперсных частиц и пр.
ЕСКИЙ СПИСОК
сырья. 2014. № 4. С. 21-42.
6. Pronyk C., Mazza G. Design and scale-up of pressurized fluid extractors for food and bio-products // Journal of Food Engineering. 2009. V. 95 (2). P. 215-226.
7. Патент № 2303476 РФ. Способ извлечения органических веществ из водных сред экстракцией в сочетании с вымораживанием / В.Н. Бехтерев. Опубл. 27.07.2007. Бюл. № 21. Приоритет 27.04.2005.
8. Бехтерев В.Н. Выделение фенолов из воды экстракционным вымораживанием // Журнал аналитической химии. 2008. Т. 63. N 10. С. 1045-1049.
9. Бехтерев В.Н., Гаврилова С.Н., Кошкарева Е.В. Использование экстракционного вымораживания для решения фармакологических и биохимических задач // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т. 42. N 2. С. 44-46. DOI: https://doi.org/ 10.30906/ 0023- 1134-2008-42-2-44-46
10. Bekhterev V.N. Extractive freezing-out in the
analysis of organic compounds in the aqueous media // Mendeleev Communications. 2007. V. 17. P. 241-243.
11. Русинова АА., Полежаев Ю.М., Матерн А.И. Концентрирование растворов вымораживанием (обзор) // Аналитика и контроль. 1999. № 4. С. 4-10.
12. Бехтерев В.Н. Закономерности поведения растворенных органических веществ в условиях экстракционного вымораживания /(/Журнал аналитической химии. 2011. Т. 66. N 6. С. 608-613.
13. Когановский А.М., Клименко Н.А., Левченко Т.М., Рода И.Г. Адсорбция органических веществ из воды. Л.: Химия, 1990. 256 с.
14. Poole S.F., Wilson I.D. Solid-phase extraction // Journal of Chromatography A. 2000. No. 1-2. P. 1-465.
15. Бехтерев В.Н., Гаврилова С.Н., Козина Е.П., Маслаков И.В. Экспресс-определение кофеина в крови методом экстракционного вымораживания //'Судебно-медицинская экспертиза. 2010. Т. 53. N 5. С. 22-24.
16. Бехтерев В.Н., Гаврилова С.Н., Кошкаре-ва Е.В., Шипанов И.Н. Газохроматографическое определение пировалерона в моче методом экстракционного вымораживания в сочетании с центрифугированием // Судебно-медицинская экспертиза. 2017. Т. 60. N 3. С. 27-31.
17. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ. М.: Химия, 1977. 200 с.
1. Tomashevskaya O.Yu., Dargaeva T.D., So-kol'skaya T.A. Study of qualitative content and determination of phenolic compounds in rhizomes of butcher's broom Ruscus aculeatus L. Voprosy bio-logicheskoi, meditsinskoi i farmatsevticheskoi khimii [Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry]. 2009, no. 2, pp. 42-44. (in Russian)
2. Guvenc A.a Satir E., Coskun M. Determination of Ruscogenin in Turkish Ruscus L. Species by UPLC. Chromatographia Supplement. 2007, vol. 66, pp. 141-145.
3. Lunin V.V. SKF-technologies and their development in the world. Sverkhkriticheskie flyuidy. Teoriya i Praktika [Supercritical fluids. Theory and Practice]. 2006, vol. 1, no. 1, pp. 3-8. (in Russian)
4. Romanik G., Gilgenast E., Przyjazny A., Kaminski M. Techniques of preparing plant material for chromatographic separation and analysis. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 2007, vol. 70, pp. 253-261.
5. Markin V.I., Cheprasova M.Yu., Bazarnova N.G. The main directions of the use of microwave radiation in the processing of plant raw materials (Review). Khimiya rastitel'nogo syr"ya [Chemistry of plant raw materials]. 2014, no. 4, pp. 21-42. (in Russian)
6. Pronyk C., Mazza G. Design and scale-up of pressurized fluid extractors for food and bioproducts. Journal of Food Engineering. 2009, vol. 95 (2), pp. 215-226.
7. Bekhterev V.N. Sposob izvlecheniya organi-cheskikh veshchestv iz vodnykh sred ekstraktsiei v sochetanii s vymorazhivaniem [Method of extraction of organic substances from aqueous media by
18. Патент № 2564999В РФ. Способ извлечения органических веществ из водных сред экстракционным вымораживанием в поле центробежных сил / В.Н. Бехтерев. Опубл. 10.10.2015. Бюл. N 28. Приоритет 14.04.2014.
19. Бехтерев В.Н. Экстракционное вымораживание карбоновых кислот из водного раствора в ацетонитрил в условиях действия поля центробежных сил // Сорбционные и хроматографи-ческие процессы. 2015. Т. 15. Вып. 5. С. 683-692.
20. Бехтерев В.Н. Экстракционное вымораживание одноосновных карбоновых кислот из воды в ацетонитрил в условиях действия центробежных сил //Журнал физической химии. 2016. Т. 90. N 10. С. 1558-1562.
21. http://www.encognitive.com/files/Butcher's% %20Broom--%20EvidenceBased%20Phytotherapy% 20for%20Venous%20Conditions.pdf (Дата обращения 15.04.2018)
22. Schneider G.M. Aqueous solutions at pressures up to 2 GPa: gas-gas equilibria, closed loops, high-pressure immiscibility, salt effects and related phenomena // Physical Chemistry Chemical Physics. 2002. V. 4. P. 845-852.
23.http://ansm.sante.fr/var/ansm_site/storage/ original/application/5da7503356fe33fd30e28d55a1 7abd50.pdf (Дата обращения 15.04.2018)
extraction in combination with freezing]. Patent of RF, no. 2303476, 2005.
8. Bekhterev V.N. Isolation of phenols from water by extraction freezing. Zhurnal analiticheskoi khimii [Journal of analytical chemistry]. 2008, vol. 63, no. 10, pp. 1045-1049. (in Russian)
9. Bekhterev V.N., Gavrilova S.N., Koshkareva E.V. The use of extraction freezing for the solution of pharmacological and biochemical problems. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal [Pharmaceutical chemistry journal]. 2008, vol. 42, no. 2, pp. 44-46. DOI: https://doi.org/ 10.30906/0023-1134-2008-42-2-44-46 (in Russian)
10. Bekhterev V.N. Extractive freezing-out in the analysis of organic compounds in the aqueous media. Mendeleev Communications. 2007, vol. 17, pp. 241-243.
11. Rusinova A.A., Polezhaev Yu.M., Matern A.I. Concentration of solutions by freezing (review). Analitika i kontrol' [Analytics and control]. 1999, no. 4, pp. 4-10. (in Russian)
12. Bekhterev V.N. Patterns of behavior of dissolved organic substances in conditions of extraction freezing. Zhurnal analiticheskoi khimii [Journal of analytical chemistry]. 2011, vol. 66, no. 6, pp. 608613. (in Russian)
13. Koganovskii A.M., Klimenko NA., Levchenko T.M., Roda I.G. Adsorbtsiya organicheskikh veshchestv iz vody [Adsorption of organic substances from water]. Leningrad: Khimiya Publ., 1990, 256 p.
14. Poole S.F., Wilson I.D. Solid-phase extraction. Journal of Chromatography A. 2000, no. 1-2, pp. 1-465.
15. Bekhterev V.N., Gavrilova S.N., Kozina E.P., Maslakov I.V. Rapid determination of caffeine in blood
by the method of extraction of freeze-out. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza [Forensic medical expertise]. 2010, vol. 53, no. 5, pp. 22-24. (in Russian)
16. Bekhterev V.N., Gavrilova S.N., Koshkareva E.V., Shipanov I.N. Gas chromatographic determination of pyrovalerone in the urine by the method of solvent extraction of freezing in combination with a centrifu-gation. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza [Forensic medical expertise]. 2017, vol. 60, no. 3, pp. 27-31. (in Russian)
17. Korenman I.M. Ekstraktsiya v analize orga-nicheskikh veshchestv [Extraction in analysis of organic substances]. Moscow: Khimiya Publ., 1977, 200 p.
18. Bekhterev V.N. Sposob izvlecheniya orga-nicheskikh veshchestv iz vodnykh sred ekstrakt-sionnym vymorazhivaniem v pole tsentrobezhnykh sil [Method of extraction of organic substances from aqueous media by extraction freezing in the field of centrifugal forces]. Patent of RF, no. 2564999В, 2014.
19. Bekhterev V.N. Extraction freezing of carboxy-lic acids from aqueous solution to acetonitrile under centrifugal force field conditions. Sorbtsionnye i khro-matograficheskie protsessy [Sorption and chromate-
Критерии авторства
Бехтерев В.Н. и Маляровская В.И. выполнили экспериментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Бехтерев В.Н. и Маляровская В.И. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Виктор Н. Бехтерев
Д.х.н., профессор кафедры архитектуры, дизайна и экологии инженерно-экологического факультета
Сочинский государственный университет Старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии, физиологии и биохимии растений
Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур e-mail: vic-bekhterev@yandex.ru
Валентина И. Маляровская
К.б.н., заведующая лабораторией биотехнологии, физиологии и биохимии растений
Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур e-mail: lab-bfbr@vniisubtrop.ru
graphic processes]. 2015, vol. 15, no. 5, pp. 683692. (in Russian)
20. Bekhterev V.N. Extraction freezing of monobasic carboxylic acids from water to acetonitrile under the action of centrifugal forces. Zhurnal fizicheskoi khimii [Journal of physical chemistry]. 2016, vol. 90, no. 10, pp. 1558-1562. (in Russian)
21. Fytotherapy Rewiev & Commentary. Batcher's Broom: Evidence-Based Phytotherapy for Venous Conditions. Available at http://www.encog-nitive.com/files/Butcher's%20Broom--%20Evidence-Based%20Phytotherapy%20for%20Venous%20Con ditions.pdf (accessed 15.04.2018)
22. Schneider G.M. Aqueous solutions at pressures up to 2 GPa: gas-gas equilibria, closed loops, high-pressure immiscibility, salt effects and related phenomena. Physical Chemistry. Chemical Physics. 2002, vol. 4, pp. 845-852.
24. Batcher's Broom for Homeopathic Preparation. Ruscus Aculeatus for Homeopathic Preparation. Available at http://ansm.sante.fr/var/ansm_site/stora-ge/original/application/5da7503356fe33fd30e28d55a 17abd50.pdf. (accesed 15.04.2018)
Contribution
Bekhterev V.N. and Malyarovskaya V.I. carried out the experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Bekhterev V.N. and Malyarovskaya V.I. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict ofinterests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Victor N. Bekhterev
Dr.Sci. (Chemistry), Professor
Department of Architecture, Design and Ecology
Sochi State University
Senior Researcher
Laboratory of Biotechnology, Plant Physiology and Biochemistry Ecology and Engineering Faculty All-Russian Scientific and Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops e-mail: vic-bekhterev@yandex.ru
Valentina I. Malyarovskaya
Ph.D. (Biology), Head of the Laboratory of Biotechnology, Plant Physiology and Biochemistry All-Russian Scientific and Research Institute of Floriculture and Subtropical Crops email: lab-bfbr@vniisubtrop.ru
