CC BY
159
© коллектив авторов, 2013 Ук 616.72-006.33.04:577.21.08
И.в. Булычева, Н.Е. Кушлинский, Ю.Н. Соловьев, М.Д. Алиев
экспрессия молекулярно-биологических маркеров в высокодиооеренцированной хондросаркоме и пограничных хрящевых опухолях
ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва
Среди широкого спектра злокачественных новообразований опухоли костей занимают особое место в патологии человека, являясь в диагностическом аспекте одним из наиболее сложный: разделов. Диагностика и лечение хрящевыгх новообразований скелета являются одними из самым малоизученный: и трудный: областей в онкологии, при этом хрящевые опухоли значительно различаются по морфологии, клиническому течению и биологическим проявлениям, а оценка их прогноза на основе изучения только гистологических препаратов крайне затруднительна. Нередко доброкачественные опухоли проявляют себя в последующем активным и агрессивным течением, а злокачественные опухоли могут протекать латентно. Применение дополнительным иммуногистохимических показателей экспрессии ряда маркеров является высокоэффективным методом, помогающим в решении одной из наиболее сложных задач, проведении дифференциальной диагностики между агрессивной (пограничной) хондромой и высокодифференцированной хондросаркомой, и что особенно важно, при выделении группы больных с менее агрессивно протекающими хрящеобразующими опухолями, для который: возможно применение сохранный: хирургических операций с хорошими отдаленными результатами лечения. Атипические хрящевые опухоли/высокодифференцированная хондросаркома отличаются местно агрессивным течением и редко метастазируют, лишь малый процент ЮН1-мутаций могут быть выявлены при помощи специфического IDH12R132H-антитела. Степень дифференцировки опухоли является важнейшим критерием прогноза. В первичной опухоли у преобладающего числа больных с хондросаркомой кости выявляется экспрессия матриксныгх металлопротеиназ (ММР) и их тканевого ингибитора 1-го типа (ПМР-1): ММР-1 (84,6%), ММР-2 (71,8%), ММР-9 (97,4%), Т1МР-1 (82,3%), а уровни экспрессии вышеуказанный: маркеров могут колебаться от 10 до 60%. Наличие в хондросаркомах экспрессии ММР-1 указывает на неблагоприятное течение заболевания и достоверно связано с показателями безрецидивной и общей выживаемости больных, а Вах - с безрецидивной выживаемостью. Высокий коэффициент соотношения уровня экспрессии ММР-1/ПМР-1 является достоверным признаком агрессивного биологического потенциала у больных с пограничными хондромами. Специфичность ММР-1 к фибриллярному коллагену, а ММР-2 к структурам базальныгх мембран играет ведущую роль в протеолитической активности и инвазивности опухоли. Соотношение экспрессии ММР/Т1МР-1 может являться прогностическим критерием, определяющим местный инвазивный рост и метастазирование хрящеобразую-щих опухолей с различным биологическим потенциалом. Мультидисциплинарный подход, сочетающий клинические, рентгенологические, молекулярно-биологические и генетические данные, трудно переоценить.
Ключевые слова: атипические хрящевые опухоли; высокодифференцированная хондросаркома; иммуногистохимия
Биологический потенциал и клинические проявления пограничных хрящевых опухолей и высокодифференцированной хондросаркомы широко варьируют от латентно протекающих, неметастазирующих опухолей до агрессивных сарком. Современная классификация ВОЗ 2013 г содержит рубрику промежуточных (локально агрессивных) опухолей, в которую входит высокодифференцированная хондросаркома и атипическая хондрома [1, 2]. Насколько сложно провести черту между этими двумя опухолями? Является ли кюретаж надежным хирургическим методом, какова роль и доля морфологического и рентгенологического исследования в постановке диагноза пограничной хрящевой опухоли? Помогает ли иммуногистохимия установить биологический потенциал пограничной хрящевой опухоли? В настоящем исследовании мы постарались найти ответы на поставленные вопросы.
Хондрома (энхондрома) - интрамедуллярная опухоль, состоящая из гиалинового хряща, составляет 15,6% от всех доброкачественных костных опухолей, более половины случаев поражает мелкие кости кистей и стоп. Истончение кортикального слоя кости, патологический перелом, изъе-денность внутренней поверхности кортикальной пластинки характерны для хондромы мелких костей. Гистологически хондрома построена из долек хрящевой ткани, клеточность
Для корреспонденции:
Булычева Ирина Владиславовна, д-р мед. наук, врач-патологоанатом Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24 E-mail: irena@boulytcheva.com
и митотическая активность в опухоли, как правило, не выражены, отсутствует инфильтративный рост. Метод магнитного резонанса наиболее отчетливо характеризует наличие хрящевой ткани.
Атипическая хондрома выделена в особую рубрику на основании признаков, характеризующих более агрессивное поведение опухоли. Для атипической хондромы характерна клеточность, очаговый миксоматоз, полиморфизм ядер, повреждение кортикала, патологический перелом, ремодели-рование кости, больший объем поражения. Все данные признаки необходимо анализировать в комплексе [3, 4]. Для эффективной диагностики хрящевых новообразований скелета необходим мультидисциплинарный подход, а выбор участка пораженной кости для пункционной биопсии должен обсуждаться коллегиально, причем, гистологические отличия доброкачественных и злокачественных хрящевых опухолей костей часто переплетаются и не всегда ярко выражены. Кроме того, признаки злокачественности могут присутствовать локально только в нескольких мелких фрагментах опухолевой ткани, что приводит к разночтениям, диагностическим неточностям, особенно при мелких биоптатах, а степень диф-ференцировки хондросаркомы также порой основывается на субъективных морфологических критериях. Рентгенологическая и гистологическая классификация степени зрелости хрящевых опухолей обладает ограниченной прогностической ценностью, а оценка прогноза опухоли на основе изучения гистологических препаратов крайне затруднительна. Нередко доброкачественные опухоли проявляют себя в последующем активным и агрессивным течением, а злокачественные опухоли могут протекать латентно. Для дифференциальной
диагностики необходимы данные как морфологического, так и рентгенологического исследований, причем по данным Международной экспертной комиссии считается, что доля морфологического исследования (коэффициент к) составляет 0,443 для патологов и 0,345 для радиологов (р<0,00001 для обеих специальностей).
Пограничные хрящевые опухоли клинически и рентгенологически протекают по-разному, в некоторых публикациях указывается на повышенный риск локальных рецидивов щадящих экономных операций [5]. По-прежнему гистологическая степень дифференцировки опухоли является основным прогностическим критерием и не теряет своего значения. В настоящем исследовании рассмотрен ряд молекулярно-биологических маркеров, как возможных показателей "биологического поведения" опухоли [6].
В последние годы особый интерес в клинической онкологии в области изучения костных опухолей привлекают различные тканевые, клеточные и молекулярные маркеры, характеризующие фундаментальные «биологические» свойства опухоли, а именно: пролиферативную и инвазивную способности, активность апоптоза и неоангиогенеза, склонность к метастазированию, в основе способности раковых клеток к инвазивному росту и гематогенному метастазиро-ванию может быть активация матриксных металлопротеиназ (ММП), которые участвуют в разрушении внеклеточного ма-трикса при росте злокачественных опухолей и механизмов неоангиогенеза в первичной опухоли и ее метастазах [7]. При этом известно, что контроль за действием ММР осуществляют тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP). Баланс между экспрессией ММР и TIMP непостоянен как при физиологических процессах, сопровождающихся ростом и развитием тканей, так и при различных патологиях, в том числе и онкологических заболеваниях. Однако роль ММР и Т1МР в механизмах роста и прогрессии опухолей костей до конца не ясна. В опухолях с высоким соотношением MMP-1/TIMP-1 увеличенная протеолитическая активность против коллагенов I, II, III типов, а также сниженная экспрессия TIMP-1, могут вызывать деградацию и ремоделирование внеклеточного матрикса, которые считаются основными признаками мета-стазирования при хондросаркоме. Все это свидетельствует о прямой связи и влиянии экспрессии MMP-1 и TIMP-1 в прогрессии хондросаркомы, а их соотношение может служить базой для систем стадирования, оценки степени дифферен-цировки опухоли, выживаемости и развития локальных рецидивов при хондросаркоме [8, 9].
Циклооксигеназа (COX) или простагландин G/H-синтаза является связанным с мембраной ферментом, лимитирующим скорость превращения арахидоновой кислоты (АК) в простаноиды и экспрессируется по крайней мере в трех изоформах. Большая часть ПГЕ2, продуцируемого в кости, является результатом индукции экспрессии COX-2 в остеобластах. В нормальных остеобластах экспрессия COX-2 низкая, но легко повышается под воздействием многих факторов, в том числе ПГ в кости [10-12]. Полагают, что продукция COX-2 стимулирует формирование зрелой кости остеобластами. Эти эффекты ПГЕ2 на активацию процессов дифференцировки и снижение пролиферации остеобластов указывают, что обычная экспрессия COX-2 в норме оказывает противоопухолевый эффект на остеобласты. Известно, что COX-2 играет важную роль в ангиогенезе. В нескольких исследованиях отмечена сильная ассоциация между повышенным уровнем экспрессии COX-2 и плохим прогнозом при хондросаркомах, а также при низкой степени дифферен-цировки опухоли [13-15].
Базальные мембраны, их основные белки и, в частности, коллаген IV типа (Coll-IV) и ламинин служат не только структурным барьером, препятствующим инвазии и мета-стазированию рака, но и являются важной функциональной единицей, которая участвует в опухолевой прогрессии. Известно, что нарушение взаимодействия клеток опухоли с главными составляющими компонентами базальной мем-
браны, такими как Coll-IV, ламинин, способствует изменению биологического поведения раковых клеток, влияет на их пролиферацию, адгезию и подвижность. Coll-IV относится к нефибриллярным типам коллагена, который образует базаль-ные мембраны как нормальных, так и опухолевых клеток и влияет на биологическую активность новообразований различных локализаций, в том числе и сарком костей.
Особое внимание исследователей привлекает семейство белка Bcl, которое играет важную роль в регуляции мито-хондриальной цепи апоптоза и состоит из двух классов протеинов: проапоптотических (Bax, Bik, Bak, Bad, Bcl-xs) и антиапоптотических (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1). Именно соотношение ингибиторов и активаторов может определять предрасположенность клетки к апоптозу, а при наличии в клетке дефектных молекул Bax нарушается механизм нормальной ее гибели. До настоящего времени не понятно, как белки семейства Bcl ингибируют апоптоз, хотя показано, что эти молекулы взаимодействуют на поверхности митохондрий для поддержания нормального тканевого гомеостаза. Относительно недавно стало ясно, что разбалансирование механизмов апоптоза может быть вовлечено в развитие злокачественного роста, а цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов основано на торможении этого процесса. Поэтому пристальный интерес исследователей к использованию антиапоптотических белков, как маркеров злокачественных опухолей связан с тем, что подавление апоптоза этими молекулами может влиять на патогенез, прогрессию и резистентность к противоопухолевой химиотерапии. Экспрессия Bcl-2 выше в периферической, чем в центральной, хондросаркоме. Важно, что в центральных хондросаркомах экспрессия Bcl-2 связана с низкодифференцированными опухолями. Уровни экспрессии Bcl-2 увеличиваются с понижением степени дифференцировки центральной хондросарко-мы. Представленные данные предполагают, что в генезе центральных хрящеобразующих опухолей активация регуляции Bcl-2 является признаком прогрессии от высокодифференци-рованных к низкодифференцированным опухолям, что подтверждает различные генетические механизмы, вовлеченные в патогенез центральных и периферических хондросарком.
Материалы и методы. Проведен ретроспективный анализ 165 случаев хондросаркомы и 46 случаев хондромы за период с 2000 до 2013 г. (рис. 1, а, б, см. на вклейке). Средний возраст пациентов составил 38 лет (24-72 года), среди больных с хондросаркомой преобладали лица мужского пола (98/67), среди больных с хондромой - женского (31/15). Отдаленные результаты прослежены на протяжении не менее 0,6 мес. Всем пациентам применены различные методы хирургического лечения в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН и Московской онкологической больнице № 62. Всем больным проведена диагностика лучевыми методами, включающими КТ и МРТ до лечения и контроль после операции (рис. 2-5, см. на вклейке).
Иммуногистохимическое исследование MMP-1, ММР-2, ММР-9, TIMP-1, Coll-IV, Bcl-2, Bax, COX-2 проведено в 39 хондросаркомах, 8 атипических хондромах и 24 хондромах различной локализации.
Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах ткани опухолей с помощью биотинстреп-тавидинового иммунопероксидазного метода с антителами к MMP-1, 2, 9, TIMP-1, компоненту базальных мембран коллагену IV типа (Coll-IV), белкам-регуляторам апоптоза (Bcl-2, Bax), а также ферменту циклооксигеназе 2-го типа (COX-2). Для всех использованных в исследовании антител применяли одинаковую схему постановки иммуногистохимической реакции.
Образцы тканей фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 48 ч, затем подвергали декальцинации по общепринятой стандартной методике в растворе 20% муравьиной кислоты и 10% формалина. Проводку материала осуществляли в автоматическом режиме в вакуумном процессоре Axcelsior («Termo Scientific», США). После гистологической проводки материал заливали в парафин и затем
готовили срезы толщиной 3-4 мкм. Для работы с образцами опухолевых тканей применяли специальные высокоадгезивные стекла фирмы «Dako» (Дания).
Для работы со срезами костеобразующих опухолей использовали модуль предподготовки PT-Link («Dako»), позволяющий одновременно проводить депарафинизацию, регидратацию срезов, а также демаскировку антигенов. Этапы блокирования эндогенной пероксидазы, инкубацию с первичными антителами, визуализирующим реагентом и раствором хромогена проводили на стейнере Autostainer Plus Link («Dako»). Докрашивание срезов гематоксилином, заключение в бальзам или синтетическую среду проводили по общепринятой методике.
Демаскировку антигенов в хрящеобразующих опухолях проводили при температуре 95оС в течение 20 мин в автоклаве. Стекла извлекали и охлаждали в буфере до комнатной температуры, обрабатывали промывочным буфером, дальнейшие этапы исследования выполняли согласно общепринятой схеме. Ингибирование активности эндогенной пероксидазы проводили при помощи нанесения блокирующего раствора перекиси водорода с последующей инкубацией и промывкой в буфере. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 30 мин с последующей промывкой срезов. Инкубацию с визуализирующим раствором «En Vision» проводили при комнатной температуре в течение 30 мин с последующей обработкой промывочным буфером. Далее следовала инкубация с раствором хромогена в течение 5 мин при комнатной температуре под контролем микроскопа. Докрашивание препаратов проводили гематоксилином.
Оценку реакции в клетках первичных злокачественных опухолей костей проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антигенпо-зитивных клеток. Иммуногистохимическую реакцию оценивали как негативную («-» - нет реакции), слабоположительную («+» - <10% окрашенных клеток), умеренно позитивную («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и сильно позитивную («+++» - >10% клеток высокой интенсивности окраски). Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный) (рис. 6-8, см. на вклейке).
Для MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, COX-2, Bax оценивали интенсивность цитоплазматической реакции и количество окрашенных клеток. Оценку реакции в клетках костных опухолей проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антигенпозитив-ных клеток. Иммуногистохимическую реакцию расценивали как негативную («-» - нет реакции) и позитивную («+» - реакция средней и высокой степени интенсивности). Слабую степень выраженности клеточной реакции, а также реакцию стромы в исследование не включали. Результаты реакций с антигенами выражали в процентах с учетом количества окрашенных клеток на 100 учтенных опухолевых клеток в 5 репрезентативных полях зрения, при этом учитывали только среднюю и высокую степени интенсивности окрашивания компонентов опухолевой клетки.
Для Bcl-2 оценивали ядерную экспрессию белка как низкой (<10% окрашенных опухолевых клеток), средней и высокой интенсивности (>10% антигенпозитивных клеток в опухоли).
Специфическую реакцию ряда маркеров в волокнах и клетках стромы опухолей расценивали как позитивную или негативную.
Иммунореактивность Coll-IV выявляли по модели экспрессии белков в базальных мембранах опухолей.
Результаты и обсуждение. 5-летняя общая выживаемость пациентов высокодифференцированной хондросарко-мой составила 92% независимо от метода хирургического лечения (расширенная или краевая резекция, экскохлеация), 3 пациентов умерли от прогрессирования заболевания и 6 - от других заболеваний. Показатель 5-летней безрецидив-
ной выживаемости пациентов с атипической хондромой составил 96%, в 2 наблюдениях отмечен локальный рецидив, один пациент с локализацией опухоли в челюсти умер от септических осложнений. Локальный рецидив наблюдали у двух пациентов в форме дедифференцированной опухоли. В первом случае опухоль локализовалась в проксимальном отделе плечевой кости, пациенту был первоначально выполнен кюретаж с аллотрансплантацией, во втором случае опухоль локализовалась в костях таза, местный рецидив развился после удаления опухоли методом расширенной резекции. Две пациентки с хондромами и одна с атипической хондромой одновременно страдали раком молочной железы и легкого, патологоанатомическое исследование было проведено с применением дополнительных иммуногистохимических методов, подтверждающих гистогенез опухолей.
В данном разделе исследований проведен сравнительный анализ показателей экспрессии ММР-1, ММР-2, ММР-9 и Т1МР-1 в доброкачественных, пограничных и злокачественных хрящеобразующих опухолях костей, оценена их взаимосвязь с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания и прогнозом.
Следует отметить, что ни в одном из образцов доброкачественных хрящеобразующих опухолей костей (хондроме) экспрессия ММР и Т1МР-1 не выявлена. При этом в большинстве хондросарком обнаружена экспрессия изученных маркеров: ММР-1 - 84,6%, ММР-2 - 71,8%, ММР-9 - 97,4%, Т1МР-1 - 82,3%, а уровни экспрессии вышеуказанных маркеров колебались от 10 до 60%.
Анализ безрецидивной выживаемости больных с хон-дросаркомой в группах больных с отсутствием и наличием экспрессии ММР-1 выявил достоверные различия (р=0,048 по критерию СОХ'в .-Тев£). Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость 6 больных с опухолью ММР-1(-) составила 60,0±21,9% (медиана безрецидивной выживаемости не достигнута, так как 4 из 6 больных пережили 3 года и продолжают быть под наблюдением без признаков рецидива заболевания), тогда как у 33 больных с хондросаркомами ММР-1(+) - 28,5±9,4% (медиана безрецидивной выживаемости составила 11,3 мес).
Таким образом, полученные данные указывают на прогностическую значимость определения экспрессии ММР-1 в опухоли больных с хондросаркомой. Наличие экспрессии ММР-1 в хондросаркомах является прогностически неблагоприятными фактором, особенно при уровнях экспрессии маркера >40%.
Частота выявления и уровень экспрессии ММР-2 в хон-дросаркомах не связаны со степенью ее злокачественности, критерием распространенности процесса Т. Показатели безрецидивной и общей выживаемости больных с хондросаркомой в группах с ММР-2(-)- и ММР-2(+)- опухолями достоверно не различались. Таким образом, показатели экспрессии ММР-2 в хондросаркомах не отражали основные клинические и морфологические характеристики заболевания, его прогноз.
Обнаружены достоверные (р=0,007) различия в снижении показателя 3-летней безрецидивной выживаемости больных с хондросаркомой при увеличении уровня экспрессии белка ММР-9 в опухоли. Так, у 15 больных с показателем экспрессии ММР-9 менее 40% 3-летняя безрецидивная выживаемость равнялась 58,3±16,1% (медиана 34,2 мес), у 10 больных с содержанием ММР-9, равном 40%, - 42,0±17,6% (медиана 15,4 мес), у 14 больных с содержанием ММР-9 в опухоли более 40% - 8,4±8,0% (медиана 8 мес).
Многофакторный анализ показателей безрецидивной выживаемости больных с хондросаркомой с учетом основных клинико-морфологических характеристик и уровня экспрессии белка ММР-9 в опухоли показал, что критерий Т является наиболее определяющим фактором прогноза развития раннего рецидива у больных с хондросаркомой (р=0,026), в меньшей степени содержание ММР-9 (р=0,06) и степень злокачественности опухоли (р=0,09).
В клинически неблагоприятной группе из 33 больных (критерий распространенности опухолевого процесса Т2-Т3) были установлены достоверные различия в безрецидивной выживаемости больных с хондросаркомой в подгруппах с уровнем экспрессии ММР-9 <40% и ММР-9 > 40% (р=0,02). Так, показатель 3-летней безрецидивной выживаемости у 10 больных хондросаркомой равнялся 46,9±18,7% при благоприятных уровнях экспрессии ММР-9 в опухоли (<40%) и у 23 пациентов - 17,3±8,9% при неблагоприятных уровнях экспрессии ММР-9 (> 40%).
Таким образом, подводя итоги изучению показателей экспрессии белка ММР-9 в хондросаркомах, отметим, что содержание ММР-9 в ткани этих опухолей отражало степень злокачественности хондросаркомы и распространенность опухолевого процесса по критерию Т. Получены данные о высокой прогностической ценности уровня экспрессии ММР-9 в хондросаркомах при развитии раннего рецидива заболевания. Уровень экспрессии белка ММР-9 в хондро-саркомах >40% является прогностически неблагоприятным, а <40% - благоприятным фактором 3-летней безрецидивной выживаемости. Выявлено, что риск развития рецидива заболевания через 1 год от начала лечения был наибольшим при сочетании критерия Т3 с высоким уровнем экспрессии белка ММР-9 в опухоли.
Отметим также, что из 6 больных с ММР-1(-)-хондросар-комой у 5 (83,3%) выявлены также низкие (<40%) показатели экспрессии ММР-9. Из 33 больных с хондросаркомой кости с наличием экспрессии ММР-1 в опухоли у 13 (39,4%) обнаружены неблагоприятные высокие (>40%) значения ММР-9 и у 10 (30,3%) - благоприятные уровни ММР-9 (<40%). При этом у больных с неблагоприятными уровнями экспрессии ММР-1 в опухоли различия в показателях 3-летней безрецидивной выживаемости в подгруппах с благоприятными и неблагоприятными уровнями ММР-9 достигали 35% (р=0,052), что указывает на необходимость одновременного определения показателей экспрессии ММР-1 и ММР-9 в хондросаркомах.
TIMP-1. Экспрессия Т1МР-1 не выявлена в 10 доброкачественных хрящеобразующих новообразованиях костей и в 6 (17,6%) из 34 хондросаркомах. При этом уровень экспрессии Т1МР-1 в 11 хондросаркомах составил 10%, в 11 - 20%, в 2 -30% и в 4 - 40%. Не отмечено достоверных различий в частоте выявления Т1МР-1 с учетом пола и возраста пациентов.
С увеличением степени злокачественности хондросарком отмечена тенденция к снижению частоты выявления Т1МР-1(-)-опухолей (р=0,4). Так, при G1 (n=7) частота выявления Т1МР-1(-)-опухолей равнялась 42,9%, при G2 («=11) - 9,1%, при G3 (n=8) и G4 (n=8) - по 12,5%. Наиболее часто Т1МР-1 не выявляли при вторичной хондросаркоме, Т1МР-1 - 33,3%, при центральной хондросаркоме экспрессия Т1МР-1 обнаружена в 15,4%, в то время как при других гистологических вариантах хондросарком Т1МР-1 не обнаружен.
У больных с хондросаркомой кости уровни экспрессии Т1МР-1 в опухоли не связаны с критерием Т, показателями безрецидивной и общей выживаемости, а стало быть и прогнозом.
Таким образом, показатели экспрессии Т1МР-1 в опухоли больных с хондросаркомой не были достоверно связаны с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания и его прогнозом.
Определили коэффициенты соотношения показателей экспрессии ММР/Т1МР-1 в хондросаркомах 28 больных, а также изучили связь этих коэффициентов с клинико-морфологическими признаками заболевания. Показано, что коэффициенты соотношений ММР-1/Т1МР-1, ММР-2/ Т1МР-1, ММР-9/Т1МР-1 в хондросаркомах имели тенденцию к увеличению при повышении степени дифференциров-ки опухоли. Обнаружено, что коэффициенты соотношения ММР-1/Т1МР-1, ММР-2/Т1МР-1 в хондросаркомах не связаны со стадией заболевания и размерами первичной опухоли.
Вместе с тем в группе больных с G1-G2-степенью диф-ференцировки хондросаркомы дисперсионный анализ выя-
вил достоверно меньшее соотношение ММР-9/Т1МР-1 при увеличении критерия Т (p=0,03). Так, в группе из больных с критерием Т1 соотношение было наибольшим и составило 3,6±1,0, в группе с критерием Т2 - 1,9±0,2, у больных с критерием Т3 соотношение было минимальным - 1,3±0,7. У больных с хондросаркомой кости с G3-G4-степенью дифференци-ровки опухоли соотношение ММР-9/Т1МР-1 практически не различалось (2,6±0,3 - при Т2; 2,6±0,1 - при Т3). При увеличении степени злокачественности хондросаркомы наблюдали большее содержание ММР-1, чем его ингибитора Т1МР-1 в опухоли. У больных с низкой степенью злокачественности хондросаркомы (G1-G2) и при минимальном критерии Т выявлено существенно большее содержание ММР-9, чем его ингибитора Т1МР-1.
Для анализа прогностической значимости коэффициентов соотношения ММР/Т1МР-1 все наблюдения разделили по медиане соотношений на 2 группы и определили отдаленные результаты лечения в этих группах. Так, в группе больных с хондросаркомой при соотношении ММР-1/Т1МР-1 менее и более медианы (1,0) получены достоверные различия в показателях общей выживаемости (р=0,03). Так, в группе больных с хондросаркомой с соотношением в опухоли ММР-1/ Т1МР-1 <1,0 все пациенты живы в течение 5 лет проведения исследования, тогда как в группе пациентов с соотношением ММР-1/Т1МР-1 > 1,0 показатель 5-летней общей выживаемости составил 36,7±14,0% (медиана 41,4 мес).
Не установлено достоверных различий в показателях безрецидивной выживаемости по величине соотношения ММР-9/Т1МР-1. В группе больных с хондросаркомой кости с коэффициентами соотношения в опухоли ММР-1/Т1МР-1 < и > медианы (2,0) различия недостоверны (р=0,06). Так, в группе больных с хондросаркомой с соотношением ММР-9/ Т1МР-1 <2,0 все больные были живы в течение 5 лет, а в группе пациентов с соотношением ММР-1/Т1МР-1 > 2,0 показатель 5-летней общей выживаемости составил 38,1±14,2% (медиана 43,8 мес).
Таким образом, анализ соотношения показателей ММР-9/ Т1МР-1 при определении прогноза общей выживаемости больных с хондросаркомой предпочтительнее, чем только одного показателя экспрессии ММР-9 в опухоли (см. рис. 8). В то же время при оценке прогноза безрецидивной выживаемости достаточно определения только экспрессии ММР-9 в хондросаркомах. Прогностическая ценность определения экспрессии одного ММР-1 превышает таковую по сравнению с определением коэффициента соотношения ММР-1/ Т1МР-1.
Coll-IV. Экспрессия Coll-IV в доброкачественных хряще-образующих новообразованиях костей выявлена только в 2 из 10 наблюдений, а уровень экспрессии Coll-IV равнялся 10%. Экспрессия Coll-IV изучена в 31 хондросаркоме, а выявлена в 21 (67,7%) наблюдении. В 10 (32,3%) хондросаркомах уровень экспрессии Coll-IV равнялся 10%, в 9 (29%) - 20%, по 1 наблюдению экспрессия Coll-IV в опухоли составила соответственно 30 и 40%. Различия в частоте выявления экспрессии Coll-IV между группами доброкачественных и злокачественных хрящеобразующих опухолей костей статистически достоверны (р=0,01).
Не установлено достоверной связи частоты выявления Coll-IV в хондросаркомах с полом и возрастом больных.
Частота выявления ^П-^^-опухолей при вторичной хондросаркоме была наибольшей и составила 58,3% (7 из 12) и реже при центральной 18,2% (2 из 11) и дедифференциро-ванной 0% (0 из 5) хондросаркомах (р=0,1).
Частота выявления ^П-^^-опухолей среди больных с хондросаркомой достоверно снижалась по мере увеличения степени ее злокачественности (р=0,02). Так, при G1 («=6) частота выявления Coll-IV(-) опухолей равнялась 83,3%, при G2 («=11) - 27,3%, при G3 («=6) - 16,7% и при G4 («=8) -12,5%. При этом уровень экспрессии Coll-IV в хондросарко-мах не зависел от степени их дифференцировки.
Заметно снижалась частота выявления Coll-IV при увели-
чении критерия распространенности первичной опухоли Т. Так, при Tj экспрессия Coll-IV была наибольшей и выявлена в 75% (3 из 4) опухолей, при Т2 она равнялась 28,6% (6 из 21) и 16,7% - при Т3 (1 из 6).
Несколько лучшие отдаленные результаты лечения отмечены среди больных с СоП-^(-)-хондросаркомой, однако различия статистически недостоверны (р>0,05). Следует отметить небольшое число пациентов с выявленной экспрессией Coll-IV в первичной опухоли. Различия между указанными группами в показателях 3-летней безрецидивной выживаемости составили 18,1%, а 5-летней общей выживаемости - 39,1%.
Подводя итоги изучения показателей экспрессии Coll-IV в хрящеобразующих новообразованиях костей, следует отметить многократное увеличение частоты выявления маркера в хондросаркомах по сравнению с доброкачественными хрящеобразующими новообразованиями, при увеличении критерия Т и степени их злокачественности. Прогностическая ценность содержания Coll-IV в хондро-саркомах выражена слабее, чем ММР-1 и ММР-9, хотя положительные значения Coll-IV в первичной опухоли в некоторых наблюдениях связаны с прогностически неблагоприятным прогнозом.
COX-2. В доброкачественных хрящеобразующих новообразованиях кости экспрессия Coll-IV не обнаружена. Экспрессия этого маркера выявлена в преобладающем большинстве хондросарком (72,2%), но частота его обнаружения не зависела от возраста и пола пациентов. У более молодых больных чаще выявляли СОХ-2 в первичной опухоли. Частота выявления COX-2(-)-хондросарком недостоверно снижалась при увеличении критерия Т (р=0,17). Так, при T1 (n=5) частота выявления COX-20-опухолей составила 60%, при Т2 («=23) - 26,1%, при Т3 («=8) - 12,5%. Однако средний уровень экспрессии маркера в опухолях повышался достоверно при увеличении критерия Т (р=0,04) и составил 10,0±0% при Т1, 12,6±1,5% при Т2 и 20,0±3,1% при Т3.
Частота выявления COX-2(-)-хондросарком достоверно снижалась по мере увеличения степени злокачественности опухоли (р=0,03). Так, при G («=8) частота выявления COX-2(-)-опухолей составила 62,5%, при G2 («=12) - 33,3%, при G3 («=7) - 0% и при G4 («=9) - 11,1%.
Не обнаружено достоверных различий в показателях безрецидивной выживаемости больных с COX-2(-)- и COX-2(+)-хондросаркомами. Однако выявлена тенденция к увеличению общей 5-летней выживаемости больных хондросаркомой с СОХ-2(-)-опухолями по сравнению с Сох-2(+)-хондросаркомами, соответственно 87,5±11,7 и 35,9±13,3% (медиана 47,9 мес).
Проведен многофакторный анализ полученных результатов, который выявил, что критерий Т достоверно определял сроки развития рецидива (р=0,005), чем степень злокачественности опухоли (р=0,18) и частоту выявления COX-2 в новообразовании (р=0,8). При многофакторном анализе 5-летней общей выживаемости степень злокачественности достоверно была связана с отдаленными результатами лечения больных с хондросаркомой (р=0,001). В то же время, такие признаки как критерий Т и выявление экспрессии COX-2 в опухоли не были связаны с показателями общей выживаемости (р=0,5). Все пациенты со степенью злокачественности хондросаркомы G1-G2 были живы на момент проведения исследования независимо от выявления экспрессии COX-2 в опухоли. Из 18 больных с хондросаркомой со степенью диф-ференцировки опухоли G3-G4 только у 3 выявлены COX-2(-)-опухоли и эти пациенты живы, тогда как общая 5-летняя выживаемость 15 больных с СОХ-2(+)-хондросаркомой составила 23,2±11,7% (медиана 32,7 мес).
Полагаем, что показатели экспрессии COX-2 в хондро-саркомах не обладают прогностической ценностью, хотя некоторые COX-2(+) опухоли связаны с неблагоприятным прогнозом.
Bcl-2. Проведен сравнительный анализ показателей экс-
прессии маркера, связанного с митохондриальным апоптозом в хрящеобразующих новообразованиях костей. Достоверно чаще (р=0,004) Bcl-2 выявляли в хондросаркомах (26 из 36, 72,2%) по сравнению с доброкачественными хрящеобразую-щими новообразованиями (2 из 10, 20%).
Не установлено достоверной связи частоты выявления Bcl-2 в опухолях с полом и возрастом больных с хондросар-комой.
Экспрессия Bcl-2 выявлена в 61,5% наблюдений при вторичной хондросаркоме, во всех дедифференцированных хон-дросаркомах и в 69,2% (13) при центральной хондросаркоме (р=0,5).
Частота выявления В^-2(-)-опухолей достоверно снижалась по мере увеличения степени злокачественности хондросаркомы (р=0,03). Так, при G1 частота выявления В^-2(-)-опухолей составила 62,5%, при G2 - 33,3%, при G3 - 0% и при G4 - 11,1%. Аналогичная закономерность, но только тенденция, обнаружена в группах больных с хондросаркомой с различной распространенностью опухолевого процесса (критерий Т). Так, при Т1 частота выявления Bcl-2 составила 60%, при Т2 - 26,1% и 12,5% при Т3 (р=0,17).
Отдаленные результаты лечения больных хондросарко-мой не различались между группами пациентов с Bcl-2(-)- и Bcl-2(+)-опухолями, а показатели 3-летней безрецидивной выживаемости в указанных группах составили соответственно 54,7±20,1 и 30,3±10,2%. Однако показатели 5-летней общей выживаемости имели тенденцию к различию и равнялись соответственно 87,5±11,7 и 35,9±13,3%. На основании представленных результатов этот маркер не следует считать прогностическим фактором при хондросаркомах.
Bax. Показатели экспрессии Bax изучали в 10 доброкачественных хрящеобразующих опухолях костей и в 38 хон-дросаркомах. Экспрессия маркера в доброкачественных хря-щеобразующих новообразованиях костей не выявлена, а в хондросаркомах обнаружена в 32 (84,2%) из 38. В 3 опухолях уровень экспрессии Bax составил 20%, в 7 - 30%. Наиболее часто обнаруживали значения экспрессии Вах, равные 40% - в 10 опухолях, в 3 - 50%, в 5 - 60%, в 3 - 70%, в 1 наблюдении - 90%.
Не установлено достоверной связи частоты выявления Bax в опухоли с полом больных с хондросаркомой, как и различий в среднем уровне экспрессии Вах(+) - соответственно 43,5±3,8 и 46,7±4,7% (р=0,6). Возраст больных с хондросар-комой не влиял на частоту выявления маркера.
Частота выявления вторичных Bax(-)-хондросарком составила 30,8% (4 из 13) и 14,3% (2 из 14) - при центральной хондросаркоме. Во всех дедифференцированных хондросар-комах выявлена экспрессия Bax.
Частота выявления Вах(-)-хондросарком недостоверно снижалась по мере увеличения степени злокачественности опухоли (р=0,2). Так, при G1 частота выявления BaxQ-опу-холей равнялась 37,5%, при G2 - 15,4%, при G3 - 12,5% и при G4 - 0%. Средние уровни экспрессии Вах не различались достоверно в опухолях с различной степенью злокачественности. Так, при G1 они равнялись 34±4%, при G2 - 49,1±5,8%, при G3 - 38,6±7,4%, при G4 - 48,9±4,2% (p=0,24).
Частота выявления Вах(-)-хондросарком не была достоверно связана с критерием распространенности Т (р=0,9), но в то же время частота выявления уровня экспрессии Вах в опухоли >20% составила при Т1 - 16,7%, при Т2 - 20,8% и была наибольшей - 75% при Т3 (р=0,05). Несмотря на то, что частота выявления Bax в хондросаркомах не была достоверно связана с показателем Т, средний уровень экспрессии маркера в хондросаркомах был наибольшим при Т3 (57,1±5,2%), а наименьшим - при Т1 (36±5,1%) (р=0,05).
Выявлены достоверные различия в показателях безрецидивной выживаемости больных с хондросаркомой с наличием и отсутствием экспрессии Вах (р=0,026). Так, показатели 3-летней безрецидивной выживаемости в вышеуказанных группах больных c Bax(-)-хондросаркомой составили 66,7±19,2%, а c Bax(+) - 28,1±9,5% (медиана безрецидивной
выживаемости составила 9,6 мес). Показатели 5-летней общей выживаемости в этих группах не различались достоверно (медиана общей выживаемости 47,6 мес).
При разделении больных с хондросаркомой на 3 группы по уровню экспрессии Вах в опухоли (1-я группа - отрицательные, 2-я группа - <40%, 3-я группа - >40%) наихудшая 3-летняя безрецидивная выживаемость выявлена в группе 12 больных с высоким (>40%) содержанием Вах в опухоли (18,3±11,7%, медиана безрецидивной выживаемости 7,5 мес) (р=0,01). У 20 больных с содержанием Вах в опухоли 10-40% 3-летняя безрецидивная выживаемость была выше - 35,6±14,1% (медиана безрецидивной выживаемости 19 мес). В то же время общая 5-летняя выживаемость в группе больных с хондросаркомой с низкой экспрессией Вах (<40%) практически не отличалась от таковой у больных с уровнями Вах в опухоли >40% (р=0,95).
Многофакторный анализ выявил, что с показателями безрецидивной выживаемости больных с хондросаркомой достоверно связан критерий Т (р=0,004) и не связаны показатели экспрессии Вах в опухоли (р=0,15), а также степень злокачественности хондросаркомы (р=0,3). Многофакторный анализ показателей общей выживаемости выявил преимущественную связь с отдаленными результатами лечения такого фактора, как степень злокачественности опухоли (р=0,004), по сравнению с отсутствием экспрессии Вах в опухоли (р=0,48) и критерием Т (р=0,5). Однако выявление уровней экспрессии Вах в хондросаркомах >40% можно использовать в качестве дополнительного маркера высокого риска раннего рецидивирования (рис. 9, 10, см. на вклейке).
Заключение. Известно, что тканевые, клеточные, молекулярные маркеры характеризуют специфику "биологического поведения" конкретной злокачественной опухоли, а именно проявления фундаментальных свойств опухолевых клеток, таких, как неограниченная пролиферация, активность процессов неоангиогенеза, инвазия и метастазиро-вание, способность противостоять апоптозу, чувствительность к экзогенным и эндогенным регуляторам. На основании изучения фенотипических молекулярно-биологических особенностей сарком костей возможно создание новой стратегии лечения, непосредственно влияющей на определенные молекулы и процессы. Возможно также выявление новых мишеней для более эффективной "таргетной" терапии опухолей, основанной на модификации системы передачи регуляторных сигналов в клетке. Кроме того, изучение биологии сарком костей важно в клинической практике для выявления прогностических маркеров и выделения групп риска среди обследованных пациентов, которые нуждаются в более пристальном динамическом наблюдении и дополнительной агрессивной терапии. Иммуногистохимические, молекулярные и генетические исследования выявили новые, достаточно чувствительные, но не всегда специфичные им-муногистохимические маркеры, хромосомные транслокации и молекулярные мутации в костных опухолях. Однако иммуногистохимический метод в условиях свершившейся опухолевой трансформации клеток следует считать наибо-
лее удобным при изучении клеточных и тканевых маркеров в различных опухолях, в том числе и при саркомах костей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bertoni F., Bacchini P., Hogendoorn P.C.W. Chondrosarcoma. In: Fletcher C.D.M, Unni K.K., Mertens F. (editors). World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and genetics of tumors of soft tissue and bone. Lyon: IARC Press. 2002; 247-51.
2. Hogendoorn P.C.W., Bovee J.V.M.G., Nielsen G.P. Chondrosarcoma (grades I-III), including primary and secondary variants and periosteal chondrosarcoma. In: Fletcher C.D.M., Bridge J.A., Hogendoorn P.C.W., Mertens F., editors. World Health Organization of Tumors of Soft Tissue and Bone. Lyon: IARC Press. 2013; 264-72.
3. Aigner T. Towards a new understanding and classification of chon-drogenic neoplasms of the skeleton-biochemistry and cell biology of chondrosarcoma and its variants. Viechows Arch. 2002; 441: 219-30.
4. Rizzo M., Ghert M.A., Harrelson J.M. Chondrosarcoma of bone: analysis of 108 cases and evaluation for predictors of outcome. Clin. Orthop. Relat. Res. 2001; 391: 224-33.
5. PringM.E., WeberK.L., UnniK.K., SimF.H. Chondrosarcoma of the pelvis: a review of sixty-four cases. J. Bone Joint Surg. Am. 2001; 83: 1630-42.
6. FiorenzaF., AbuduA., GrimerR.J. Risk factors for survival and local control in chondrosarcoma of bone. J. Bone Joint Surg. Br. 2002; 84: 93-9.
7. Lee F.Y., Mankin H.J., Fondren G. Chondrosarcoma of bone: an assessment of outcome. J. Bone Joint Surg. Am. 1999; 81: 326-38.
8. Berend K.B., Toth A.P., Harrelson J.M., Layfield L.J. Association between ratio of matrix metalloproteinase-1 to tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and local recurrence, metastasis and survival in human chondrosarcoma. J. Bone Joint Surg. Am. 1998; 80-A (1): 11-17.
9. Rodgers U.R., Kevorkian L., Surridge A.K., Waters J.G., Swingler T.E., CulleyK., IllmanS., Lohi J., Parker A.E., ClarkI.M. Expression and function of matrix metalloproteinase(MMP)-28. Matrix Biol. 2009; 28 (5): 263-72.
10. Shinmura K., Ishida T., Goto T. Expression of cyclooxygenase-2 in chondroblastoma: immunohistochemical analysis with special emphasis on local inflammatory reaction. Virchows Arch. 2004; 444: 28-35.
11. SuttonK.M., WrightM., Fondren G. Cyclooxygenase-2 expression in chondrosarcoma. Oncology. 2004; 66: 275-80.
12. Endo M., Matsumura T., Yamaguchi T., Yamaguchi U., Morimoto Y., NakataniF., KawaiA., ChumanH., Beppu Y., Shimoda T., Hasegawa T. Cyclooxygenase-2 overexpression associated with a poor prognosis in chondrosarcoma. Hum. Pathol. 2006; 37 (4): 471-6.
13. Dannenberg A.J., Lippman S.M., Mann J.R. Cyclooxygenase-2 and epidermal growth factor receptor: pharmacologic targets for chemo-prevention. J. Clin. Oncol. 2005; 23: 254-66.
14. Chun K., Surh Y. Signal transduction pathways regulating cycloox-igenase-2 expression: potential molecular targets for chemopreven-tion. Biochem. Pharm. 2004; 68: 1089-100.
15. Grifone T.J., Haupt H.M., Podolski V., Brooks J.J. Immunohis-tochemical expression of estrogen receptors in chondrosarcomas and enchondromas. Int. J. Surg. Pathol. 2008; 16 (1): 31-7.
Поступила 01.07.13
] recurrence no Q recurrence yes
85,7
71,4
28,
40
Л
38,9
47,4
57,1
42,9 33,3
70,6 71,4
57,1
22,2
^Bax^ Bcl-2 EGFR MMP1 MMP2 MMP9 p53 TIMP fCox-2
p=0,09
biomarkers
p=0,034
Рис. 9. Экспрессия биомаркеров в высокодифференцированной хондросаркоме с учетом безрецидивной выживаемости.
Fig. 9. Expression of biomarkers in low-grade chondrosarcomas.
U tumor sizeS48 cm3 Ц tumor size>48 cm3
90
(Bax\ Bcl-2 EGFR MMP1 MMP2 MMP9 f p53 Л TIMP fCox-2^
w
p=0,038
p=0,08
p=0,051 p=0,039 p=0,003
biomarkers
Рис. 10. Взаимосвязь экспрессии биологических маркеров в хондросаркоме в зависимости от степени дифференцировки, максимального объема опухоли и безрецидивной выживаемости.
Fig. 10. The expression of the markers was significantly associated with the histologic grade of the tumor, tumor size and the recurrence rate.
К ст. Булычевой и соавт.
Chondroma
Number of cases
. Male - 26 . Female -20
10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 Age
Рис. 1. Распределение больных с хондросаркомой (а) и хондромой (б) в зависимости от возраста, пола и локализации очага поражения в костях скелета.
Fig. 1. Distribution of chondrosarcoma (a) and condroma (b) by age, sex of the patient and site of the lesion.
Рис. 2. Макропрепарат. Хондрома проксимального отдела малоберцовой кости.
Fig. 2. Enchondroma involving the proximal fibular. Gross specimen, the chondroid lesion appear multilobular. There are some areas of calcification.
Рис. 3. Атипическая хондрома проксимального отдела левой бедренной кости (а). В корковом слое кости структура дополнительного новообразования, напоминающего метафизарный фиброзный дефект (б).
Fig. 3. Atypical chondroma involving long tubular bone (a). The lesion has the multilobated appearance, there is no permeation into soft tissue and an additional MFD-like structure (b).
Рис. 4. Атипическая хондрома бедра (а) и проксимального отрезка малоберцовой кости (б). Дольчатые, четко очерченные, частично кальцинированные опухолевые включения в костно-мозговом канале обеих костей.
Fig. 4. Atypical chondroma. Calcified, multilobated lesion of the distal femur (a). The lesion os well demarcated, but some arears are questionable about the cortex involvement (b).
Рис. 5. Хондрома мелких костей кисти. Истончение кортикального слоя кости, патологический перелом основной фаланги первого пальца левой кисти (а). Истончение кортикальной пластинки средней фаланги второго пальца правой кисти (б).
Fig. 5. Enchondroma, involving small tubular bones of the hand. This thinning of the cortex leads to frequent pathologic fractures in enchondromas of small bones (a). The cortex is uniformly thin, but there is no permeation into the soft tissue (b).
Рис. 6. Хондрома бедренной кости. Ишемические изменения ядер отдельных клеток (а), очаговый каль-циноз (б). Микропрепарат. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200, ув. 100.
Fig. 6. High power appearance of an enchondroma with focal calcifications. The lesion is cellular withsome ischemic changes, that mimic atypia. These cytologic changes can be ignored if the roentgenograms show a benign process (a, b). Histopathologic features.
Рис. 7. Высокодифференцированная (grade 1) хондросаркома. Иммуногистохимическая реакция с СОХ-2, диффузная, выраженная реакция клеток опухоли (а. б). Микропрепарат. Ув. 100, ув. 200.
Fig. 7. Diffuse and strong immunoreactivity for COX-2 in a grade 1 chondrosarcoma (a, b).
Рис. 8. Высокодифференцированная (grade 1) хондросаркома. Цитоплазматическая реакция клеток с коллагеном 4-го типа (а. б). Микропрепарат. Ув. 200.
Fig. 8. Cytoplasmic immunostain for Coll IV. Strong and moderate expressions in grade 1 chondrosarcoma cells (a, b).
