CC BY
6
Методы исследования
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1094 УДК 615.462/.465.015.4.07
И. И. Рыжова, Л. А. Савлучинская, Н. Я. Михайловский
ЭКСПРЕССНАЯ ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ БЛАСТОМОГЕННЫХ СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВ И МАТЕРИАЛОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ (ОБЗОР)
Онкологический научный центр РАМН, Москва
Среди материалов медицинского назначения важное место принадлежит полимерам, некоторым металлам и металлическим сплавам, широко применяемым для эндопротезирсвания, производства медицинской аппаратуры и инструментария, предметов санитарии и гигиены, изделий стоматологического назначения, носителей медикаментозных средств и т. д. [1, 81-
Уже нашли достаточно широкое применение силикон, тефлон, поликарбонаты, гидрогели и другие синтетические материалы, а также некоторые металлы: титан, специальные сорта нержавеющей стали, различные сплавы на никелевой и кобальтовой основе [3, 5, 6]. Прогресс в создании и освоении медицинской техники стал возможен благодаря появлению обширного класса синтетических полимеров и прежде всего полиметилметакрилата, поливинилхлорида, полиолефинов, по-лисиликсана, фторопласта и некоторых других [1,5, 43, 45].
Число соединений и материалов, используемых в медицине, постоянно увеличивается. Широкое варьирование молекулярных масс и стереоструктуры высокомолекулярных веществ, использование их в разнообразных сочетаниях с другими полимерами, а также перспективное получение новых металлических сплавов создают широкую гамму неизвестных материалов с новыми свойствами. В связи с этим становится необходимым всестороннее изучение токсических и возможных бластомогенных свойств материалов медицинского назначения.
Актуальность подобного изучения достаточно велика уже потому, что речь идет о зешествах и материалах, предназначенных к использованию у больных, т. е. у лиц, уже ослабленных тем или иным заболеванием.
До начала 60-х годов существовала точка зрения, что им-плантаты из полимерных и других материалов индифферентны для организма. Однако в дальнейшем в опытах на животных было показано, что при контакте имплантатов с тканью могут возникать злокачественные новообразования, преимущественно фибросаркомы [38|.
В настоящее время имеется довольно обширная литература об изучении токсических свойств соединений и материалов, применяемых в медицинской практике [7, 25, 49). Информация же о возможных канцерогенных свойствах крайне ограничена. Имеющиеся в литературе данные об опухолях, индуцированных инороднимн телами у человека (металлические и пластмассовые протезы, неизвлеченные осколки после ранения и др.), немногочисленны Так, I. Thompson, S. Entin сообщают о хондросаркоме, возникшей вблизи пломбы из поли-метнлкрилата через 16 лет после ее имплантации. Рост опухоли происходил из соединительнотканной капсулы вокруг имплантата, как это обычно наблюдается у экспериментальных животных [50]. Описаны случаи возникновения фибросаркомы на месте протеза части бедренной артерии, изготовленного из тефлона-дакрона, и развития эпидермальной карциномы полости носа у мужчины через 9 лет после имплантации в слизистую носовой перегородки акриловых петель [15, 40]. Имеются и другие сообщения об опухолях, в той или иной степени связанных с наличием инородного тела [20, 22, 34, 46, 48].
Оценка бластомогенных последствий взаимодействия материалов медицинского назначения с тканями организма затруднительна в виду необходимости проведения длительных экспериментов на животных (до 2—2,5 лет). В .;.:зи с этим возникает потребность в разработке методологии использования краткосрочных способов изучения канцерогенной активности веществ и материалов. К числу наиболее перспективных методов, заслуживающих внимания и дальнейшего развития, следует отнести экспресс-тесты, используемые в экспериментах in vitro
[10, 29, 37, 41, 42]. Известно порядка 200 таких краткосрочных тестов. Применение большинства из них для скрининго-вой оценки бластомогенных свойств исследуемых веществ основано на тесной корреляции между различными генотоксиче-скими эффектами in vitro у бактерий, насекомых, клеток млекопитающих и человека (генные мутации, злокачественные трансформации и т. д.) и индукцией опухолей ir. vivo в долгосрочных экспериментах [14, 26, 35, 42].
Анализ литературы показывает, что целый ряд металлов и их соединений, используемых в материалах медицинского назначения, прежде всего никель и хром, обладает канцерогенными свойствами и, по мнению экспертов Международного агентства по изучению рака (МАИР), безусловно, канцерогенны для человека. Для ряда соединений других металлов (Со, Zn, Mg, Ti и Pb), включая железоуглеродные комплексы, выявлена канцерогенность на животных при различных путях и способах введения [4, 27, 43].
Потенциальная генотоксичность металлов может определяться с помощью различных тест-систем на клетках млекопитающих, в которых они дают мутагенный и кластогенный эффекты [11, 32, 39, 41, 43]. Ионы металлов отличаются высокой способностью к поляризации и связыванию с кислородом, серой, азотом, входящими в состав белков и нуклеиновых кислот, и могут влиять на активность и правильность работы ДНК- и РНК-полимераз [13, 17, 21, 30, 47]. Они также влияют на активность важнейших ферментов метаболизма, активируя, например, ген металлотионина, который в комбинации с онкогенами приводит к злокачественной трансформации клеток [33].
На основании результатов, полученных при использовании краткосрочных тестов как на клетках млекопитающих, так и на бактериях, был предложен механизм генотоксического действия металлов и их соединений на клетки [13, 17, 42]. Согласно предложенной схеме, металлы и их соединения непосредственно взаимодействуют с ДНК после того, как они проникают в ядро клетки. По способу поступления в клетку неорганические соединения можно разделить на 3 группы: водорастворимые, малорастворимые и липидораствсримые. Водорастворимые соединения используют для этого транспортные системы мембран. Таким путем могут проникать в клетку хромать), арсенаты, вольфраматы, ванадаты, молебдаты, селениты [26, 43]. Для ряда хроматов канцерогенное действие положительно коррелирует со степенью их растворимости.
. Остановимся на исследованиях, посвященных действию хрома на клетки млекопитающих. Одним из важных последствий действия хрома на культуру клеток яичников китайского хомячка, широко используемую для изучения соединений металлов, являются индукция разрывов ДНК, появление меж-нитевых поперечных сшивок ДНК — белок и ДНК — ДНК. Отмечено различие в действии Cr (VI) и Cr (III) на клеточные культуры. Cr (III) не оказывает повреждающего действия на ДНК при контакте с клетками, но при смешивании с очищенной ДНК обусловливает появление межнитевых поперечных сшивок ДНК — ДНК и ДНК — белок и образование устойчивого комплекса с ДНК. Различие в действии этих соединений становится понятным благодаря тому, что они с разной эффективностью способны поступать в клетку путем как диффузии, так и активного транспорта, используя мембранные системы переноса катионов биометаллов. Соединения Cr (III) не способны в отличие от соединений Cr (VI) проникать через плазматическую мембрану и, как описано выше, не оказывают трансформирующее и генотоксическое действие. Вместе с тем внутриклеточное восстановление Cr (VI) с помощью ферментативных механизмов приводит к образованию Cr (III), который накапливается внутри клетки и является конечным кан-
церогеном, повреждающим ДНК (12]. Согласно другому предположению, канцерогенный эффект оказывает Cr (VI) — промежуточная форма восстановления хрома [13, 19].
Растворимые и нерастворимые соединения никеля, как и соединения хрома, индуцируют в клеточных тест-системах повреждения ДНК. Изучение соединений никеля проводилось главным образом на клетках млекопитающих. В тестах на бактериях они не давали мутагенного эффекта [29, 37].
Ионы металлов никеля образуют в организме липофиль-ные комплексы с органическими лигандами и, вероятно, в такой форме могут захватываться клетками. Мало растворимые соединения металлов захватываются клетками путем фагоцитоза, что имеет большое значение для проявления их канцерогенной активности. При этом соединения аморфной формы, например NiS, обладают слабой канцерогенной активностью, тогда как кристаллические формы NiS и Ni3S2 — сильные канцерогены. Предполагают, что канцерогенная активность кристаллических форм связана с их способностью легко захватываться клетками путем фагоцитоза, что выявлено на многих культурах клеток человека и животных. Установлено соответствие между фагоцитозом кристаллических и аморфных форм никеля и их способностью вызывать трансформацию клеток в культурах, а также проявлять канцерогенную активность у животных [II, 26, 35, 42].
Значительно меньше сведений имеется о генотоксичности соединений других металлов. Положительный эффект получен на культурах штаммов В. subtil is (разница в размере зоны ингибировання) при испытании соединений As, Cd, Pt, Os, Rh, Se, Te, Tl, V, Co, Mn, Mo. Слабое мутагенное действие обнаружено у соединений Со, Pl. Мп и не выявлено у соединений Al, Mg, Na и Zn [26, 29, 37]. Мутагенны некоторые комплексные соединения Pt. Хромосомные аберрации в культуре лимфоцитов человека индуцируют соединения Sb, Те, PI, Hg, Zn, Se, Pt [16, 18, 26, 41].
Итак, результаты исследований, полученные на различных тест-системах в условиях in vitro, дают основание считать, что генотоксическими являются соединения Cr, As, Ni, Be, Se, Pt, a возможно, и соединения Cd, Pb и Mn [43]. Сведений об исследовании других металлов, а также их сплавоп недостаточно, чтобы судить о наличии у ннх генотоксических свойств [44].
Имеющиеся данные литературы указывают на специфичность механизма действия каждого из металлов, а также их соединений. Использование краткосрочных тест-систем, особенно на клетках млекопитающих, может быть полезным для предварительной оценки их канцерогенной опасности.
Для экспрессного анализа перспективных изделий медицинского назначения, выполненных на полимерной основе, наиболее пригодны, как и для металлических имплантатов, опыты с использованием клеточных и тканевых культур [18 28, 31, 45]. Конечно, в опытах in vitro нельзя учесть многие факторы воздействия полимера на организм в целом. Однако такие опыты пригодны для предварительного скрининга и обладают существенными преимуществами легко воспроизводимы, возможность изучения непосредственного действия исследуемого соединения, а также его отдельных компонентов.
Последнее представляется чрезвычайно важным, так как биологическое действие полимеров может включать и эффекты воздействия отдельных мономеров, олигомеров низкой молекулярной массы или других веществ, являющихся составной частью полимерного материала. Полимеры, в частности, могут содержать пластификаторы, стабилизаторы и другие агенты, которые в свою очередь могут оказывать неблагоприятное воздействие на организм. При использовании полимеров в качестве имплантатов такой агент в течение длительного времени может диффундировать из него в окружающие ткани и вызвать в дальнейшем развитие опухолей. Известно, что мономеры, как правило, присутствующие во всех технических и медицинских марках полимеров, обладают высокой реакционной способностью и биологической агрессивностью. Они легко вызывают отрицательные реакции кожных покровов, слизистой оболочки и могут выступать в роли аллергенов и канцерогенов [1.4, 23, 45, 49].
Известны случаи заболевания раком печени у рабочих, занятых в производстве ноливинилхлорида, обусловленных воздействием на организм канцерогенного мономера вшшлхло-рида, бластомогенная активность которого подтверждена в экспресс-тестах на клетках млекопитающих [4, 26, 45]. В связи с этим возникает необходимость в краткосрочном изучении канцерогенной опасности всех полимерных материалов и, в частности, полимеров, предполагаемых к использованию в медицинской практике. Экспериментальные данные показывают, что с этой целью могут быть применены культуры человеческих клеток HF, мышиных клеток L929, культуры клеток фибробластов, клеточные культуры мышиных лнмфоы—бактериальные тест-системы. С помощью этих культур в последние
10 лет было протестировано, включая токсикологические исследования, свыше 650 материалов медицинского назначения. Среди них можно указать в первую очередь на материалы, используемые в урологии и трансфузиологии, различные катетеры, протезы сосудов и т. д. [4, 23, 24, 31, 36, 45, 49].
Проведенные исследования свидетельствуют о перспективности предложенного метода клеточных культур, который может дополнять или даже заменять трудоемкие эксперименты in vivo. Предложенные модели могут быть с успехом использованы не только для тестирования новых полимерных материалов, но и для проведения систематического контроля готовых изделии в процессе их эксплуатации [2, 49].
Оптимальной культурой клеток, используемой для экспрессного тестирования на канцерогенность, является культура фибробластов, характеризующаяся достаточно высокой степенью выживаемости в экспериментальных условиях культивирования. Кроме того, культура клеток фибробластов — наиболее адекватная модель, отражающая характер взаимодействия фибробластов человека с полимерным импланта-том в процессе опухолевого роста. Использование культуры клеток фибробластов. имеет и другие преимущества. В частности, в процессе роста этих клеток возможно изучение не только морфологических, но и других клеточных реакций на практически все химические вещества, вносимые в куль-туральную среду [2, 5, 9].
В некоторых случаях, учитывая особенности действия того или иного соединения, можно проводить исследование имплантатов, используя другие системы тестирования. Так, в работе Као дано описание культуральной системы — кожи мышей, разработанной для определения количественной оценки влияния различных полимеров, оказывающих раздражающее действие. Реакцию кожи на воздействие веществ определяли по ингибированию включения ]3Н]-тимиднна и [ИС]-лейцина ' в эпидермальную ДНК и белки [28]. Тест-система гетерозиготных клеток мышиной лимфомы L5178Y является удобной моделью для определения генных мутаций при изучении акриловых соединений, таких как акриловая кислота, ме-тилакрилат, этилакрилат, мстилметакрилат, зтилметакрилат и др. Все эти соединения вызывают хроматидные изменения и проявляют генотоксичность [3, 6].
Из изложенного следует, что, несмотря на довольно ограниченное число исследований по оценке биологического действия металлов и их соединений, используемых в материалах медицинского назначения, у некоторых из них можно констатировать наличие достаточно выраженных бластомоген-ных свойств.
Полимерные материалы могут оказывать канцерогенное действие на животных и человека различными путями:
а) канцерогенный агент вызывает развитие опухоли, оставаясь в полимерном материале; б) канцерогенный агент может образоваться в результате разрушения полимерного имплантата; в) опухоль может развиться как следствие физического воздействия имплантата.
Для определения потенциальных канцерогенных свойств, планируемых к внедрению в медицинскую практику металлических и полимерных материалов, а также входящих в их состав компонентов, целесообразно использование системы краткосрочных экспресс-методов оценки бластомогенной активности. В частности, для выявления генотоксических свойств полимерных материалов и их компонентов наиболее адекватны культуры соматических клеток человека и грызунов (в первую очередь фибробластов), клеток мышиных лнмфом и бактериальных тест-систем; для изучения мутагенного и класто-генного эффектов изделий из металлов оптимальной является система краткосрочных скрининговых тестов на клетках млекопитающих, главным образом яичников китайского хомячка.
Литература
1. Ацуми К. Полимеры медицинского назначения.— М., 1981.
2. Галатенко И. А., Яценко В. //. Оценка свойств синтетических полимеров с использованием метода тканевых культур.— Киев, 1986.
3. Нманиси Ю. Биополимеры.— М.. 1988.
4. Канцерогенные вещества.— М., 1987.
5. Пхакадзе Г. А. Биодеструктируемые полимеры.— Киев, 1990.
6. Русаков И. Г.. Щитков К. Г., Волохов А. Б. // Полимеры медицинского назначения,— М., 1988.— С. 175—184.
7. Сборник руководящих методических материалов.— М., 1987.
8. Шерстнев П. П. Полимеры в медицинской технике. -М„ 1980.
9. flueHKo B. Fl. h ap. // Uhtoji. 11 reHeT.— 1984.— JS» 4.— C. 280—284.
10. Ashby J. // Short Term Test System for Detecting Carcinogenesis.— New York, 1980,— P. 74—93.
11. Baker R. S. // Carcinogenic and Mutagenic Metal Compounds / Ed. E. Merian.— New York, 1985,— P. 269—293.
12. Bianchi V., Levis A. G. // Ibid.— P. 269—293.
13. Borges K. M. H Diss. Abstr. Int. B.— 1991.— Vol. 51, N 7,— P. 3359—3362.
14. Brookes P. U Mutat. Res.— 1981,— Vol. 86,— P. 233—242.
15. Barue W. F. et al. // Cancer (Philad).— 1969.— Vol. 29,— P. 66—73.
16. Cannata J. B., Doming J. L. // Vet. hum. Toxicol.— 1989.— Vol. 31, N 6,— P. 577—583.
17. Chioccu S. M. et al. // Proc. Ann. Meet. Amer. Ass. Cancer Res.— 1950.— Vol. 31.— P. A792.
18. Christie N. T„ Costa M. // Biol. Trace Elem. Res.— 1983.— Vpl. 5, N 1,— P. 55—71.
19. Coombs iV. A. et al. // Ibid.— 1989,— Vol. 21,— P. 445— 450.
20. Dalinka M. K. et al. 11 Radiology.— 1969.— Vol. 93.— P. 914—916.
21. Dieter H. H. // Schriftenr. Ver, Wasser, Boden-u. Lufthyg.—
1987,— N 74,— S. 205—217.
22. Dupe V. £., Fisher D. E. // Cancer (Philad.).— 1972,— Vol. 30.—. P. 1260—1266.
23. Fedtke N. et al. 11 Carcinogenesis.— 1990.— N 11 — P. 1287—1292.
24. Geiger L. et al. // Cancer Res.— 1983.— Vol. 43, N 7,— P. 3080—3087.
25. Genetic toxicology of ead compounds // Carcinogenesis.—
1988.— N 10,— P. 1727—1732.
26. Hansenk N.. Stern R. M. // Carcinogenic and Mutagenic Metal Compounds.— Ed. E. Merian.— New York, 1985.— P. 207—211.
27. Hayes R. E. // Biological and Environmental Aspects of Chromium.— Amsterdam, 1982,— P. 221—247.
28. Kao J. et al. // Toxicol, appl. Pharmacol.— 1983.— Vol. 67, N P. 206—217.
29. Karematsu N.. Nata M„ Kada T. 11 Mutat. Res.— 1975.— Vol. 31.— P. 185—189.
30. Kasprzak K. S., Hernandes L. Ц Cancer Res.— 1989.— Vol. 49.— P. 5964 —5968.
31. Kjetlstrand P.. Boberg U. // Scandinavian Cell Toxicology Congress, 10-th.— 1990,— P. 222—225.
32. Kochnar T. S. et al. // Proc. Ann. Meet. Amer. Ass. Cancer Res.— 1989,— Vol. 14, Suppl. 15.— P. 104.
33. Lohrer H. et al. 11 Carcinogenesis.— 1990.— N 11 — P. 1937—1941.
34. MacDougatl A. // J. Bone.— 1956.— Vol. 388,— P. 709— 710.'
35. Miura Т., Landolph J. R. // Environ. Mutagen.— 1987.— Vol. 9, Suppl. 8.— P. 190.
36. Moore M. et al. // Environ, moles. Mutagenes.— 1988.— Vpl. 11, N 1.— P. 49—63.
37. Nishioka H. 11 Mutat. Res.— 1975.— Vol. 31,— P. 185—189.
38. Oppenheimer B. S. et al. // Films Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.).— 1952,— Vol. 4,— P. 1433—1447.
39. Patierno S. R. et al. 11 FASEB J.— 1991.— Vol. 5, N 6,— P. 1603.
40. Rodrigues-Anrados F., Estvill J. // Rhinology.— 1987.— Vol. 25.— P. 213—215.
41. Sirover M. A. 11 Environ. Hlth Perspect.— 1981.— Vol. 40,— P. 163—172.
42. Sirover M. A., Loeb L. A. // Science.— 1976,— Vol. 194, N 4272,— P. 1434—1436.
43. Some Metals and Metalic Compounds.— Lyon, 1980.
44. Sunderman F. W. // Fund. appl. Toxicol.— 1989.— Vol. 13, N 2,— P. 205—216.
45. Some Monomers, Plastic and Synthetic Elastomers and Acrolein.— Lyon, 1979.
46. Strippler V. // Mschr. Unfallheilk.— 1959 — Bd 62,— S. 121 — 123.
47. Sunderman F. W. // Scand. J. Work. Environ. Hlth.— 1989.— Vol. 15, N 1— P. 1—2.
48. Tayton К. I.. Ewings N. // Cancer (Philad.).— 1980,— Vol. 45.— P. 413—415.
49. Thais B. R. // Rev. Cuba. Farm.— 1991,— Vol. 25, N 1,— P. 4—19.
50. Thompson I. R„ Entin S. D. 11 Cancer (Philad.).— 1969.— Vol. 23,— P. 936—939.
Поступила 07.10.93
© А. Г. МАЛЫШЕВА, 1994 УДК 614.72-074
А. Г. Малышева
АНАЛИТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЕЩЕСТВ СЛОЖНОГО СОСТАВА ПРИ ИХ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ
НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
При решении задач в области гигиены окружающей среды актуальными остаются проблемы контроля и гигиенического нормирования веществ, представляющих собой сложные многокомпонентные смеси. С точки зрения аналитической химии практически все объекты окружающей среды — это сложные смеси органических и неорганических веществ. Поэтому определение их состава — это аналитическая задача, без которой невозможно решать теоретические и методические вопросы гигиенической регламентации. В то же время с позиций гигиенического нормирования сложные многокомпонентные смеси иногда могут рассматриваться как самостоятельный объект изучения и регламентации. Это утверждение можно проиллюстрировать примером контроля загрязнения атмосферного воздуха жилой зоны в районах расположения предприятий пищевой промышленности, от которых в окружающую среду поступают наряду с твердыми частицами в виде пыли пищевых продуктов (например, пыли кофе, перца и др. при размоле, фасовке, упаковке и других технологических процессах на пищекомбинатах) и летучие органические вещества. Необходимо отметить особую гигиеническую значимость загрязнения окружающей среды предприятиями пищевой промышленности, которая проявляется многочисленными жалобами населения на наличие запаха в воздухе жилой зоны в районах расположения этих предприятий. В то время как содержание пыли можно контролировать простейшими весовыми методами, анализ летучих компонентов, включая запахи, требует использования эффек-
тивных аналитических методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью.
С целью совершенствования контроля и решения методических подходов к гигиеническому нормированию сложных смесей, входящих в состав выбросов производства пищевой промышленности, мы провели аналитическое исследование летучих компонентов перца. Изучен спектр органических веществ, выделяемых в окружающую среду 3 видами перца, в частности, черным, красным и душистым. Для исследования использовали хромато-.масс-спектрометр ЛКБ-2091 (Швеция), соединенный с компьютером РДР 11/34 (США)1. Летучие органические вещества определяли методом газовой экстракции. При этом способе анализа исследованию подвергали газовую фазу, находящуюся в равновесном состоянии с твердой, в данном случае с образцом перца. В результате этого проведено определение именно тех веществ, которые поступают в окружающую среду в процессе переработки, упаковки и хранения перца.
Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили при следующих условиях. Образец перца в количестве 100 г помещали в стеклянную колбу вместимостью 1 л с притертой пробкой и выдерживали его в темном месте в течение нескольких дней, чтобы установилось равновесное состояние
1 В проведении анализов принимал участие канд. хим. наук Е. Г. Растянников.
