CC BY
29УДК 616.594.171.2:611.31
ЭКСПРЕССИЯ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТАХ ПРИ КАНДИДОЗЕ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ
1Заславская М.И. (профессор кафедры), Александрова Н.А. (старший преподаватель)*, 2Китаева Е.В. (врач-стоматолог), 1Лукова О.А. (старший преподаватель), 1Махрова Т.В. (доцент), 1Кропотов В.С. (доцент)
1 Приволжский исследовательский медицинский университет; 2Клиника современной стоматологии, Нижний Новгород, Россия
Выявлено, что процент буккальных эпителиоцитов, экспресси-рующих TLR-2 и TLR-4, снижается при кандидозе ротовой полости. Установлено, что IL-6 и IL-8 способны регулировать экспрессию TLR-
2 и TLR-4 на буккальных клетках, однако цитокин-зависимые изменения в TLR-зависимых популяциях эпителиоцитов отличаются от соответствующих изменений при кандидозе полости рта.
Ключевые слова: кандидоз, Toll-подобные рецепторы, цитоки-ны, буккальные эпителиоциты
EXPRESSION OF TOLL-LIKE RECEPTORS ON BUCCAL EPITHELIAL CELLS IN CANDIDIASIS OF THE ORAL CAVITY
Zaslavskaya M.I. (professor of the department)1, Alexandrova N.A. (senior lecturer)1, Kitaeva E.V. (dentist)2, Lukova O.A. (senior lecturer)1, Makhrova T.V. (associate professor)1, Kropotov V.S. (associate professor)1
1 Privolzhsky Research Medical University; 2 Clinic of Modern Dentistry, Nizhny Novgorod, Russia
It was detected that the percentage of buccal epithelial cells expressing TLR-2 and TLR-4 decreased in oral candidiasis. It was founded that IL-6 and IL-8 can regulate TLR-2 and TLR-4 expression on buccal cells, but cytokine-dependent changes of TLR-2 and TLR-4 epithelial cell populations differed from the corresponding changes in oral candidiasis.
Key words: candidiasis, Toll-like receptors, cytokines, buccal epithelial cells
Контактное лицо: Александрова Наталья Александровна, e-mail: natalyuskova@rambler.ru
ВВЕДЕНИЕ
Развитие мукозального кандидоза зависит от многих факторов, в том числе от состояния местного иммунитета [1, 2]. В поддержании антикандидозной резистентности слизистых оболочек активное участие принимают эпителиоциты, продуцирующие антимикробные пептиды [3-5]. Клетки эпителия также наделены эффективной системой Toll-подобных рецепторов (TLRs), позволяющей транслировать сигнал о контакте с потенциальным патогеном на генетический аппарат клетки [6, 7]. Следствием этого является TLR-опосредованный синтез цитокинов и других медиаторов, координирующих активность врожденного и адаптивного иммунитета [2, 8]. Наиболее хорошо представленными TLRs на эпителиальных клетках человека являются эпимембранные молекулы TLR-2 и TLR-4 [1].
Цель исследования - изучение экспрессии Toll-подобных рецепторов - TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах при кандидозе ротовой полости.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В ходе работы было проведено измерение экспрессии Toll-подобных рецепторов TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах здоровых людей (16 человек), а также у 11 пациентов с кандидозом полости рта. Буккальные эпителиоциты получали путем соскоба с внутренней поверхности щеки. Эпителиальные клетки отмывали от слюны (40g, 5 мин) забуференным физиологическим раствором (ЗФР), готовили взвесь с концентрацией 108 кл/мл. Концентрацию эпителиоцитов определяли путем измерения оптической плотности суспензии на денситометре DEN-1 («Biosan», Латвия).
Экспрессию TLR на буккальных эпителиоцитах определяли методом проточной цитофлуориметрии. Исследование выполняли на проточном цитофлуо-риметре BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red, USA). Для калибровки прибора использовали программы BD Cytometer Setup and Tracking Beads (BD CS&T). Взвесь эпителиальных клеток пропускали через фильтры CellTricks с диаметром пор 100 мкм (Partec, Germany) и переносили в пробирки для цитофлуориметра. Эпителиальные клетки осаждали центрифугированием (40 g, 5 мин), к осадку добавляли 0,5 мл среды 199 с солями Хэнкса и глутами-ном (ПанЭко, г. Москва). В ряде экспериментов к эпи-телиоцитам добавляли цитокины (IL-6, IL-8). Пробы инкубировали (30 мин, 37 °С). Эпителиоциты из всех проб дважды отмывали ЗФР (40 g, 5 мин), к осадку клеток добавляли 100 мкл жидкости для цитофлуори-метра «Cell wash». Материал в пробирках перемешивали на механическом шейкере (Вортекс V3, Elmi, Латвия). Для выявления нежизнеспособных клеток к бук-кальным эпителиоцитам (100 мкл) добавляли 20 мкл 7-AAD (7-амино-актиномицин D) (BD Pharmingen, USA), выдерживали 15 минут в защищенном от света месте. Затем в каждую пробу добавляли смесь антител CD282 (5 мкл) и CD284 (5 мкл) (BD Pharmingen, USA) для обнаружения мембранных TLR-2 и TLR-4 на эпите-лиоцитах соответственно. В образец для определения спонтанного окрашивания добавляли 20 мкл жидкости «Cell wash». Эксперименты каждой серии ставили в трех повторах. Оценивали экспрессию TLRs на жизнеспособных буккальных эпителиоцитах, которые
Í--
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКОЛОГИЯ
отбирали на основании параметров бокового и
прямого светорассеивания.
Результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы FacsDiva 4.1. и вычисляли в процентах как отношение числа эпителиоцитов, презентирующих на своей поверхности TLR-2 и/или TLR-4, к общему количеству жизнеспособных клеток в пробе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный анализ показал, что жизнеспособность эпителиальных клеток полости рта, полученных от больных кандидозом ротовой полости, не отличается от соответствующего показателя у здоровых людей. Так, процент жизнеспособных эпителиоцитов у больных кандидозом полости рта составлял 99,7±0,24, у здоровых лиц - 99,1±0,53 (р>0,05).
Установлено, что у здоровых людей процент всех буккальных эпителиоцитов в популяции, способных экспрессировать TLR-4 (TLR-4-позитивные клетки), был всегда выше, чем процент TLR-2-позитивных клеток (Рис. 1, табл.1). В то же время у пациентов с канди-дозом ротовой полости наблюдали обратное соотношение: процент TLR-4-позитивных клеток был ниже, чем TLR-2-позитивных. При этом на фоне кандидоза полости рта в 5,6 раз уменьшилась субпопуляция клеток, экспрессирующих одновременно TLR-2 и TLR-4 (р<0,05) (Рис.1).
а) здоровые доноры б) больные кандидозом
(контроль) полости рта
Рис. 1. Экспрессия ^^-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах у здоровых доноров и больных кандидозом ротовой полости, где:
СИ - TLR-2/4 - негативные клетки;
НИ - клетки, экспрессирующие только TLR-2;
НИ - клетки, экспрессирующие ^^-2/4;
НИ - клетки, экспрессирующие только TLR-4.
В итоге на фоне кандидоза ротовой полости процент TLR-2- и TLR-4-позитивных клеток снижался в 1,4 и 9,5 раз соответственно (р<0,05) и, одновременно, увеличивался процент TLR-2/4-негативных клеток (р<0,05) по сравнению с показателями в группе здоровых доноров (табл. 1).
Таблица 1
Процент буккальных эпителиальных клеток, способных к экспрессии ИК2 и Т1_Р4, у здоровый людей и при кандидозе
полости рта
Группы пациентов Т1_К-2-позитивные клетки в популяции (%) Т1_К-4-позитивные клетки в популяции (%) Т1_К-2/4-негативные клетки в популяции (%)
Здоровые доноры 22,4 ± 4,2 42,8±3,5 53,8 ± 4,1
Больные кандидозом полости рта 16,1 ± 4,7* 4,5 ±1,6* 82,8 ± 4,7*
* - достоверность различий относительно здоровых
доноров (р<0,05).
Снижение числа буккальных эпителиоцитов, имеющих TLR-2 и TLR-4 на фоне кандидоза полости рта, указывало на активную метаболическую перестройку клеток и могло быть обусловлено димеризацией активированных TLRs [9, 10] и/или их шеддингом [11]. В последнем случае уменьшение количества рецепторов идет за счет протеолитического отщепления внеклеточной части мембранных рецепторов с поверхности клеток [11].
Вероятно, что направленность изменений экспрессии TLRs на эпителиальных клетках при кандидозе может коррелировать с развитием воспалительной реакции, медиаторами которой выступает ряд цитоки-нов, таких как ^-6 и ^-8 [12-14]. В связи с этим мы исследовали влияние ^-6 и ^-8 на экспрессию TLR-2 и TLR-4 буккальными эпителиоцитами.
Выявили, что цитокины ^-6 и ^-8 способны регулировать экспрессию TLRs на буккальных эпителио-цитах (табл. 2).
Таблица 2
Влияние И-6 и И-8 на способность эпителиальных клеток
к экспрессии и
Группы клеток Препозитивные клетки в популяции (%) Т1_Р-4-позитивные клетки в популяции (%) Т1_К-2/4-негативные клетки в популяции (%)
Интактные эпителиоциты 22,4 ± 4,20 42,8± 3,5 53,8 ± 4,1
11_-6- стимулированные эпителиоциты 14,9 ± 2,07* 50,4± 5,05* 20,7±3,6
11_-8- стимулированные эпителиоциты 24,9±1,30 47,5±3,15 34,6±5,2
* - достоверность различий относительно интакт-ных клеток (р<0,05).
Так, воздействие ^-6 приводило к снижению процента TLR-2-позитивных клеток, одновременно повышая процент клеток, способных экспрессировать TLR-4. После инкубации буккальных эпителиоцитов с ^-8 процент TLR-2- позитивных клеток существенно не изменялся, при этом наблюдали тенденцию к увеличению процента TLR-4-позитивных клеток (табл. 2). Установлено, что количественные изменения TLR-2- и TLR-4-популяций эпителиоцитов после воздействия провоспалительных цитокинов отличаются от динамики популяционных изменений, характерных для кандидоза полости рта. Это может свидетельствовать о том, что факторами, окончательно определяющими направление и интенсивность перестройки TLR-аппарата эпителиальных клеток при кандидозе ротовой полости, по-видимому, являются микробные компоненты.
ВЫВОДЫ
Кандидоз полости рта приводит к изменению экспрессии TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах, не оказывая существенного влияния на жизнеспособность клеток.
При кандидозе ротовой полости снижается процент эпителиоцитов, способных экспрессировать TLR-2 и TLR-4. При этом наиболее сильно уменьшается популяция TLR-4-позитивных эпителиоцитов.
Воздействие ^-6 и ^-8 может влиять на экспрессию TLR-2 и TLR-4 буккальными клетками, однако не вносит решающий вклад в популяционные изменения
1. Moyes D.L., Naglik JR. Mucosal Immunity and Candida albicans Infection. Clin. Dev. Immunol. 2011: 346307. https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.
2. Ross K.F., Herzberg M.C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infect. 2016; 18 (6): 387-398.
3. Weindl G., Wagener J., Schaller M. Epithelial cells and innate antifungal defense. J. Dent. Res. 2010; 89 (7): 666-675.
4. Moffa E.B., Mussi M.C., Xiao Y., et al. Histatin 5 inhibits adhesion of C. albicans to Reconstructed Human Oral Epithelium. Front Microbiol. 2015: 00885. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.
5. Hans M., Madaan H.V. Epithelial antimicrobial peptides: guardian of the oral cavity. Int. J. Pept. 2014; 2014: 370297.
6. Sasai M., Yamamoto M. Pathogen recognition receptors: ligands and signaling pathways by toll-like receptors. Int. Rev. Immunol. 2013; 32: 116-3310.
7. McClure R., Massari P. TLR-dependent human mucosal epithelial cell responses to microbial pathogens. Front. Immunol. 2014; 12 (5): 386.
8. Bahri R., Saidane-Mosbahi D., Rouabhia M. Candida famata modulates toll-like receptor, beta-defensin, and proinflammatory cytokine expression by normal human epithelial cells. J. Cell. Physiol. 2010; 222 (1): 209-218.
9. Катунина О.Р. Функции Toll-подобных рецепторов как компонента врожденного иммунитета и их участие в патогенезе дерматозов различной этиологии. Vestn. Dermatol. Venerol. 2011; 2: 18-25. [Katunina O.R. Funkcii Toll-podobnyh receptorov kak komponenta vrozhdennogo immuniteta i ih uchastie v patogeneze dermatozov razlichnoj etiologii. Vestn. Dermatol. Venerol. 2011; 2: 18-25 (In Russ)].
10. Botos I., Segal D. M., Davis DR. The structural biology of Toll-like receptors. Structure. 2011; 19 (4): 447-59.
11. Langjahr P., Díaz-Jiménez D., De la Fuente M., et al. Metalloproteinase-dependent TLR2 ectodomain shedding is involved in soluble toll-like receptor 2 (sTLR2) production. PLoS One. 2014; 9 (12).
12. Шабашова Н.В., Данилова Е.Ю. Местный иммунитет и микробиота ротовой полости (обзор). Проблемы медицинской микологии. 2015; 17 (4): 4-13. [Shabashova N.V., Danilova E.Y. Mestnyj immunitet i mikrobiota rotovoj polosti (obzor). Problemy medicinskoj mikologii. 2015; 17 (4): 4-13 (In Russ)].
13. Rincon M., Irvin C.G. Role of IL-6 in asthma and other inflammatory pulmonary diseases. Int. J. Biol. Sci. 2012; 8 (9): 1281.
14. Hunter C.A., Jones S.A. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease. Nat. Immunol. 2015; 16 (5): 448-457. Поступила в редакцию журнала 18.06.2019
Рецензенты: Н.А. Новикова, Н.В. Шабашова
