CC BY
123
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 93-99.
УДК 630 892.4
ЭКСТРАКТИВНАЯ ПЕРЕРАБОТКА КОРЫ ЕЛИ СИБИРСКОЙ В ЦЕННЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ
В.А. Левданский1’2, А.И. Бутылкина1, Н.М. Иванченко1, Б.Н. Кузнецов1’2
1 Институт химии и химической технологии СО РАН, ул. К. Маркса, 42,
Красноярск, 660049 (Россия) e-mail: [email protected]
2Сибирский федеральный университет, пр. Свободный, 79, Красноярск,
660041 (Россия)
Изучен состав продуктов экстракционной переработки коры ели сибирской (Picea obovata). Предложена схема комплексной переработки коры ели в востребованные продукты: смолистые вещества, дубильный экстракт, антоциани-дины, проантоцианидины, пектин.
Ключевые слова: кора ели, экстракция, смолистые вещества, дубильные вещества, антоцианидихлориды, проантоцианидины, пектин.
Введение
Кора ели является крупнотоннажным отходом целлюлозно-бумажных комбинатов. В настоящее время она в основном сжигается, хотя может использоваться для получения ценных экстрактивных веществ [1-4] и в качестве сорбента для очистки воды от тяжелых металлов и других загрязнителей [5, 6]. Химический состав смолистых веществ коры ели сибирской (Picea obovata) подробно описан в работах [7, 8].
Из коры сосны приморской (Pinus maritima) получают препарат Pycnogenol, который является эффективным антиоксидантом, а также обладает капилляроукрепляющим действием [9]. Pycnogenol на 85% состоит из проантоцианидинов и содержит фенолокислоты (кофейную, феруловую и и-гидроксибензойную) и глю-козилированные производные флавонолов и фенолокислот.
Проантоцианидины - общее название природных соединений, которые при кислотном гидролизе [10, 11] дают антоцианидины. Проантоцианидины широко распространены в растительном мире и обладают противовоспалительной [12], антиастматической [13], противораковой [14], антимикробной, антиаллергической, антигипертонической и кардиопротекторной активностью [15].
В работе [16] водный экстракт коры черной ели (Picea mariana) был разделен на фракцию олигомерных проантоцианидинов и фракцию полимерных проантоцианидинов. Обе фракции обладают антиоксидантной и противовирусной активностью, причем наибольшую активность проявляют олигомерные проантоцианидины.
Получаемый из коры ели пищевой пектин пригоден для производства мармелада и других пищевых продуктов [17, 18].
При обработке коры хвойных пород деревьев слабыми растворами кислот образуются антоцианидино -вые соединения. Они интересны тем, что их гликозиды (антоцианы), полученные из пищевого растительного сырья или отходов его переработки, используются в качестве пищевых красителей (Е 163). Состав анто-цианидиновых соединений, выделяемых из коры пихты и лиственницы, изучен в работах [19, 20].
Цель настоящей работы заключалась в выделении и изучении состава антоцианидинхлоридов, проантоцианидинов и пектиновых веществ коры ели сибирской.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали еловую кору Енисейского ЦБК.
Кору сушили при температуре 104-105 °С в течение 5-6 ч, измельчали и отбирали для исследования фракцию 1,0-2,0 мм. Химический состав коры ели определяли по общепринятым в химии древесины мето-
* Автор, с которым следует вести переписку.
дикам [21]. Содержание основных компонентов в коре ели (% от массы а.с. коры): целлюлоза - 28,8, лигнин - 28,1, экстрактивные вещества - 15,5, зольность - 3,1. Кора содержит 22,3% мае. легкогидролизуемых и 27,8% мае. трудногидролизуемых полисахаридов.
Высушенную и измельченную кору экстрагировали гексаном в течение 10 чв аппарате Сокслета емкостью 250 мл для выделения смолистых веществ.
Для выделения дубильного экстракта обессмоленную кору экстрагировали этанолом в аппарате Сокслета в течение 8 ч, затем остаток коры дважды промывали водой по 30 мин при температуре 60-65 °С и гидромодуле 30 при постоянном перемешивании. Полученные экстракты упаривали под вакуумом на ротационном испарителе и объединяли. Количественное определение дубильных веществ в объединенных экстрактах проводили по стандартной методике ВЕМ с помощью гольевого порошка [22].
Для выделения проантоцианидинов обессмоленную кору кипятили в 15%-ном водном растворе этанола в колбе с мешалкой и обратным холодильником при интенсивном перемешивании в течение 1 ч. Горячий водно-спиртовый раствор отделяли фильтрованием. Экстракт концентрировали под вакуумом на ротационном испарителе до 350-400 мл и насыщали хлоридом натрия. Образующийся осадок полифенольных веществ отделяли фильтрованием. Фильтрат трижды экстрагировали по 200 мл этилацетата и сушили над безводным сульфатом натрия. Затем этилацетатный раствор концентрировали под вакуумом до объема 60 мл. При семикратном разбавлении хлороформом проантоцианидины выпадают в осадок в виде светло-кремовых хлопьев, которые отделяли фильтрованием.
Анализ проантоцианидинов осуществляли путем их превращения в антоцианидиновые красители [10].
Антоцианидинхлориды получали как непосредственно из обессмоленной коры ели, так и из дубильного экстракта, выделенного из коры.
Для получения антоцианидинхлоридов непосредственно из коры ели к обессмоленной коре добавляли этиловый спирт, содержащий 3% соляной кислоты, и кипятили на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем остаток коры отфильтровывали, фильтрат упаривали в 4 раза, разбавляли водой, выпавшие в осадок антоцианидинхлориды отделяли фильтрованием.
Синтез антоцианидинхлоридов из дубильного экстракта осуществляли путем кипячения навески последнего в этиловом спирте, содержащем 3% соляной кислоты, в колбе с обратным холодильником в течение 2 ч с последующей отгонкой растворителя и дальнейшей обработкой, аналогичной получению антоцианидинхлоридов из коры.
Для разделения антоцианидинхлоридов на индивидуальные соединения использовали колоночную хроматографию на полиамидном сорбенте. Для их идентификации применяли бумажную хроматографию, УФи ИК-спектроскопию по методикам, использованным в работе [19]. Антоцианидиновые соединения анализировали также по продуктам их щелочного распада [20].
Для выделения пектиновых веществ кору ели после извлечения из нее смолистых веществ и дубильного экстракта обрабатывали 1%-ным водным раствором соляной кислоты при температуре 80 °С и гидромодуле 20 при постоянном перемешивании в течение 1 ч. Затем раствор отфильтровывали, концентрировали под вакуумом и осаждали пектин изопропиловым спиртом. Пектин отделяли фильтрованием, промывали дважды изопропиловым спиртом и сушили. Молекулярную массу пектина коры ели определяли вискозиметриче-ски, расчет производили по уравнению Куна-Марка [^]=1,Г10-5'М1,22 [23].
ИК-спектры пектина снимали на приборе ИК-Фурье (Vector 22) в области длин волн 500-4000 см-1. Образцы пектина запрессовывали в матрицу KBr. Элементный анализ пектина проведен на элементном анализаторе FlashEATM-1112 (Thermo Quest Italia).
Обсуждениерезультатов
Для получения ассортимента ценных химических продуктов из коры ели сибирской использовали комбинацию экстрактивных методов выделения смолистых и дубильных веществ, проантоцианидинов, пектинов и химических превращений проантоцианидинов и полифенолов в окрашенные антоцианидинхлориды.
Неполярным растворителем - гексаном - из коры хвойных пород деревьев извлекают сложную смесь терпеновых соединений, восков, жиров, насыщенных и ненасыщенных жирных и смоляных кислот.
Выделение дубильного экстракта. Для наиболее полного извлечения дубильных веществ из коры ели используют водно-спиртощелочную экстракцию [24]. Однако после такой обработки остаток коры не может быть использован для получения пектиновых веществ. Поэтому в данной работе для извлечения дубильных
веществ применялась последовательная экстракция коры спиртом и водой в щадящем температурном режиме. Доброкачественность полученного дубильного экстракта составила 52%.
Выделение и идентификация антоцианидинхлоридое. Был сопоставлен выход антоцианидинхлоридов, полученных непосредственно из обессмоленной коры ели и из дубильного экстракта, выделенного из коры. В первом случае выход антоцианидинхлоридов составил 13,3% от массы а.с. коры, а во втором - 9,4% мае. Известно, что в коре лиственницы часть флавоноидов, из которых образуются ангоцианидины, находится в связанном состоянии [25] и с трудом извлекается экстрагентами. По-видимому, и в коре ели заметная доля флавоноидов присутствует в связанном состоянии и не экстрагируется пропанолом в изученных условиях процесса. За счет их перехода в свободное состояние в кислой среде возрастает выход антоцианидинхлоридов в расчете на исходную кору ели, по сравнению со способом их получения через стадию выделения дубильного экстракта.
Для разделения антоцианидинхлоридов на индивидуальные соединения использовали колоночную хроматографию. Цианидинхлорид, выделенный из коры ели, идентифицировали с использованием цианидин-хлорида, полученного встречным синтезом из кверцетина [26]. Установлено, что красители, полученные из дубильного экстракта и непосредственно из коры ели, на 75-78% состоят из цианидинхлорида и дельфини-динхлорида. Структура полученных соединений подтверждена методами УФ- и ИК-спектроскопии.
Известно, что антоцианидиновые пищевые красители, полученные из плодов и овощей, с высокой точностью идентифицируют по продуктам их щелочного распада. Используя метод щелочного распада, были ранее идентифицированы антоцианидины коры лиственницы [20]. При растворении антоцианидинхлоридов в 10-15%-ном растворе гидроксида калия или натрия и нагревании до 100 °С получаются продукты распада, позволяющие идентифицировать агликон [27]. На рисунке 1 приведена схема щелочного распада цианидинхлорида и дельфинидинхлорида.
Наличие в продуктах распада флороглюцина, а также 3,4-дигидроксибензойной и галловой кислот свидетельствует о том, что полученный из коры ели антоцианидиновый краситель на 75% состоит из цианидинхлорида и дельфинидинхлорида. Показано, что суммарное содержание цианидинхлорида и дельфинидинхлорида в смеси, полученной из дубильного экстракта коры ели и непосредственно из обессмоленной коры ели, одинаковое и составляет 75-78%.
Выделение и идентификация проантоцианидиное. Проантоцианидины - это димерные и олигомерные производные флаван-3,4-диолов и флаван-3-олов (катехинов). Проантоцианидины обладают мощной анти-оксидантной активностью и могут применяться как биологически активная добавка к пище. Для изучения и идентификации проантоцианидинов используют их способность превращаться в соответствующие антоциа-нидинхлориды при действии соляной кислоты в метаноле или этаноле [28, 29].
При обработке проантоцианидинов, выделенных из коры ели, соляной кислотой в этаноле образуются цианидинхлорид и дельфинидинхлорид. Схема реакции кислотного гидролиза проантоцианидинов группы А и группы В показана на рисунке 2. Общее содержание цианидинхлорида и дельфинидинхлорида, полученное при кислотном гидролизе проантоцианидинов коры ели, составило 74±3%.
он
он
но
он
Цианидин
он
он
он
он
Флороглюцин
он
он
Дельфинидин
галловая кислота
Рис. 1. Схема щелочногораспада цианидинхлорида и дельфинидинхлорида
Выделенный из коры ели комплекс проантоцианидинов был проанализирован на содержание дигидро-кверцетина - ценного биологически активного соединения, обладающего антиоксидантными свойствами. Известно, что при обработке дигидрокверцетина цинковой пылью в присутствии соляной кислоты образуется цианидинхлорид [30, 31], согласно схеме, приведенной на рисунке 3.
Используя приведенный в работе [32] метод количественного определения ДКВ, мы установили, что в состав проантоцианидинов коры ели входит дигидрокверцетин в количестве 7,3% от общей массы выделенных проантоцианидинов.
Я=Н - процианидин, Я=ОН - продельфинидин Рис. 2. Схема реакции кислотного гидролиза проантоцианидинов группы А (I) и группы В (II)
он ОН
Рис. 3. Схема реакции превращения ДКВ в цианидинхлорид
Выделение и анализ состава пектина. Пектины - растительные полисахариды сложного строения с молекулярной массой 14000-75500. Основной составной частью молекулы пектиновых веществ является Б-галакт-уроновая кислота, соединенная а-1-4-гликозидными связями в нитевидную молекулу пектиновой кислоты [23]. Наличие свободных карбоксильных групп галакгуроновой кислоты обусловливает способность пектиновых ки -слот связывать в пищеварительном тракте ионы тяжелых металлов с последующим образованием нерастворимых комплексов (пектинаты, пектаты), которые не всасываются и выводятся из организма. Поэтому пектиновые вещества используются в лечебном питании для вывода из организма различных шлаков. Наиболее распространенным пектинсодержащим сырьем являются яблочные и цитрусовые выжимки, свекловичный жом.
ИК-спектроскопия с успехом применяется для исследования строения полисахаридов, в том числе и пектинов. В таблице 1 представлены основные максимумы полос поглощения в ИК-спектре пектина, полученного из коры ели и яблочного пектина, описанного в работе [33].
Как и для всех углеводов, для пектинов характерны интенсивные полосы валентных колебаний гидроксилов пиранозного кольца в области 3300-3400 см-1 (для елового пектина - 3450 см-1). В области 1019-1147 см-1 присутствуют характерные для пектиновых веществ интенсивные полосы скелетных колебаний кольца пиранозного цикла и гликозидных связей. Полоса при 1736 см-1 соответствует валентным колебаниям С=0 связи в составе сложного эфира или карбоксильной группы. Полосу при 1316 см-1 можно отнести к плоскостным деформационным колебаниям спиртовых гидроксилов 5(0-Н)с пиранозных циклов. ИК-спектр елового пектина очень сходен со спектром яблочного пектина. Наличие интенсивной полосы в области 1618 см-1 свидетельствует о наличии в исходном образце значительного количества свободных карбоксильных групп, которые при запрессовывании образца в таблетку КВг приводят к образованию пектата калия.
Данные элементного анализа елового пектина (С - 38,8%, Н - 5,9%) согласуются с литературными данными об элементном составе пектина, выделенного из коры лиственницы (С - 30,28-36,55%, Н - 4,516,82%) [34]. Молекулярная масса полученного нами елового пектина - 4323, что согласуется с литературными данными - 4582 [17]. Среднее содержание пектиновых веществ в коре ели, согласно работе [17], составляет 8,2% при выделении их 0,5%-ным раствором щавелевокислого аммония. Однако по данным элементного анализа мы обнаружили, что при осаждении спиртом вместе с пектином в осадок выпадает некоторое количество щавелевокислого аммония. При экстракции пектина раствором соляной кислоты его вы -ход составляет 3,5%, но он не содержит нежелательных примесей.
Пектины обладают противовоспалительными, обволакивающими свойствами, проявляют детоксицирующее действие, адсорбируя токсины микроорганизмов, ионы тяжелых металлов, в том числе радионуклиды, гликозиды, алкалоиды, фенол и другие вредные вещества. Пектины применяются в ветеринарии для профилактики и терапии желудочно-кишечных болезней сельскохозяйственных животных.
Таблица 1. Максимумы полос поглощения в ИК-спектрах елового и яблочного пектина
Частота V, см 1 Отнесение
Еловый пектин Яблочный пектин
3450 3450 V (ОН)
1736 1740 V (С=0)сл.эф., V (С=0)к.
1618 1620 V (СОО-)
1316 1333 б(О-Н) в пиранозных кольцах
1019-1147 1000-1200 у(С-ОН), у(С-0-С), б(О-Н)
887 700-900 5(С1-Н) в глюкопиранозном цикле
780 780 деформационные колебания пиранозного кольца
Комплексная переработка коры ели. В результате проведенного исследования предложена схема экстракционной переработки коры ели в различные востребованные продукты (рис. 4). Выход продуктов из коры ели указан в таблице 2.
Первая стадия комплексной переработки коры заключается в ее экстракции гексаном для выделения смолистых веществ. Выход смолистых веществ в зависимости от срока хранения коры может составлять от 4 до 6%. Смолистые вещества коры хвойных обладают биоцидными и гидрофобными свойствами и могут применяться для создания защитных покрытий, устойчивых к воздействию влаги, бактерий и грибков. Некоторые компоненты смолистых веществ обладают биологической активностью и могут использоваться как добавки к косметическим средствам.
В соответствии с приведенной схемой переработка обессмоленной коры ели может осуществляться различными способами, ориентированными на получение определенного набора целевых продуктов: дубильных веществ, антоцианидинхлоридов, проантоцианидинов и пектинов. Указанные продукты востребованы в фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, медицине и ветеринарии, кожевенном производстве и других областях.
Таблица 2. Выход продуктов из коры ели
Продукты Выход, % от воздушно сухой коры
Смолистые вещества 6,0
Дубильный экстракт 10,0
Антоцианидинхлориды 13,2
Проантоцианидины 0,3
Пектин 3,5
Рис. 4. Схема комплексной переработки коры ели
Выводы
Изучен состав некоторых продуктов экстракционной переработки коры ели. Установлено, что выделенные из коры антоцианидинхлориды на 75-78% состоят из цианидинхлорида и дельфинидинхлорида.
Выделенный проантоцианидиновый комплекс на 74-77% состоит из процианидина и продельфинидина, а также содержит дигидрокверцетин в количестве 7,3%.
Предложена схема комплексной переработки коры ели с получением ряда востребованных продуктов: смолистых веществ, дубильного экстракта, антоцианидинхлоридов, проантоцианидинов, пектина.
Список литературы
1. Патент №2220206 (РФ). Способ получения дубильного экстракта / С.Г. Ермаков, Ф.Х. Хакимова, О.А. Носкова, О.В. Леконцева / опубл. 27.12.2003.
2. Mannila E., Talvitie A. Stilbenes from Picea abies bark // Phytochemistry. 1992. V. 31. Pp. 3288-3289.
3. Li S.H., Niu X.M., Zahn S., Gershenzon J., Weston J., Schneider B. Diastereomeric stilbene glucoside dimers from the bark of Norway spruce (Picea abies) // Phytochemistry. 2008. V. 69. Pp. 772-782.
4. Lee W.J., Lan W.C. Properties of resorcinol-tannin-formaldehyde copolymer resins prepared from the bark extracts of Taiwan acacia and China fir // Bioresour. Technol. 2006. V. 97, N2. Pp. 257-264.
5. Martin-Dupont F., Gloaguen V., Granet R., Gujlloton M., Krausz P. Chemical modifications of Douglas fir bark, a lig-nocellulosic by-product - enhancement of their lead (II) binding capacities // Separ. Sci. and Technol. 2004. V. 39, N7. Pp. 1595-1610.
6. Karthikeyan K.G., Tshabalala Mandla A., Wang D., Kalbasi M. Solution chemistry effects on orthophosphate adsorption by cationized solid wood residues // Environ. Sci. and Technol. 2004. V. 38, N3. Pp. 904-911.
7. Шмидт Э.Н., Черненко Г.Ф., Иванова Е.Е., Деменкова Л.И. Возрастные изменения состава экстрактивных веществ коры ели сибирской (Picea obovata) // Химия природных соединений. 1995. №3. С. 386-39Q.
8. Черненко Г.Ф., Иванова Е.Е., Гатилов Ю.В., Багрянская И.Ю., Шмидт Э.Н. Экстрактивные вещества коры Picea obovata // Химия природных соединений. 1992. №б. С. 654-662.
9. Patent 469836Q (US). Plant extract with a proanthocyanidins content as a therapeutic agent having radical scavenger effect and use thereof / J. Masquelier / Q6.1Q.1987.
1Q. Bate-Smith E. Phytochemistry of procyanidins // Phytochemistry. 1975. V. 14. Pp. 11Q7-1113.
11. Porter L., Hrstich L., Chan B. The conversion of proanthocyanidins to cyanidin and delphinidin // Phytochemistry. 1986. V. 25, N1. Pp. 223-23Q.
12. Torras M.A.C., Faura C.A., Schonlau F. & Rohdewald P. Antimicrobial activity of Pycnogenol // Phytotherapy Research. 2QQ5. V. 19, N7. Pp. 647-648.
13. Lau B.H.S., Riesen S.K., Truong K.P., Lau E.W., Rohdewald P., & Barreta R.A. Pycnogenol as an adjunct in the management of childhood asthma // Journal of Asthma. 2QQ4. V. 41, N8. Pp. 825-832.
14. Ray S.D., Parikh H., Bagchi D. Proantoccyanidin exposure to B6C3F1 mice significantly attenuates dimethylnitrosamine-induced liver tumor induction and mortality by differentially modulating programmed and unprogrammed cell deaths // Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanism of Mutagenesis. 2QQ5. V. 579, N1-2. Pp. 81-1Q6.
15. Kohama T., Suzuki N., Ohno S., Inoue M. Analgesic efficacy of French maritime pine bark extract in dysmenorrhea -An open clinical trial // Journal of Reproductive Medicine. 2QQ4. V. 49, N1Q. Pp. 828-832.
16. Diouf P.N., Stevanovic T., Cloutier A. Study on chemical composition, antioxidant and anti-inflammatory activities of hot water exstract from Picea mariana bark and its proanthoctanidin-rich fractions // Food Chemistry. 2QQ9. V. 113, N4. Pp. 897-9Q2.
17. Ярцева H.A., Пермякова Г.В., Степень P.A. Характеристика пищевых пектинов из коры хвойных пород Сибири // Продовольственные икормовые ресурсы лесов Сибири. Красноярск, 1983. С. 122-129.
18. Берестюк А.В., Ушанова В.М. Исследование влияния температуры на выход протопектина из коры ели // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: матер. Всерос. конф. Барнаул, 2QQ5. Кн. 1. С. 19Q-192.
19. Левданский В.А., Полежаева Н.И., Макиевская А.И., Кузнецов Б.Н. Выделение и изучение состава антоциани-
динов коры пихты // Химия в интересах устойчивого развития. 2QQQ. №8. С. 823-827.
2Q. Левданский В.А., Бутылкина А.И., Кузнецов Б.Н. Выделение и изучение состава антоцианидинов коры лист-
венницы // Химия растительного сырья. 2QQ6. №4. С. 17-2Q.
21. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1991. 32Q с.
22. Всесоюзный единый метод исследования в кожевенном обувном и дубильно-экстрактивном производстве (ВЕМ), М., 1955.
23. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. М., 2QQQ. 26Q с.
24. Патент №2333232 (РФ). Способ переработки коры ели / В.А. Левданский, А.Н. Бутылкина, Б.Н. Кузнецов / опубл. 1Q.Q9.2QQ8.
25. Левданский В.А., Полежаева Н.И., Бутылкина А.И., Кузнецов Б.Н. Получение антоцианидинхлоридов из коры лиственницы и пихты // Химия в интересах устойчивого развития. 2QQ2. №1Q. С. 331-337.
26. Rinq H.G.C., White T. The conversion of flavonols into anthocyanidins // J. Chem. Soc. 1957. N9. Pp. 39Q1-39Q3.
27. Танчев C.C. Антоцианы в плодах и овощах. М., 198Q. 3Q4 c.
28. Бондаренко С.М., Долгодворова С.Я., Черняева Г.Н. Лейкоантоцианидины коры березы повислой // Известия СО РАН СССР. Сер. хим наук. 1989. №1. С. 86-9Q.
29. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М., 1993. 272 с.
3Q. Jurd L. The acid catalyzed conversion of 3-hydroxyflavanons to anthocyanidins // Phytochemistry. 1969. V. 8, N12.
Pp. 2421-2423.
31. Barton G.M., Gardner J.A.F. Determination of dihydroquercetin in Douglas fir and western larch wood // Anal. Chem. 1958. V. 3Q, N2. Pp. 279-281.
32. Еськин А.П., Левданский B.A., Полежаева Н.И. Метод количественного фотометрического определения дигид-рокверцетина // Химия растительного сырья. 1998. №3. C. 41-45.
33. Филиппов М.П. Инфракрасные спектры пектиновых пленок // Журнал прикладной спектроскопии. 1972. Т. XVII, вып. 2. С. 296-299.
34. Иванова Н.В., Попова О.В., Бабкин В.А. Изучение влияние различных факторов на выход и некоторые характеристики пектиновых веществ коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2QQ3. №4. С. 43-46.
Поступило вредакцию 9 февраля 2010 г.
