CC BY
26
^^(gCT^rufa fedfW ^^
УДК 616.36:577.151]:618.5-06]-092.9
ЭКСПРЕССИЯ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-9 И ТКАНЕВОГО ИНГИБИТОРА МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ-1 В ПЕЧЕНИ У НОВОРОЖДЕННЫХ МЫШЕЙ ЛИНИЙ СВА И С57В1/6, ПЕРЕНЕСШИХ ХРОНИЧЕСКУЮ ВНУТРИУТРОБНУЮ ГИПОКСИЮ
С.П. Мозолева1, А.П. Надеев12, С.В. Позднякова1, Т.А. Агеева1, П.А. Елясин1
1ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра патологической анатомии; 2НИИ экспериментальной и клинической медицины при Федеральном исследовательском центре
«Фундаментальная и трансляционная медицина»
В исследовании изучена экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и ее тканевого ингибитора 1 (TIMP-1) в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени у новорожденных мышей двух оппозитных линий СВА и С57В1/6 после перенесенной хронической внутриутробной гипоксии. Суммарный уровень экспрессии ММР-9 и TIMP-1 в клетках гепатоцитов был более выраженный у мышей линии СВА в сравнении с мышами линии С57В1/6.
Ключевые слова: матриксная металлопротеиназа-9, тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ-1, хроническая внутриутробная гипоксия, печень, новорожденные, мыши линий СВА и С57В1/6.
DOI 10.19163/1994-9480-2018-3(67)-89-92
EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE-9 AND TISSUE INHIBITOR OF MATRIX METALLOPROTEINASES-1 IN THE LIVER IN NEONATAL MICE OF CBA AND C57B1/6 LINES, WHICH UNDERWENT CHRONIC INTRAUTERINE HYPOXIA
S.P. Mozoleva1, A.P. Nadeev12, S. V. Pozdnyakova1, T.A. Ageeva1, P.A. Elyasin1
1FSBEI HE «Novosibirsk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation,
Department of Pathological Anatomy; 2SRI of Experimental and Clinical Medicine at the Federal Research Center «Fundamental and Translational Medicine»
The aim of the study was to study the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and its tissue inhibitor 1 (TIMP-1) in hepatocytes and nonparenchymal liver cells in neonatal mice of two opposing lines of CBA and C57B1/6 after chronic intrauterine hypoxia. In The total expression level of MMP-9 and TIMP-1 in hepatocyte cells was more pronounced in CBA mice, in compared with mice of the C57B1/6 line.
Key words: matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1, chronic intrauterine hypoxia, liver, newborns, mice of CBA and C57Bl/6 lines.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить экспрессию матриксной металлопротеи-назы 9 (ММР-9) и ее тканевого ингибитора 1 (Т1МР-1) в гепатоцитах и непаренхиматозных клетках печени у новорожденных мышей двух оппозитных линий СВА и С57В1/6, после перенесенной хронической внутриутробной гипоксии (ХВУГ).
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на мышах оппозитных по ряду структурно-функционапьньк параметров органов и систем линий СВА и С57В1/6 и их потомстве [2, 4]. Животные-производители (массой 20-22 г) были получены из лаборатории разведения экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН (г Новосибирск). ХВУГ моделировали помещением беременных самок на 13-й день беременности в барокамеру с «подъемом» на высоту 9000 м, в течение 4 часов, ежедневно 7 дней [7].
Новорожденные мышата линий СВА и С57В1/6 были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой:
1-я (линия СВА) и 2-я (линия С57В1/6) группы - новорожденные мышата, перенесшие ХВУГ; 3-я (линия СВА) и 4-я (линия С57В1/6) группы - животные контрольных групп. Новорожденных мышей в течение первых суток после рождения выводили из эксперимента путем де-капитации под эфирным наркозом.
Все манипуляции с лабораторными животными проводили, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986), принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р53434-2009 от 01.03. 2010 г идентичен GLPOECD).
В соответствии со стандартизированными протоколами и рекомендациями фирм-производителей антител в парафиновых срезах печени проведены иммуно-гистохимические исследования с использованием моноклональных антител Rabbit MMP-9, cloneE127 («ThermoFisherScientificlnc.», США), Mousea-HumanTIMP-1, clone 102D1 («ThermoFisherScientificlnc.»,
США) и системы визуализации DAKO EnVision+ System («DAKO», Дания) с диаминобензидином (DAB).
Для количественной оценки экспрессии MMP-9 и Т1МР-1 в каждом наблюдении определяли процент положительно окрашенных гепатоцитов и непаренхиматозных клеток печени в 10 полях зрения с подсчетом среднего значения.
Статистическую обработку данных морфометри-ческого исследования проводили с использованием лицензированного пакета программ статистики «MicrosoftExcel 2010» c определением средней величины (М), стандартной ошибки средней (m). Достоверность статистически значимых различий средних величин в сравниваемых группах рассчитывали по t-критерию Стью-дента при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее показано, что воздействие ХВУГ привело к значительным деструктивным изменениям в паренхиме печени новорожденных мышат линий CBA и C57BI/6, более выраженным у мышей линии С57В1/6. Процессы репаративной регенерации паренхимы печени у мышей линии C57BI/6, перенесших ХВУГ, были меньшими, чем у мышей линии СВА, и не соответствовали масштабам деструктивных изменений в паренхиме печени [2, 3].
При иммуногистохимическом исследовании цитоп-лазматической экспрессии ММР-9 и Т1МР-1 в печени у новорожденных мышей линий СВА и С57В1/6, после перенесенной ХВУГ, регистрировали положительные реакции на MMP-9 и Т1МР-1 в клетках очагов гемопоэза и синусоидальных клетках (крупнозернистый продукт реакции), редко в гепатоцитах (гетерогенно в виде мелкодисперсного осадка), с различной выраженностью экспрессии (рис.). У контрольных животных иммуногисто-химическая реакция в клетках печени отсутствовала.
Рис. Экспрессия ММР-9 в клетках печени новорожденных мышей линии СВА, перенесшей ХВУГ: ММР-9 окрашенный продукт визуализируется гомогенно в клетках очагов экстрамедуллярного кроветворения, синусоидальных клетках. Докраска гематоксилином. Ув. х 400
Более высокий уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 и Т1МР-1 был выявлен в клетках печени мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, в сравнении с мышами линии С57В1/6, перенесших ХВУГ. Так, суммарный уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в клетках гемопоэза, синусоидальных клетках и гепатоцитах у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, в 10,1 раз превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6. Одновременно с увеличением цитоплазмати-ческой экспрессии ММР-9 отмечено повышение экспрессии Т1МР-1 в тех же клетках (табл.).
Суммарный уровень цитоплазматической экспрессии Т1МР-1 у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, был большим в 21,2 раза, чем аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6. Выявленное одновременное повышение экспрессии Т1МР-1 и ММР-9 может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на подавление Т1МР-1 гиперстимулированной активности ММР-9. Как результат значительной экспрессии ММР-9 и ее ингибитора у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, соотношение ММР-9 / Т1МР-1 составило < 1,0 (в норме соотношение ММР / Т1МР составляет 1:1 [10]). В свою очередь, низкие значения экспрессии Т1МР-1 в клетках печени у мышей линии С57В1/6, перенесших ХВУГ, привели к тому, что соотношение ММР-9 / Т1МР-1 было >1 (табл.).
Экспрессия ММР-9 и TIMP-1 в клетках печени мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию (М ± т)
Локализация Линия мышей
CBA 1 C57BI/6
MMP-9
Гепатоциты 0,78 ± 0,37 0,02 ± 0,01
Клетки очагов гемопоэза 13,44 ± 0,70* 0,68 ± 0,05*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 3,08 ± 0,33* 0,62 ± 0,07*
Суммарный показатель 17,32 ± 0,68* 1,71 ± 0,22*
Т1МР-1
Гепатоциты 0,39 ± 0,12 0,04 ± 0,01
Клетки очагов гемопоэза 15,04 ± 0,40* 0,51 ± 0,07*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 3,48 ± 0,19* 0,35 ± 0,07*
Суммарный показатель 18,89 ± 0,42* 0,89 ± 0,14*
MMP-9/ Т1МР-1
Гепатоциты 2,08 ± 1,31 0,49 ± 0,18
Клетки очагов гемопоэза 0,89 ± 0,02* 1,42 ± 0,15*
Синусоидальные клетки, включая клетки Купфера 0,88 ± 0,06* 2,18 ± 0,43*
Суммарный показатель 0,92 ± 0,02* 1,74 ± 0,20*
"Достоверные межлинейные различия средних величин соответствующих параметров, р < 0,05.
Известно, что MMPs секретируются как проферменты различными клетками: нейтрофилами, моноцитами, макрофагами, фибробластами, эпителиальными и эндотелиальными клетками и активируются путем про-теолитического расщепления [6]. Вероятно, выявленная
I^rnpfe ©©СаГГГМЩ
динамика значений ММР-9 и Т1МР-1 у новорожденных мышей разных линий с ХВУГ сопряжена с ведущей ролью лейкоцитов, являющихся одними из основных продуцентов ММР-9 [8]. Так, в клетках очагов гемопоэ-за у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 19,8 раза превышал аналогичный показатель у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии Т1МР-1 - в 29,5 раза. Соотношение ММР-9 / Т1МР-1 (< 1,0) в клетках очагов гемопоэза у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, было меньшим в 1,6 раза в сравнении с величиной аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6 (ММР-9 / Т1МР-1 >1,0). В то время как экспрессия ММР-9 и Т1МР-1 в гепатоцитах у мышей обеих линии, перенесших ХВУГ, была незначительной и значимых межлинейных различий не имела (табл.). В синусоидальных клетках, в состав которых входят клетки Купфера, являющиеся продуцентами металлопротеи-наз [9], у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, уровень цитоплазматической экспрессии ММР-9 в 4,97 раз превышал величину аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6, уровень цитоплазматической экспрессии Т1МР-1 - в 9,94 раза, а соотношение ММР-9 / Т1МР (< 1,0) у мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, было меньшим в 2,48 раза аналогичного показателя у мышей линии С57В1/6 (где ММР-9 / Т1МР >1,0) (табл.).
Одним из механизмов усиления экспрессии ММР-9 в клетках очагов гемопоэза и синусоидальных клетках мог стать оксидативный стресс, обусловленный хронической внутриутробной гипоксией [5].
Разная выраженность экспрессии ММР-9 и ее ингибитора Т1МР-1 обусловило различную динамику деструктивных процессов в печени у мышей оппозит-ных линий на фоне ХВУГ [2]. Выраженные деструктивные изменения в печени у мышей линии С57В1/6, вероятно, обусловлены более выраженной экспрессией ММР-9 (соотношение ММР/ Т1МР составило более 1,0) в клетках печени. Разнонаправленная динамика значений ММР-9 и Т1МР-1 у новорожденных мышей разных линий с ХВУГ может быть сопряжена с ведущей ролью лейкоцитов, являющихся одними из основных продуцентов ММР-9 и Т1МР-1, что, вероятно, у мышей линий СВА и С57В1/6, перенесших ХВУГ, имеет место разное соотношение видов и степени зрелости клеток в очагах гемопоэза и синусоидальных клеток [1].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. У новорожденных мышей линии С57В1/6, перенесших ХВУГ, выявлена слабая экспрессия ММР-9 и еще более низкий уровень экспрессии Т1МР-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клетках, что обусловило соотношение ММР-9 / Т1МР более 1.
2. У новорожденных мышей линии СВА, перенесших ХВУГ, отмечена выраженная экспрессия ММР-9 и более высокий уровень экспрессии Т1МР-1 в клетках очагов гемопоэза, синусоидальных клеток, что обусловило соотношение ММР-9 / Т1МР менее 1.
3. Суммарный уровень экспрессии ММР-9 и TIMP-1 в клетках гепатоцитов был более выраженный у мышей линии СВА, в сравнении с мышами линии С57В1/6.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аникина А.Г., Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шаповалов А.М. Роль матриксных металопротеиназ и их ингибитора в развитии раннего фиброза легких при гриппе А/ H5N1 А/Goose/Krasnoozersoye/627/05 у мышей // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2013. - Т. 156, № 7. - С. 17-20.
2. Мозолева С.П., Надеев А.П., Позднякова С.В., За-лавина С.В. Структурная организация печени и звездчатых макрофагов у новорожденных мышей линии СВА и С57В1/6 // Морфология. - Т. 152, № 4. - С. 44-48.
3. Мозолева С.П., Надеев А.П., Позднякова С.В. и др. Структурная организация печени и клеток Купфера у новорожденных мышей оппозитных линий СВА и С57В1/6, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию // Уральский медицинский журнал. - 2018. - Т. 157, № 2. - С. 115-120.
4. Надеев А.П., Шкурупий В.А., Маринкин И.О. Печень и плацента в пре- и постнатальный периоды при патологии: Клинико-экспериментальное исследование. -Новосибирск: Наука, 2014. - 242 с.
5. Пинаева О.Г., Лебедько О.А., Яковенко Д.В. и др. Влияние антенатальной гипоксии на некоторые показатели тканевого гомеостаза печени белых крыс // Бюлл. экспе-рим. биол. и мед. - 2014. -Т. 157, № 3. - С. 301-304.
6. Потеряева О.Н. Матриксные металлопротеиназы: строение, регуляция, роль в развитии патологических состояний (обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. - 2010. - № 5. - С. 7-17.
7. Уткина Л.И., Тимошин С.С. Изменение печени потомства белых крыс под влиянием внутриутробной хронической гипоксии // Бюл. эксперим. биол. мед. -1990. - №. 11. - С. 541-543.
8. Chaundary A.K., Pandya s., Ghoh K., Nadkarni A. Matrix metalloproteinase and its drug targets therapy in solid and hematological malignancies: An overview // Mutat. Res. -2013. - Vol. 1, № 753. - P. 7-23.
9. Ju C., Tacke F. Hepatic macrophages in homeostasis and liver diseases: from pathogenesis to novel therapeutic strategies // Cell. Mol. Immunol. - 2016. - Vol. 13. - P. 316-27.
10. Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., et al. Matrix metalloproteinases // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol. 17, № 31. - P. 3751-3768.
REFERENCES
1. Anikina A.G., Potapova O.V., SHkurupij V.A., SHapova-lov A.M. Rol' matriksnyh metaloproteinaz i ih ingibitora v razvitii rannego fibroza legkih pri grippe A/N5N1 A/Goose/ Krasnoozersoye/627/05 u myshej [The role of matrix metaloproteinases and their inhibitor in the development of early fibrosis of the lungs with influenza A / H5N1 A / Goose / Krasnoozersoye / 627/05 in mice]. Byull. ehksperim. biol. i med. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 2013, Vol. 156, no. 7, pp. 17-20. (In Russ.; abstr. in Engl.).
2. Mozoleva S.P., Nadeev A.P., Pozdnyakova S.V., Zala-vina S.V. Strukturnaya organizaciya pecheni i zvezdchatyh makrofagov u novorozhdennyh myshej linii SVA i S57V1/6 [Structural organization of the liver and stellate macrophages in neonatal mice of the CBA and C57B1 / 6 lines].
Morfologiya [Morphology], Vol. T. 152, no. 4, pp. 44-48. (In Russ.; abstr. in Engl.).
3. Mozoleva S.P., Nadeev A.P., Pozdnyakova S.V. et al. Strukturnaya organizaciya pecheni i kletok Kupfera u novorozhdennyh myshej oppozitnyh linij SVA i S57V1/6, perenesshih hronicheskuyu vnutriutrobnuyu gipoksiyu [Structural organization of the liver and Kupffer cells in neonatal mice of opposing lines SVA and C57B1 / 6, who underwent chronic intrauterine hypoxia]. Ural'skij medicinskij zhurnal [The Urals Medical Journal], 2018, Vol. 157, no. 2, pp. 115-120. (In Russ.; abstr. in Engl.).
4. Nadeev A.P., SHkurupij V.A., Marinkin I.O. Pechen' i placenta v pre- i postnatal'nyj periody pri patologii: Kliniko-ehksperimental'noe issledovanie [Liver and placenta in pre-and postnatal periods in pathology: Clinical and experimental study]. Novosibirsk: Nauka, 2014. 242 p.
5. Pinaeva O.G., Lebed'ko O.A., YAkovenko D.V. i dr. Vliyanie antenatal'noj gipoksii na nekotorye pokazateli tkanevogo gomeostaza pecheni belyh krys [Influence of antenatal hypoxia on some indices of tissue homeostasis in liver of white rats]. Byull. ehksperim. biol. i med. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 2014, Vol. 157, no. 3, pp. 301-304. (In Russ.; abstr. in Engl.).
6. Poteryaeva O.N. Matriksnye metalloproteinazy: stroenie, regulyaciya, rol' v razvitii patologicheskih sostoyanij (obzor literatury) [Matrix metalloproteinases: structure, regulation, role in the development of pathological conditions (literature review)]. Medicina i obrazovanie v Sibiri [Medicine and Education in Siberia], 2010, no. 5, pp. 7-17. (In Russ.; abstr. in Engl.).
7. Utkina L.I., Timoshin S.S. Izmenenie pecheni potomstva belyh krys pod vliyaniem vnutriutrobnoj hronicheskoj gipoksii [Changes in the liver of offspring of white rats under the influence of intrauterine chronic hypoxia]. Byul. ehksperim. biol. med. [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 1990, no. 11, pp. 541-543. (In Russ.; abstr. in Engl.).
8. Chaundary A.K., Pandya s., Ghoh K., Nadkarni A. Matrix metalloproteinase and its drug targets therapy in solid and hematological malignancies: An overview. Mutat. Res., 2013, Vol. 1, no. 753, pp. 7-23.
9. Ju C., Tacke F. Hepatic macrophages in homeostasis and liver diseases: from pathogenesis to novel therapeutic strategies. Cell. Mol. Immunol., 2016, Vol. 13, pp. 316-27.
10. Zitka O., Kukacka J., Krizkova S., et al. Matrix metalloproteinases. Curr. Med. Chem., 2010, Vol. 17, no. 31, pp. 3751-3768.
Контактная информация
Надеев Александр Петрович - д. м. н., профессор, зав. кафедрой патологической анатомии, Новосибирский государственный медицинский университет, e-mail: nadeevngma@mail.ru
