Экспрессия молекул - компонентов инсулинопосредованной сигнальной трансдукции в клетках головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера

Горина Я.В.; Комлева Ю.К.; Лопатина О.Л.; Черных А.И.; Салмина А.Б.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Экспериментальная неврология

Экспрессия молекул — компонентов инсулин-опосредованной сигнальной трансдукции в клетках головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера

Я.В. Горина1, Ю.К. Комлева1, О.Л. Лопатина1, А.И. Черных2, А.Б. Салмина1

'ФГБОУВО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого», Красноярск, Россия; 2Красноярская межрайонная клиническая больница № 20 им. И.С. Берзона, Красноярск, Россия

Введение. Риск развития болезни Альцгеймера (БА) повышается при наличии церебральной инсулинорезистентности, которая может быть вызвана нарушением функции сосудистой системы головного мозга, а также оказывать прямое влияние на агрегацию в-амилоида или гипер-фосфорилирование тау-белка.

Цель исследования — изучение экспрессии молекул — компонентов инсулин-опосредованной сигнальной трансдукции (IRS1, GSK-3beta и PKC) в клетках головного мозга при экспериментальной БА.

Материалы и методы. Опыты проведены на 4-месячных мышах-самцах линий C57BL/6 и B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/JJ (NLRPS-нокаутных); по 5 особей в группе. У мышей опытных групп путем введения в-амилоидного пептида моделировали БА; мыши контрольных групп были ложно-оперированными. Экспрессию IRS1, GSK-3beta и PKC в миндалевидном теле головного мозга изучали методом иммуногистохимии. Результаты. У мышей линии C57BL/6 с БА экспрессия IRS1 была снижена по сравнению с ложнооперированными (0,62±0,13 и 0,89±0,17; р=0,045), тогда как у NLRP3-нокаутных животных такого действия в-амилоида не обнаружено. Экспрессия GSK3-beta увеличивалась у мышей линии C57BL/6 с БА (0,60±0,12) по сравнению как с контрольной группой (0,20±0,02; p<0,0001), так и с NLRP3-нокаутными мышами с БА (0,27±0,08; p<0,0001). Экспрессия PKCу мышей линии C57BL/6 с БА снижалась (0,52±0,14) по сравнению с NLRP3-нокаутными мышами с БА (0,89±0,18; p<0,05) и с контрольной группой (0,84±0,12;p<0,05).

Заключение. Развитие нейродегенерации альцгеймеровского типа сопровождается нарушением экспрессии IRS1 и GSK3-beta, что ассоциировано с нарушением передачи сигнала по PKC-пути. Подавление нейровоспаления за счет делеции инфламмасом NLRP3 имеет протективное значение при развитии БА.

Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, инсулинорезистентность, IRS1, GSK3-beta, PKC.

Адрес для корреспонденции: 660022, Россия, Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1. ФГБОУ ВО КГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. E-mail: yana_20@bk.ru. Горина Я.В.

Для цитирования: Горина Я.В., Комлева Ю.К., Лопатина О.Л., Черных А.И., Салмина А.Б. Экспрессия молекул — компонентов инсулин-опосредованной сигнальной трансдукции в клетках головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2019; 13(4): 28-37.

DOI: 10.25692/ACEN.2019.4.5

Molecular expression of insulin signal transduction components in brain cells in an experimental model

of Alzheimer's disease

Yana V. Gorina1, Yuliya K. Komleva1, Olga L. Lopatina1, Anatolii I. Chernykh2, Alla B. Salmina1

1Voyno-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk, Russia; 2Krasnoyarsk City Hospital No. 20 named after I.S. Berzon, Krasnoyarsk, Russia

Introduction. The risk of Alzheimer's disease (AD) is increased with cerebral insulin resistance, which may be caused by the impairedfunction ofthe cerebrovascular system, and may also have a direct effect on в-amyloid aggregation and Tauprotein phosphorylation.

Aim. To study the molecular expression of insulin signal transduction components (IRS1, GSK3B and PKC) in the brain cells in an experimental model of AD.

Materials and methods. Experiments were conducted on 4-month-old C57BL/6 and B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/JJ male mice (NLRP3 knockout mice) with 5 animals in each group. AD was modelled in the experimental group of mice by administering в-amyloid; mice in the control group received sham surgery. IRS1, GSK3B and PKC expression in the amygdala was studied using immunohistochemistry methods.

Results. The C57BL/6 mice with AD had reduced IRS1 expression compared with the mice who received sham surgery (0.62±0.13 and 0.89±0.17; р=0.045), while the в-amyloid did not produce the same result in NLRP3 knockout mice. GSK3B expression was increased in C57BL/6 mice with AD (0.60±0.12) when compared with both the control group (0.20±0.02; p<0.0001) and the NLRP3 knockout mice with AD (0.27±0.08; p<0.0001). PKC expression in C57BL/6 mice with AD was reduced (0.52±0.14) when compared with the NLRP3 knockout mice with AD (0.89±0.18; p<0.05) and the control group (0.84±0.12; p<0.05). Conclusion. The development of Alzheimer type-neurodegeneration is accompanied by disruptions in IRS1 and GSK3B expression, which is associated with impaired signal transmission along the PKC pathway. The suppression of neuroinflammation through NLRP3 inflammasome deletion has a protective effect in AD.

Keywords: Alzheimer's disease, insulin resistance, IRS1, GSK3B, PKC.

For correspondence: 660022, Russia, Krasnoyarsk, Partizana Zheleznyaka sir., 1. Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voyno-Yasenetsky. E-mail: yana_20@bk.ru. Горина Я.В.

For citation: Gorina Ya.V., Komleva Yu.K., Lopatina O.L., Chernykh A.I., Salmina A.B. [Molecular expression of insulin signal transduction components in brain cells in an experimental model of Alzheimer's disease]. Annals of clinical and experimental neurology 2019; 13(4): 28-37. (In Russ.)

DOI: 10.25692/ACEN.2019.4.5

Введение

Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее распространенное хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к нейропсихиатрическим расстройствам и угнетению познавательной деятельности. Данный тип деменции характеризуется накоплением в головном мозге в-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков [1, 2].

Факторы риска, способствующие запуску и прогрессирова-нию БА, разнообразны: генетические факторы, митохон-дриальная дисфункция, окислительный стресс, факторы окружающей среды, нарушение энергетического обмена [3, 4].

Недавние клинические исследования показали, что БА развивается на фоне таких метаболических нарушений, как ожирение, сахарный диабет 2-го типа и атеросклероз [5], что свидетельствует о том, что факторы риска развития БА не ограничиваются центральной нервной системой, а включают системные метаболические нарушения.

Корреляция между когнитивной дисфункцией и нарушением обмена веществ долго не обнаруживалась. Однако все больше эпидемиологических данных подтверждали эту важную взаимосвязь [6, 7], а экспериментальные исследования показали участие в развитии БА маркеров метаболической дисрегуляции, в частности маркеров инсулинорези-стентности [8-10].

За последнее десятилетие накопленные экспериментальные данные подтвердили, что головной мозг чувствителен к инсулину. Известно, что как рецептор инсулина (IR), так и родственные рецепторы инсулиноподобного фактора роста 1 и 2 (IGF1-R, IGF2-R) экспрессируются не только в гипоталамусе — области мозга, регулирующей функции нервной и эндокринной системы, но также в коре, гиппо-кампе, таламусе, обонятельной луковице, мозжечке, полосатом теле, среднем мозге и стволе мозга [11].

Передача сигналов инсулина и IGF осуществляется при непосредственном участии семейства белков субстрата ин-сулинового рецептора (IRS) для интеграции внеклеточных сигналов во внутриклеточные ответы, что приводит к реа-

лизации клеточных эффектов. У человека и млекопитающих есть два основных белка IRS (IRS1 и IRS2), которые широко экспрессируются в большинстве тканей, тогда как белок IRS4 в основном находится в гипоталамусе [12].

В последнее время интраназальное введение инсулина успешно применяется для улучшения некоторых когнитивных функций: декларативной памяти (кратковременной или долговременной), беглости речи, внимания, пространственной памяти и др. Однако остается не до конца ясным, за счет каких механизмов реализуется данный терапевтический подход: путем компенсации нарушенной инсулин-сигнализации, пониженного уровня инсулина в мозге или сниженного поступления инсулина в мозг [13].

Известно, что инсулин модифицирует нейрональную активность, тем самым способствуя синаптической пластичности, а также улучшает функцию памяти в мозге млекопитающих [14, 15].

Передача сигналов инсулина нарушена как в мозге пациентов с БА, так и у животных с экспериментальной моделью хронической нейродегенерации [8, 16]. Нейрональная резистентность к инсулину в первичных культурах нейронов гиппокампа может быть индуцирована олигомерами ß-амилоида, а у мышей и обезьян — путем их интрацере-бровентрикулярной инъекции, что приводит к активации рецепторов фактора некроза опухоли-а (TNF-а) и ингиби-рованию субстрата инсулинового рецептора (IRS1), вызывая синаптическую дисфункцию [17, 18].

Примечательно, что при прогрессировании БА повышается уровень провоспалительных цитокинов, в частности TNF-а, что активирует c-Jun N-терминальную киназу, приводя к ингибированию IRS1 в гиппокампе трансгенных мышей после интрацеребровентрикулярных инъекций олигомеров ß-амилоида [19].

У пациентов с БА описаны также патологические изменения инсулин-сигнальной трансдукции — снижение уровня инсулина и инсулиноподобных факторов роста (IGF-1 и -2), что сопровождается снижением экспрессии мРНК IR, фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и протеинкиназы В (Akt) [20]. Эти наблюдения впоследствии были подтверж-

дены исследованиями, демонстрирующими прогрессивное повышение фосфорилирования IRS1 в сериновых остатках, сопровождаемое активацией гликогенсинтазы киназы-3-бета (GSK-3beta), IkB киназы, c-Jun N-терминальной киназы, мишени рапамицина млекопитающих и протеин-киназы ZA у пациентов по мере развития БА [8, 21].

Известно, что врожденная иммунная система и нейрово-спаление оказывают важное влияние на патогенез многих нейродегенеративных заболеваний, включая БА [22, 23]. В фокусе внимания ученых находятся мультибелковые комплексы —инфламмасомы (NLRP1, NLRP2 и NLRP3), участвующие в регулировании процесса воспаления. Агрегация в-амилоида приводит к активации инфламмасом, которые через каспаза-1-сигнальный путь инициируют продукцию провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1в и -18 [24].

У пациентов с БА также увеличен уровень экспрессии генов NLRP1 и NLRP3, что, в свою очередь, приводит к увеличению экспрессии провоспалительных цитокинов [25].

В дополнение к этому церебральная инсулинорезистент-ность может способствовать микроглиальной секреции провоспалительных цитокинов интерлейкина-1, -6 и TNF-a, активированных в-амилоидом [26]. Это может играть важную роль в патогенезе БА, поскольку у NLRP3-нокаутных мышей, несущих гены мутации (APP/PS1), связанные с генетической формой БА, показано снижение активации каспазы-1, интерлейкина-1 в и отложения в-амилоида, а также не выявлено выраженных нарушений пространственной памяти и когнитивных функций [27].

В другом исследовании установлено влияние инфламмасом NLRP3 на развитие инсулинорезистентности, индуцированной диетой с повышенным содержанием жиров, а именно, у NLRP3-нокаутных мышей наблюдалась повышенная чувствительность к инсулину по сравнению с контрольной группой [28].

Все вышесказанное подчеркивает физиологическую важность нарушения передачи сигналов инсулина в головном мозге при БА, однако точные молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, до конца не ясны.

Цель настоящего исследования — изучение экспрессии молекул — компонентов инсулин-опосредованной сигнальной трансдукции (IRS1, GSK3-beta и PKC) в миндалевидном теле при экспериментальной БА.

Материалы и методы_

Моделирование нейродегенерации

Опыты проведены на 4-месячных мышах-самцах линий С57ВЦ/6 (1-я и 2-я группы) и B6.ШS6-Mrp3tm1BhkДJ (животные с исключенным провоспалительным действием инфламмасом NLRP3; 3-я и 4-я группы); по 5 особей в группе.

У мышей опытных групп (1-я и 3-я) моделировали БА путем введения 1 мкл в-амилоидного пептида (Ар1-42) в СА1 зону гиппокампа билатерально согласно стереотаксиче-ским координатам: ML ±1,3 мм, АР -2,0 мм. DV —1,9 мм [29]. Раствор Ар1-42 концентрацией 50 мкМ готовили в фос-фатно-солевом буфере с последующей агрегацией при 37°С

A B

Рис. 1. Визуализация р-амилоидных бляшек в миндалевидном теле головного мозга животных с экспериментальной моделью БА.

А — миндалевидное тело; В — кора; С — гиппокамп

Fig. 1. Visualization of p-amyloid plaques in the amygdala of animals with an experimental model of AD.

A — amygdala; B — body; C — hippocampus

в течение 7 дней в термостате [30]. Корректность введения АвМ2 в СА1 зону гиппокампа оценивали методом иммуно-гистохимии с помощью окраски тиофлавином S [31].

Мышам контрольных групп (2-я и 4-я) аналогичным образом вводили фосфатно-солевой буфер (PBS).

На 7-е сутки после оперативного вмешательства оценивали развитие признаков БА (накопление в-амилоидных бляшек) [32]. После введения амилоида в ткани головного мозга наблюдали флюоресцирующие амилоидные бляшки зеленого цвета (рис. 1).

Когнитивные функции у животных оценивали с использованием батареи нейроповеденческих тестов, результаты по которым были представлены нами ранее [33, 34].

Исследования выполняли после утверждения заявки и протокола на использование лабораторных животных для исследования на заседании биоэтической комиссии по работе с животными при локальном этическом комитете ИПО ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» (выписка из протокола № 3 от 08.10.2018 г.).

Иммуногистохимическое исследование

Экспрессию маркеров инсулинорезистентности исследовали с использованием метода непрямой иммуногистохи-мии для свободно плавающих срезов [32, 35].

Полученные с помощью микротома «Thermo Scientific Microm HM 650» срезы толщиной 50 мкм промывали в PBS («Sigma»), блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином («Sigma») в PBS и 1% Triton X-100 в течение

1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи с первичными антителами IRS1, PKC, GSK3-beta, NeuN (все 1:1000, «Abcam») с 3% бычьим сывороточным альбумином в PBS и 0,2% Triton X-100 при 4°С. После инкубации с первичными антителами срезы промывали в PBS, инкубировали со вторичными антителами Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 555 1:1000 («Abcam»), Goat anti-guinea pig Alexa Fluor 488 1:1000 («Thermo Fisher Scientific») в течение

2 ч при комнатной температуре, затем промывали в PBS. Наносили монтирующую жидкость Fluoroshield Mounting Medium with DAPl («Abcam»), накрывали срез покровным стеклом и микроскопировали с использованием конфокального микроскопа «Olympus FV 10i».

Экспрессию IRS1, GSK3-beta и PKC в нейронах миндалевидного тела головного мозга оценивали путем подсче-

та клеток в поле зрения. Локализацию IRS1, GSK3-beta и PKC определяли в цитоплазме №и^-нейронов миндалевидного тела.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы «Stаtplus Professional 5.9.8.5».

В каждой группе было по 5 животных. От каждого животного отбирали по 3 среза головного мозга. Подсчет клеток в каждом срезе в области миндалевидного тела осуществляли в 3 полях зрения (100*100 мкм), в каждом поле зрения наблюдали 8-10 клеток. Общее количество клеток в выборке по каждой группе составило 350-400. Количество клеток в каждой выборке отвечало нормальному распределению (оценка по критерию Колмогорова-Смирнова).

В работе анализировали 4 группы животных: мыши-самцы линий C57BL/6 с введением Aß1-42 или PBS, мыши-самцы линии B6.129S6-Nlrp3tm1Bhk/jJ с введением Aß1-42 или PBS. Для сравнения четырех групп по двум независимым переменным («генотип», «инъекция ß-амилоида или PBS»; зависимая переменная — количество клеток или колокализа-ция) использовали двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Проводили оценку взаимного влияния факторов «генотип» и «инъекция ß-амилоида или PBS» и оценивали независимые эффекты каждого из них. Последовательное попарное сравнение исследуемых групп проводили с помощью апостериорного t-теста Сидака.

Колокализацию оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона (rxy) для наблюдаемых в поле зрения клеток. Коэффициент корреляции Пирсона является одной из стандартных мер при определении колокализации изо-

DAPI

NeuN

IRS1

Merge

бражений, он учитывает только сходство между формами, игнорируя при этом интенсивность сигналов. Его значения находятся в диапазоне от -1 до 1, где 0 указывает на отсутствие значимой корреляции, а-1 — на полную отрицательную корреляцию [36, 37].

Различия принимали значимыми при p<0,05. Результаты представлены в виде M±m, где М — среднее значение, m — стандартная ошибка среднего, p — уровень значимости.

Результаты_

Полученные результаты свидетельствуют о различиях в экспрессии IRS1 при введении в-амилоида (Д1,16)=12,86; p=0,0025; двухфакторный ANOVA с t-тестом Сидака). Однако не выявлено влияния отдельно фактора «генотип» или взаимного влияния факторов «генотип» и «инъекция в-амилоида» (рис. 2, А, В).

Так, при введении PBS для IRS1 с NeuN во 2-й группе rxy=0,89±0,17, что статистически значимо не отличалось от 4-й группы (rxy=0,92±0,10; р>0,05; рис. 2, В). Однако введение в-амилоида в 1-й группе негативно сказалось на экспрессии IRS1 на нейронах (rxy=0,62±0,13; р=0,045; рис. 2, В), но в 3-й группе не вызвало такого снижения (рис. 2, В).

В ходе исследования экспрессии GSK3-beta выявили статистически значимое взаимное влияние факторов «генотип» и «инъекция» (Д1,16)=12,95, p=0,0024), а также независимые эффекты факторов «генотип» (Д1,16)=30,65, p<0,0001) и «инъекция» (Д1,16)=55,86, p<0,0001; рис. 3) Так, введение PBS не влияло на экспрессию GSK3-beta в нейронах мышей 2-й (0,20±0,02) и 4-й групп (0,13±0,07; р>0,05; рис. 3, В). Однако мы зафиксировали статистически значимое увеличение экспрессии GSK3-beta в зрелых

1,4

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2

p=0,045

WT+PBS

WT+Aß NLRP3_KO+PBS NLRP3_KO+Aß

Рис. 2. Экспрессия IRS1 в нейронах миндалевидного тела головного мозга мышей экспериментальных групп. А: маркер 1К81 — красный, ЫеиМ — зеленый, DAPI-ядра — голубой; х 10; В: коэффициент корреляции Пирсона 1К51+ЫеиМ в 1, 3, 4-й группах. Двухфакторный ANOVA (влияние интрагиппокампальной инъекции дака

(влияние интрагиппокампальной инъекции ß-амилоида — Д1,16)=12,86, />=0,0025) с последующим t-тестом Си-

Fig. 2. IRS1 expression in the amygdala neurons in mice in the experimental group.

A:IRS1 label — red, NeuN — green, DAPI nuclei — light blue; x 10; B: Pearson's correlation coefficient for RS1+NeuN in groups 1, 3 and 4.

Two-way ANOVA (the effect of hippocampal injection of P-amyloid — F(1.16)=12.86, p=0.0025) with subsequent Sidak t-test

0

A

B

DAPI NeuN GSK3-beta Merge

Рис. 3. Экспрессия GSK3-beta в нейронах миндалевидного тела головного мозга мышей экспериментальных групп.

A, B: Маркер GSK3-beta — красный, NeuN — зеленый, DAPI-ядра — голубой. A: х10; B: хбО.

C: коэффициент корреляции Пирсона GSK3-beta+NeuN в 1, 3, 4-й группах

Fig. 3. GSK3B expression in amygdala neurons in experimental group mice.

GSK3B label — red, NeuN — green, DAPI nuclei — light blue. A: х10; B: х60.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

C: Pearson's correlation coefficient for GSK3B+NeuN in groups 1, 3 and 4

DAPI NeuN PKC Merge

Рис. 4. Экспрессия PKC в нейронах миндалевидного тела головного мозга мышей экспериментальных групп.

A: маркер PKC — красный, NeuN — зеленый, DAPI-ядра — голубой; x10. B: коэффициент корреляции Пирсона PKC+NeuN в 1-4-й группах

Fig. 4. PKC expression in amygdala neurons in mice in the experimental groups.

A:PKC label — red, NeuN — green, DAPI nuclei — light blue; x 10; B: Pearson's correlation coefficient for PKC+NeuN in groups 1-4

Инсулин-сигнальная трансдукция при болезни Альцгеймера

нейронах у мышей 1-й группы (0,60±0,12) по сравнению с мышами как 2-й группы (0,20±0,02; p<0,0001), так и 3-й группы (0,27±0,08; /<0,0001; рис. 3, В).

Интересно, что при моделировании БА у мышей 3-й группы экспрессия GSK3-beta (0,27±0,08) значимо не увеличивалась по сравнению с мышами 4-й группы (0,13±0,07; />0,05; рис. 3, В).

В результате исследования экспрессии РКС в нейронах мышей исследуемых групп нами выявлено статистически значимое влияние независимых эффектов факторов «инъекция» (Д1,16)=7,98, /=0,0122) и «генотип» (Д1,16)=12,60; /=0,0027; двухфакторный ANOVA с последующим t-тестом Сидака; рис. 4, А, В).

Так, коэффициент корреляции Пирсона РКС+NeuN в 4-й группе (0,96±0,17) статистически значимо не отличался от данных 2-й группы (0,84±0,12; />0,05; рис. 4, В). При этом мы установили статистически значимое уменьшение экспрессии PKC у мышей 1-й группы (0,52±0,14) по сравнению с мышами 3-й (0,89±0,18; /<0,01) и 2-й групп (0,84±0,12; /<0,05; рис. 4, В).

Обсуждение_

В результате многолетних эпидемиологических исследований установлена четкая связь между инсулинорези-стентностью и БА [38, 39]. Ранее считалось, что мозг нечувствителен к инсулину, однако в ходе проведения серии экспериментов стало известно, что мозг использует инсулин, доставляемый через гематоэнцефалический барьер или синтезируемый локально, путем транскрипции гена инсулина [40].

Связывание инсулина с внеклеточными а-субъединицами инсулинового рецептора вызывает конформационные изменения в молекуле, что приводит к аутофосфорилирова-нию специфических остатков тирозина во внутриклеточных доменах [41]. После активации различные адаптеры и сигнальные белки, в частности 1КБ1, связываются с рецептором, чтобы инициировать внутриклеточный сигнальный каскад, и тем самым регулируют различные биологические функции [41, 42].

Ранее было продемонстрировано, что ангиотензин II индуцирует фосфорилирование в Бег616 и Бег312, что приводит к его инактивации и, как следствие, ингибированию сигнального каскада инсулин-Р13К [43].

Кроме того установлено, что у пациентов с БА фосфори-лированные формы 1ЯБ1 по остаткам серина локализуются диффузно в цитозоле внутри нейритных бляшек и окружающих нейрофибриллярных клубков, что свидетельствует об их прямом нейротоксическом эффекте [8].

В недавнем исследовании продемонстрировано, что рБег312—1К81 и р-рапТуг-1ЯБ1 являются молекулами-маркерами БА [44], т.к. их наличие ясно показывает развитие инсулинорезистентности в головном мозге при хронической нейродегенерации альцгеймеровского типа. Фосфотип р8ег312-1Я81 стимулирует расцепление 1ЯБ1 и приводит к его деградации [45], тогда как фосфотип р-рапТуг-1ЯБ1 индуцирует ответы, стимулируемые инсулином [46]. При этом у пациентов с БА выявлены более высокие уровни рБег312—1К81, тогда как уровень р-рапТуг-1ЯБ1

был заметно снижен по сравнению с контрольной группой. Установлено также, что высокий уровень p-panTyr-IRS1 ассоциирован с меньшей атрофией головного мозга, в то время как высокий уровень pSer312-IRS1 — с ярко выраженной атрофией, что подтверждает их защитную и пагубную роли в патогенезе БА соответственно [44].

Ряд исследований свидетельствует о значимой роли нейро-воспаления как одного из ключевых звеньев патогенеза БА [27, 47, 48]. Накопление в головном мозге ß-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков вызывает врожденный и адаптивный иммунный ответ в головном мозге [49, 50], что приводит к активации инфламмасом NLRP3, которые инициируют высвобождение провоспалительного ци-токина интерлейкина-^. Данный интерлейкин напрямую ингибирует каскад передачи сигналов инсулина путем фос-форилирования серинового остатка субстрата инсулиново-го рецептора и косвенно способствует выработке TNF-a — индуктора резистентности к инсулину [51-53].

Таким образом, мы выявили, что экспериментальная БА у мышей линии C57BL/6 (дикого типа) ассоциирована с пониженной экспрессией IRS1 в клетках нейрональной природы в миндалевидном теле головного мозга, что указывает на развитие церебральной инсулинорезистентности. Это может вызвать запуск каскада патологических реакций, приводящих к гибели нейронов, нарушению синаптиче-ской пластичности, митохондриальной дисфункции и, как следствие, прогрессированию заболевания [54, 55].

Однако установленное нами увеличение экспрессии IRS1 у NLRP3-нокаутных животных может свидетельствовать о том, что делеция инфламмасом NLRP3 имеет протекторное значение при развитии БА или умеренных когнитивных нарушений, сопровождаемых инсулинорезистентностью, за счет поддержания экспрессии IRS1 на высоком уровне.

На сегодняшний день известно, что GSK3-beta высоко экспрессируется в тканях мозга, особенно в нейронах, при этом его экспрессия в тканях развивающегося мозга намного выше, чем в тканях мозга взрослого человека [56]. Кроме того, данный фермент является одним из наиболее важных фосфорилированных киназ, играющих ключевую роль в регуляции уровня фосфорилированного т-белка и стабилизации микротрубочек [57], а также в росте аксонов в развивающемся мозге [58].

На данный момент имеется противоречивая информация в литературе, каким образом изменяется экспрессия GSK3-beta в ткани головного мозга при развитии БА. GSK3-beta представляет собой киназу, участвующую в фосфорилиро-вании т-белка, и считается, что недостатки в сигнальной трансдукции с участием PIK3 приводят к снижению передачи сигналов Akt, что имеет своим результатом снижение способности регулировать активность GSK3-beta, способствуя гиперфосфорилированию т-белка [59], нейрональной дисфункции, нарушению синаптической пластичности и, в конечном итоге, ускоряя процесс развития нейродегене-рации [60].

Тем не менее недавние наблюдения в определенной степени противоречат этому заключению [61] и показывают, что вместо подавления происходит усиление сигнального пути PDK-Akt-мишень рапамицина млекопитающих в нейронах головного мозга при БА. Кроме того, при БА в головном мозге экспрессия GSK3-beta была уменьшена по срав-

нению с контролем, экспрессия Ser9 восстанавливалась, а Tyr216 фосфорилированной формы GSK3-beta — увеличивалась. Фосфорилирование Ser9 или Tyr216, соответственно, может ослаблять или стимулировать активность GSK3-beta [62]. Таким образом, по данным некоторых авторов, представления о том, что чрезмерная активация GSK3-beta приводит к гиперфосфорилированию т-белка, не являются полностью доказанными, а терапевтические подходы, основанные на ингибировании/ослаблении GSK3-beta, продемонстрировали низкую клиническую эффективность при БА [63].

Вместе с тем, имеются данные о том, что активность GSK3-beta намного выше у пациентов с сахарным диабетом и умеренным когнитивным дефицитом, чем у когнитивно здоровых пациентов с сахарным диабетом, что указывает на то, что активация GSK3-beta может быть показателем когнитивных нарушений у пациентов с сахарным диабетом [64, 65].

Таким образом, выявленное нами увеличение экспрессии GSK3-beta в нейронах миндалевидного тела головного мозга животных дикого типа с экспериментальной БА, возможно, является следствием нарушения инсулин-сигнальных механизмов в головном мозге, реализуемых по PI3K-пути [66]. Это приводит к ингибированию пролиферации клеток, нарушению синаптической пластичности и выживания нейронов, апоптозу, что, в свою очередь, находит свое отражение в четко выраженных деструктивных изменениях процессов обучения и запоминания [67].

Известно, что несколько сигнальных путей регулируют патофизиологические процессы, вовлеченные в развитие или прогрессирование БА, одним из которых является путь PKC. PKC была названа «киназой памяти» и широко изучалась в связи с ее центральной ролью в формировании памяти как в нормальных, так и в патологических условиях, в частности при БА [68]. Так, PKC участвует в синаптическом ремоделировании, индукции синтеза белков и многих других важных для обучения и памяти процессах. Активация нейрональной PKC необходима для всех этапов обучения, включая приобретение, консолидацию и реконсолидацию памяти [69].

Ряд исследований показал, что активация PKC приводит к увеличению выработки нейропротективного растворимого белка-предшественника в-амилоида sAPPa и снижению уровня нейротоксичных видов ва-амилоида как in vitro, так и in vivo [70]. Кроме того, активация PKC защищает нейроны от цитотоксичности в-амилоида [71], а также ингибирует гиперфосфорилирование т-белка путем фосфорилирования и инактивации GSK3-beta [72]. Стоит отметить и тот факт, что активация PKC бри-остатином значительно снижает скорость продукции

в-амилоида, продлевая жизнь мышей с трансгенной моделью БА [73].

Показано, что PKC участвует в фосфорилировании субстратов инсулиновых рецепторов IRS1, необходимых для передачи сигналов инсулина [74]. В свою очередь белки IRS1 связываются с белками, содержащими домены Src-homology-2 (SH2), что приводит к стимуляции поглощения глюкозы, синтеза гликогена и белка, а также инги-бированию глюконеогенеза [75]. Кроме того, PKC и инсулин могут активировать одинаковые сигнальные пути, в том числе через киназу Erk 1/2 MAP и стимуляцию src [76].

В последнее время стали доступны доказательства того, что PKC-путь играет решающую роль в синаптогенезе, лежащем в основе обучения и памяти. При этом PKC-путь находится в тесной взаимосвязи с инсулин-сигнальным путем, который также участвует в синаптогенезе и регуляции обучения и памяти [77, 78].

В совокупности, полученные нами данные свидетельствуют о том, что изменение экспрессии PKC в миндалевидном теле головного мозга при экспериментальной БА ассоциировано с формированием локальной инсулинорезистент-ности и определяется развитием нейровоспаления, опосредованного гиперэкспрессией NLRP3.

Заключение

Развитие нейродегенерации альцгеймеровского типа сопровождается нарушением экспрессии IRS1 и GSK3-beta, что ассоциировано с нарушением передачи сигнала по PKC-пути и свидетельствует о развитии локальной ин-сулинорезистентности в миндалевидном теле головного мозга. Подавление экспрессии инфламмасом, защищая нейроны головного мозга при БА, сдерживает процесс нейровоспаления, а также умеренных когнитивных нарушений, сопровождаемых инсулинорезистентностью, за счет модуляции экспрессии IRS1, GSK3-beta и PKC. Изучение молекулярных механизмов действия инсулина в нейрональных клетках является необходимым элементом стратегии профилактики и терапии нейродегенера-ции различного генеза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. The authors declare that there is no conflict of interest.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-6240.2018.7).

The study was funded by the grant of the President of the Russian Federation given to Russian Leading Research Teams (НШ-6240.2018.7).

Список литературы

1. Xu J., Murphy S.L., Kochanek K.D., Bastian B.A. Deaths: Final Data for 2013. Natl Vital Stat Rep 2016; 64: 100-119. PMID: 26905861.

2. Reitz C., Mayeux R. Alzheimer disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol 2014; 88: 640-651. DOI: 10.1016/j. bcp.2013.12.024. PMID: 24398425.

3. Cai Z., Zhao B., Ratka A. Oxidative stress and в-amyloid protein in Alzheimer's disease. Neuromo Med 2011; 13: 223-250. DOI: 10.1007/s12017-011-8155-9. PMID: 21901428.

4. Ferrer I. Defining Alzheimer as a common age-related neurodegenerative process not inevitably leading to dementia. Prog Neurobiol 2012; 97: 38-51. DOI: 10.1016/j.pneurobio.2012.03.005. PMID: 22459297.

References

1. Xu J., Murphy S.L., Kochanek K.D., Bastian B.A. Deaths: Final Data for 2013. Natl Vital Stat Rep 2016; 64: 100-119. PMID: 26905861.

2. Reitz C., Mayeux R. Alzheimer disease: Epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol 2014; 88: 640-651. DOI: 10.1016/j. bcp.2013.12.024. PMID: 24398425.

3. Cai Z., Zhao B., Ratka A. Oxidative stress and ß-amyloid protein in Alzheimer's disease. Neuromo Med 2011; 13: 223-250. DOI: 10.1007/s12017-011-8155-9. PMID: 21901428.

4. Ferrer I. Defining Alzheimer as a common age-related neurodegenerative process not inevitably leading to dementia. Prog Neurobiol 2012; 97: 38-51. DOI: 10.1016/j.pneurobio.2012.03.005. PMID: 22459297.

Инсулин-сигнальная трансдукция при болезни Альцгеймера

5. Lutz M.W., Crenshaw D., Welsh-Bohmer K.A. et al. New genetic approaches to AD: lessons from AP0E-T0MM40 Phylogenetics Curr Neurol Neurosci Rep 2016; 16: 48. DOI: 10.1007/s11910-016-0643-8. PMID: 27039903.

6. Crane P.K., Walker R., Hubbard R.A. et al. Glucose levels and risk of dementia. N Engl J Med 2013; 369: 540-548. DOI: 10.1056/NEJMoa1215740. PMID: 24195564.

7. Ikram M.A., Brusselle G.G.O., Murad S.D. et al. The Rotterdam Study: 2018 update on objectives, design and main results. Eur J Epidemiol 2017; 32: 807850. DOI: 10.1007/s10654-338 017-0321-4. PMID: 29064009.

8. Talbot K., Wang H., Kazi H. et al. Demonstrated brain insulin resistance in Alzheimer's disease patients is associated with IGF-1 resistance, IRS-1 dysregu-lation, and cognitive decline. J Clin Invest 2012; 122: 1316-1338. DOI: 10.1172/ JCI59903. PMID: 22476197.

9. De Felice F.G. Alzheimer's disease and insulin resistance: translating basic science into clinical applications. J Clin Invest2013; 123: 23485579. DOI: 10.1172/ JCI64595. PMID: 23485579.

10. Boles A., Kandimalla R., Reddy P.H. Dynamics of diabetes and obesity: Epidemiological perspective. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 2017; 1863: 1026-1036. DOI: 10.1016/j.bbadis.2017.01.016. PMID: 28130199.

11. Kleinridders A., Ferris H.A., Cai W., Kahn C.R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes 2014; 63: 2232-2243. DOI: 10.2337/db14-0568. PMID: 24931034.

12. Akintola A.A., van Opstal A.M., Westendorp R.G. et al. Effect of intrana-sally administered insulin on cerebral blood flow and perfusion; a randomized experiment in young and older adults. Aging (Albany NY) 2017; 9: 790-802. DOI: 10.18632/aging.101192. PMID: 28291957.

13. Schmitz L., Kuglin R., Bae-Gartz I. et al. Hippocampal insulin resistance links maternal obesity with impaired neuronal plasticity in adult offspring. Psy-choneuroendocrinology 2018; 89: 46-52. DOI: 10.1016/j.psyneuen.2017.12.023. PMID: 29324300.

14. Park C.R., Seeley R.J., Craft S., Woods S.C. Intracerebroventricular insulin enhances memory in a passive-avoidance task. Physiol Behav 2000; 68: 509-514. DOI: 10.1016/S0031-9384(99)00220-6. PMID: 10713291.

15. Macklin L., Griffith C.M., Cai Y. et al. Glucose tolerance and insulin sensitivity are impaired in APP/PS1 transgenic mice prior to amyloid plaque pathogenesis and cognitive decline. Exp Gerontol 2017; 88: 9-18. DOI: 10.1016/j.ex-ger.2016.12.019. PMID: 28025127.

16. Batista A.F., Forny-Germano L., Clarke J.R. et al. The diabetes drug liraglutide reverses cognitive impairment in mice and attenuates insulin receptor and synaptic pathology in a non-human primate model of Alzheimer's disease. J Pathol 2018; 245: 85-100. DOI: 10.1002/path.5056. PMID: 29435980.

17. De Felice F., Vieira N.N.M., Bomfim T. et al. Protection of synapses against Alzheimer's-linked toxins: insulin signaling prevents the pathogenic binding of Abeta oligomers. Proc Natl Acad Sci 2009; 106: 1971-1976. DOI: 10.1073/ pnas.0901917106. PMID: 19188609.

18. Ma Q.-L., Yang F, Rosario E.R. et al. Beta-amyloid oligomers induce phosphorylation of tau and inactivation of insulin receptor substrate via c-Jun N-terminal kinase signaling: suppression by omega-3 fatty acids and curcumin. J Neurosci 2009; 29: 9078-9089. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1071-09.2009. PMID: 19605645.

19. Steen E., Terry B.M., Rivera E.J. et al. Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer's disease — is this type 3 diabetes? J Alzheimer's Dis 2005; 7: 63-80. DOI: 10.3233/JAD-2005-7107. PMID: 15750215.

20. Bomfim T.R., Forny-Germano L., Sathler L.B. et al. An anti-diabetes agent protects the mouse brain from defective insulin signaling caused by Alzheimer's disease- associated Ap oligomers. J Clin Invest 2012; 122: 1339-1353. DOI: 10.1172/JCI57256DS1. PMID: 22476196.

21. Epelbaum S., Youssef I., Lacor P.N. et al. Acute amnestic encephalopathy in amyloid-в oligomer-injected mice is due to their widespread diffusion in vivo. Neurobiol Aging 2015; 36: 2043-2052. DOI: 10.1016/j.neurobiolag-ing.2015.03.005. PMID: 25862419.

22. Sipos E., Kurunczi A., Kasza A. et al. Beta-amyloid pathology in the ento-rhinal cortex of rats induces memory deficits: implications for Alzheimer's disease. Neuroscience 2007; 147: 28-36. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2007.04.011. PMID: 17499931.

23. Комлева Ю.А., Малиновская Н.А., Горина Я.В. и др. Экспрессия молекул CD38 и CD157 в ольфакторных луковицах головного мозга при экспериментальной болезни Альцгеймера. Сибирское медицинское обозрение 2015; 5: 45-49.

24. Encinas J.M., Enikolopov G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol 2008; 85: 243-272. DOI: 10.1016/s0091-679x(08)85011-x. PMID: 18155466.

25. Ott A., Stolk R.P., van Harskamp F. et al. Diabetes mellitus and the risk of dementia: The Rotterdam Study. Neurology 1999; 53: 1937-1942. DOI: 10.1212/ WNL.53.9.1937. PMID: 10599761.

26. Kurochkin I.V., Guarnera E., Berezovsky I. N. Insulin-degrading enzyme in the fight against Alzheimer's disease. Trends Pharmacol Sci 2018; 39: 49-58. DOI: 10.1016/j.tips.2017.10.008. PMID: 29132916.

27. Gray S.M., Meijer R.I., Barrett E.J. Insulin regulates brain function, but how does it get there? Diabetes 2014; 63: 3992-3997. DOI: 10.2337/db14-0340. PMID: 25414013.

28. Sadagurski M., Dong X.C., Myers M.G. Jr., White M.F. Irs2 and Irs4 syn-ergize in non-LepRb neurons to control energy balance and glucose homeosta-

5. Lutz M.W., Crenshaw D., Welsh-Bohmer K.A. et al. New genetic approaches to AD: lessons from APOE-TOMM40 Phylogenetics Curr Neurol Neurosci Rep 2016; 16: 48. DOI: 10.1007/sll910-016-0643-8. PMID: 27039903.

6. Crane P.K., Walker R., Hubbard R.A. et al. Glucose levels and risk of dementia. N Engl J Med 2013; 369: 540-548. DOI: 10.1056/NEJMoa1215740. PMID: 24195564.

7. Ikram M.A., Brusselle G.G.O., Murad S.D. et al. The Rotterdam Study: 2018 update on objectives, design and main results. Eur J Epidemiol 2017; 32: 807850. DOI: 10.1007/s10654-338 017-0321-4. PMID: 29064009.

8. Talbot K., Wang H., Kazi H. et al. Demonstrated brain insulin resistance in Alzheimer's disease patients is associated with IGF-1 resistance, IRS-1 dysregu-lation, and cognitive decline. J Clin Invest 2012; 122: 1316-1338. DOI: 10.1172/ JCI59903. PMID: 22476197.

9. De Felice F.G. Alzheimer's disease and insulin resistance: translating basic science into clinical applications. J Clin Invest 2013; 123: 23485579. DOI: 10.1172/ JCI64595. PMID: 23485579.