CC BY
27
Том 8. № 1 2014
www.annaly-nevrologii.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Фундаментальная неврология
Экспрессия Pgp в клетках нейроваскулярной единицы
при перинатальном гипоксически-ишемическом повреждении головного мозга
А.В. Моргун, Т.Е. Таранушенко, Н.А. Малиновская, О.С. Окунева, С.И. Устинова, Л.Н. Карпова, А.Б. Салмина, Е.А. Пожиленкова,
Д.И. Лалетин, О.В. Фролова, Н.В. Реушева, Л.В. Труфанова
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого
В статье приведены результаты исследований, выполненных на 35 крысятах возрастом 10 сут. Оценены особенности экспрессии Р-гликопротеи-на (рр) в клетках головного мозга нейрональной, астроцитарной и эндотелиальной природы после перенесенного перинатального гипоксически-ишемического повреждения. Обнаружено значимое увеличение экспрессии Pgp в астроцитах в первые 4 часа ишемии, в нейронах и эндотелиоци-тах - в первые 12 часов ишемии. Обсуждается роль увеличения экспрессии Pgp в патогенезе ишемического повреждения головного мозга.
Ключевые слова: Р-гликопротеин^р, перинатальное повреждение головного мозга, нейроваскулярная единица.
Введение
Исследование выполнено при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-4818.2012.7.
Белок лекарственной устойчивости P-гликопроте-ин (Pgp) является трансмембранным АТФ-зави-симым насосом, удаляющим химические вещества из цитоплазмы клеток [7]. В центральной нервной системе Pgp в основном экспрессиру-ется на эндотелиоцитах, входящих в состав гематоэнцефа-лического барьера, и локализуется на поверхности цито-плазматической мембраны, эндоплазматического ретику-лума и мембранах комплекса Гольджи [4]. Показано, что при сокультивировании астроцитов и эндотелиоцитов in vitro локальный окислительный стресс, вызванный аст-роцитами, приводит к усилению экспрессии Pgp на эндотелиоцитах [5]. В некоторых работах указывается на локализацию Pgp на астроцитах и нейронах. Другие авторы не подтверждают локализацию Pgp на нейронах головного мозга [8, 11]. Это стимулирует исследования возможной роли Pgp в реализации функциональной активности клеток нейроваскулярной единицы, в т.ч. в контексте регуляции проницаемости гематоэнцефалического барьера в норме и при патологии.
Pgp относится к суперсемейству ABC-транспортеров (ATP-binding cassette). К ABC-семейству относят более сотни транспортных белков, обнаруженных у разных организмов - от бактерий до человека [10]. Белки этого суперсемейства транспортируют самые разнообразные субстраты - от неорганических ионов до полисахаридов и белков. Отмечается снижение в клетках с повышенной функцией Pgp накопления любого вещества, являющегося субстра-
том для Pgp. Такие вещества быстрее высвобождаются из Pgp-положительных клеток, в то же время ингибиторы функции Pgp тормозят процесс экструзии препаратов. В литературе описано, что при гиперэкспрессии белка лекарственной устойчивости возникает полирезистентность к различным лекарственным препаратам при бронхиальной астме и при онкопатологиях (рабдомиосаркомы, остеосаркомы) [1—3].
Уровень экспрессии Pgp на эндотелиоцитах играет роль в биодоступности многих метаболитов и веществ для головного мозга. Было высказано предположение, что Pgp играет роль в элиминации Ар белков при болезни Альцгеймера [6]. Однако роль Pgp в центральной нервной системе (ЦНС) при гипоксии-ишемии изучена не до конца. Известно, что, с одной стороны, Pgp предотвращает негативное влияние цитокинов на ЦНС, а с другой -препятствует проникновению лекарственных веществ в ЦНС и снижает эффективность терапевтических мероприятий [9].
Цель исследования: изучить особенности экспрессии Pgp в клетках головного мозга при перинатальном гипоксиче-ски-ишемическом поражении.
Материалы и методы_
Объект исследования - белые беспородные крысята в возрасте 10 сут ^10) в количестве 35. Все животные были разделены на группы по семь особей: контрольная группа (ложнооперированные животные), четыре экспериментальных группы - через 4, 12, 24, 72 часа после моделирования гипоксии-ишемии (группы 1, 2, 3 и 4 соответственно). Моделирование перинатального гипоксически-ише-мического поражения головного мозга проводилось по
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Фундаментальная неврология
Экспрессия Pgp в клетках НВЕ при перинатальной гипоксии-ишемии
методу J. Rice (1989) путем постоянной окклюзии правой общей сонной артерии (ОСА) с последующим помещением крысят в атмосферу с низким содержанием кислорода (8%). Животных декапитировали после охлаждения на льду и производили забор лобных областей головного мозга справа. Условия содержания и обращения с экспериментальными животными соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki, 2000).
Суспензию клеток получали путем ферментативной обработки (10 мг/мл трипсина, 1 мг/мл коллагеназы), затем готовили препараты по типу «толстой капли», высушивали при комнатной температуре и в последующем хранили при температуре -20°C до использования. Детекция экспрессии Pgp на клетках нейроваскулярной единицы проводилась на суспензии клеток путем одновременного или последовательного комбинированного окрашивания препарата антителами к следующим белкам: Pgp (белок лекарственной устойчивости, PE-метка), нейронспецифи-ческая енолаза - NSE - маркер нейронов; глиальный фибриллярный кислый белок - GFAP - маркер астроцитов; CD31 - маркер эндотелиоцитов сосудов (FITC-метка) согласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноцитохимии. С помощью люминесцентной микроскопии при увеличении х900 в суспензии подсчитывали количество клеток, соэкспрессирующих Pgp, и маркер вида клеток (NSE, GFAP или CD 31) в % на 100 клеток при анализе не менее 10 полей зрения.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной (М+о) и непараметрической статистики (критерий Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса, Уилкоксона) при уровне значимости р<0,05 (*).
Результаты_
Фотографии клеток представлены на рис. 1, данные о количестве клеток нейроваскулярной единицы, экспрес-сирующих на своей поверхности белок лекарственной устойчивости - в табл. 1.
таблица 1: Количество Рдр-позитивных клеток (в % от общего количества клеток).
Группы животных Нейроны (NSE+) Астроциты (GFAP) Эндотелиоциты (CD31+)
Контрольная группа (п=7) 0 1,7±1,1 3,3±0,8
Экспериментальная группа 1 (гипоксия-ишемия 4 ч, п=7) 11,3±3,4* 16,3±4,9* 8,7±2,7*
Экспериментальная группа 2 (гипоксия-ишемия 12 ч, п=7) 19,8±5,2* 17,3±5,3* 18±1,1*
Экспериментальная группа 3 (гипоксия-ишемия 24 ч, п=7) 22±2,1* 27,1±5,6* 19±2,4*
Экспериментальная группа 4 (гипоксия-ишемия 72 ч, п=7) 18±5,5* 13,7±3,1* 20,8±1,7*
Примечание: * - уровень значимости р<0,05.
ГКГ
Л CD3
\4
V*
~GFAP | PgP ,
рис. 1: Иммуноцитохимическая детекция клеток, соэкспрессирующих Рдр и
маркер вида клеток (люминесцентная микроскопия, х900): слева - соэкспрессия Рдр и CD31 (маркера эндотелиоцитов), в центре - Рдр и GFAP (маркера астроцитов), справа - Рдр и NSE (маркера нейронов).
При изучении соэкспрессии ШЕ и Р§р на нейронах в образцах гомогената ткани головного мозга контрольной группы не было обнаружено клеток, экспрессирующих Р§р. Однако при перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга отмечался статистически значимый (р<0,05) рост количества нейронов, экспрессирующих Р§р, в сравнении с контролем: уже через 4 часа с момента моделирования гипоксии-ишемии - 11%, через 12 часов -почти 20%, далее отмечалась «стабилизация» этих значений в пределах 20%.
В контрольной группе мы обнаружили незначительное количество астроцитов и эндотелиоцитов, экспресси-рующих на своей поверхности белок лекарственной устойчивости - около 2% астроцитов и 3% эндотелиоцитов. Подобно увеличению экспрессии Р§р, после перенесенной перинатальной гипоксии-ишемии количество Р§р-иммунопозитивных астроцитов и клеток эндотелия существенно возрастало. Отмечался статистически значимый (р<0,05) рост количества астроцитов и эндотелиоцитов, экспрессирующих Р§р, во всех группах при развитии перинатальной гипоксии-ишемии, в сравнении с соответствующими показателями контрольной группы: через 4 часа количество экспрессирующих Р§р-астроци-тов увеличилось до 16%, эндотелиоцитов - до 9%, через 12 часов - около 17% астроцитов и 18% эндотелиоцитов, через 24 ч - 27% Р§р+ астроцитов и 20% эндотелиоцитов, через 72 ч - около 14% Р§р-экспрессирующих астроцитов и 21% эндотелиоцитов.
Обсуждение
Интересен тот факт, что процент Р§р+ эндотелиоцитов при развитии гипоксии-ишемии головного мозга достигает максимальных значений в пределах 18-20% уже к 12 часам, оставаясь стабильно высоким и через 24-72 ч с момента развития ишемии. Процент Р§р-экспрессирующих астро-цитов достигает максимальных значений значительно позже (через 24 ч) с момента развития перинатальной гипоксии-ишемии, через 72 ч отмечалось снижение количества Р§р+ астроцитов до значений, близких к соответствующим показателям групп 1-2.
Можно предположить, что увеличение экспрессии Р§р играет защитную роль и отмечается спустя некоторое время с момента развития перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга. На ее фоне развивается повышенная устойчивость к ксенобиотикам и продуктам метаболизма, что является защитной реакцией клеток головного мозга (в особенности нейронов) в условиях кислородного голодания.
Том 8. № 1 2014
www.annaly-nevrologii.ru
Таким образом, первыми клетками, реагирующими на гипок-сически-ишемическое повреждение, являются астроциты: Pgp+ астроциты появляются в большом количестве уже через 4 часа с момента развития гипоксии-ишемии, они же являются клетками, сильнее всего реагирующими на гипоксию-ишемию (отмечается максимальное количество Pgp+ астроцитов - около 30%, в отличие от максимального количества нейронов и эндотелиоцитов - по 20%). Затем реагируют эндотелио-циты и нейроны (экспрессия Pgp достигает субмаксимальных значений через 12 часов), причем эндотелиоциты являются клетками с самым длительным повышением экспрессии
белка лекарственной устойчивости (максимальное количество Pgp+ эндотелиоцитов отмечается через 72 часа).
Полученные нами результаты представляют особенный интерес с точки зрения астроглиального контроля экспрессии Pgp на эндотелиоцитах. Эти результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что астроциты могут играть роль в усилении экспрессии Pgp на эндотелиоцитах [5], однако в этом процессе могут участвовать не только активные формы кислорода, вырабатываемые астроцитами, но и белок-транспортер Pgp, экспрессируемый на их поверхности.
Список литературы
1. Андрианов А.В., Моргун А.В., Таранушенко Т.Е., Салмина А.Б. Значение маркеров прогрессии при остеосаркомах у детей. Сибирск. онкологич. журн. 2008; 5: 37-40.
2. Демко И.В., Салмина А.Б., Моргун А.В., Малиновская Н.А. Экспрессия Р-гликопротеина на лимфоцитах периферической крови при тяжелых формах бронхиальной астмы и его роль в определении чувствительности к терапии глюкокортикостерои-дам. Пульмонол. 2007; 3: 41-46.
3. Моргун А.В., Таранушенко Т.Е., Салмина А.Б. Значение уровня экспрессии Р-гликопротеина при остеосаркомах у детей. Врач-аспирант 2006; 15: 519-524.
4. Chan H.S., Grogan T.M., Haddad G. et al. P-glycoprotein expression: Critical determinant in the response to osteosarcoma chemotherapy. J. Natl. Cancer Inst. 1997; 89: 1706-1715.
5. Gaillard P.J., Van Der Sandt I.C., Voorwinden L.H. et al. Astrocytes increase the functional expression of P-glycoprotein in an in vitro model of the blood-brain barrier. Pharm. Res. 2000; 17 (10): 1198-1205.
6. Kuhnke D., Jedlitschky G., Grube M. et al. MDR1-P-glycoprotein (ABCB1) mediates transport of Alzheimer's amyloid-OI peptides -Implications for the mechanisms of Aß clearance at the blood-brain barrier. Brain Pathol. 2007; 17 (4): 347-353.
7. Putman M., van Veen H.W., Konings W.N. Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64: 672-693.
8. Ronaldson P. T., Bendayan M., Gingras D. et al. Cellular localization and functional expression of P-glycoprotein in rat astrocyte cultures. J. Neurochem. 2004; 3: 788-800.
9. Salmina A.B., Inzhutova A.I., Malinovskaya N.A., Petrova M.M. Endothelial dysfunctions and repair in Alzheimer-type neurodegeneration: neuronal and glial control. J. Alzheimers Dis. 2010; 22 (1): 17-36.
10. Sarkadi B., Homolya L., Szakacs G., Varadi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters: Participation in a chemoim-munity defense system. Physiol. Rev. 2006; 86: 1179-1236.
11. Volka H.A., Burkhardt K., Potschka H. et al. Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures. Neurosci. 2004; 123 (3): 751-759.
Expression of Pgp in cells of neurovascular unit in perinatal hypoxic-ischemic brain injury
A.V. Morgun, T.E. Taranushenko, N.A. Malinovskaya, O.S. Okuneva, S.I. Ustinova, L.N. Karpova, A.B. Salmina, E.A. Pozhilenkova,
D.I. Laletin, O.V. Frolova, N.V. Reusheva, L.V.Trufanova
Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-Yasenetsky Keywords: P-glycoprotein/Pgp, perinatal brain injury, neurovascular unit.
We have studied peculiarities of P-glycoprotein (Pgp) expression on neuronal, astroglial and endothelial cells in newborn rats (P10) underwent perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Expression of Pgp was markedly elevated in all the cells tested reaching the
highest levels in astrocytes (4 hrs after injury) followed by increased levels in neuronal and endothelial cells (12 hrs after injury). The possible role of Pgp in pathogenesis of perinatal brain injury is discussed.
_ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Фундаментальная неврология
Экспрессия Pgp в клетках НВЕ при перинатальной гипоксии-ишемии
Контактный адрес: Малиновская Наталия Александровна - канд. мед. наук, науч. сотр. НИИ молекулярной медицины и патобиохи-мии, доц. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. 660022, Красноярск, ул. П. Железняка, д. 1. Тел.: +7 (391) 228-07-69, факс: +7 (391) 228-08-60; reg.kgmu@gmail.com;
Моргун А.В. - асс. каф. педиатрии Института последипломного образования;
Таранушенко Т.Е. - зав. каф. педиатрии Института последипломного образования;
Окунева О.С. - науч. сотр. НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, старш. препод. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии;
Устинова С.И. - доц. каф. педиатрии Института последипломного образования;
Карпова Л.Н. - асс. каф. педиатрии Института последипломного образования;
Салмина А.Б. - проректор по инновационному развитию и международной деятельности, зав. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, руководитель НИИ молекулярной медицины и патобиохимии;
Пожиленкова Е.А. - исп. директор НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, доц. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии;
Лалетин Д.И. - врач-хирург операционного отделения Красноярской краевой клинической больницы; Фролова О.В. - науч. сотр. НИИ молекулярной медицины и патобиохимии;
Труфанова Л.В. - декан фармацевтического факультета, доц. каф. биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии.
