CC BY
23
Литература
1. Zelen M. The randomization and stratification of patients to clinical trials. J Chron Dis —
1974;27:365-75.
2. Kalbfleisch J.D., Prentice R.L. The statistical analysis of failure time data. New York: John Wiley & Sons, 1980.
3. Gray R.J. A class of K-sample tests for comparing the cumulative incidence of a competing risk. Ann Stat — 1988; 16:1141—54.
4. Kaplan E.L., Meier P. Nonparametric estimation from incom-plete observations. J Stat Assoc — 1958;53:457—81.
5. Mantel N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chem Rep — 1966; 50:163—70.
6. Cox D.R. Regression models and life tables. J R Stat Soc Series B — 1972;34:187-229.
7. Pilepich M.V., Caplan R., Byhardt R.W. et al. Phase in trial of androgen suppression using goserelin in unfavorable prognosis carcinoma of the prostate treated with definitive radiotherapy: Report of Radiation Therapy Oncology Group protocol 85—31. J Clin Oncol — 1997;15:1013-21.
8. Pilepich M.V., Winter K., John M.J. et al. Phase in RTOG trial 86-10 of androgen deprivation adjuvant to definitive radiotherapy in
locally advanced carcinoma of the prostate.
Int J Radiat Oncol Biol Phys — 2001;50:1243—52.
9. Bolla M., Gonzalez D., Warde P. et al. Improved survival in patients with locally advanced prostate cancer treated with radiotherapy and goserelin. N Engl J Med —
1997;337:295—300.
10. Bolla M., Collette L., Blank L. et al. Long term results with immediate androgen suppression and external irradiation in pa-tients with locally advanced prostate cancer (an EORTC study): A phase IE randomized trial. Lancet — 2002; 360:103—8.
11. Lawton C.A., Winter K., Murray K. et al. Updated results of the phase in RTOG trial 85-31: Evaluating the potential benefit of androgen suppression following standard radiation therapy for unfavorable prognosis carcinoma of the prostate. Int J Radiat Oncol Biol Phys — 2001;49:937—46.
12. Pilepich M.F., Krall J.M., Sarraf M. et al. Androgen deprivation with radiation therapy compared with radiation therapy alone for locally advanced prostatic carcinoma: A randomized com-parative trial of the Radiation Therapy Oncology Group. Urology — 1995;45:616—23.
13. Laverdiere J., Gomez J.L., Cusan L. et al. Beneficial effect of combination hormonal therapy administered prior and following external beam radiation therapy in localized prostate cancer . Int J Radiat Oncol Biol Phys — 1997;37:247—52.
14. Hanks G.E., Pajak T.F., Porter A. et al. Phase in trial of longterm adjuvant androgen deprivation after neoadjuvant hormonal cytoreduction and radiotherapy in locally advanced carcinoma of the prostate:
The Radiation Therapy Oncology Group protocol 92-02. J Clin Oncol — 2003;21:
3972—8.
15. Stege R. Potential side-effects of endocrine treatment of long duration in prostate cancer. Prostate Suppl — 2000;10:38—42.
16. Berruti A., Dogliotti L., Terrone C. et al. Changes in bone mineral density, lean body mass and fat content as measured by dual energy x-ray absorptiometry in patients with cancer without apparent bone metastases given androgen deprivation therapy. J Urol — 2002; 167:2361—67.
17. Ross R.W, Small E.J. Osteoporosis in men treated with androgen deprivation therapy for prostate cancer. J Urol — 2002;167:1952—56.
Экспрессия интерлейкина-6 человека и его вирусного гомолога в ткани рака предстательной железы
Е.И. Велиев!, А.В. Рыбальченко!, Д.А. Широков2, Н.Н. Тупицын2
1Кафедра урологии и хирургической андрологии РМАПО;
2Лаборатория иммунологии гемопоэза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН
EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-6 AND ITS VIRAL HOMOLOGUE IN PROSTATE CANCER TISSUE
Ye.I. Veliyev1, A.V Rybalchenko1, D.A. Shirokov2, N.N. Tupitsyn2
Wepartment of Urology and Surgical Andrology, Russian Medical Academy of Postgraduate Education;
2Laboratory of Immunology of Hemopoiesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences
Human interleukin-6 (IL-6) is of considerable importance in the pathogenesis of prostate cancer (PC). Prostatic cells are also known to be a reservoir for human herpesvirus 8 type (HHV-8). Due to the findings that HHV-8 had a homologue of human IL-6, viral IL-6, it seemed interesting to study the expression of these two cytokines in the tumor tissue of patients with PC. The expression of IL-6 mRNA was found in 70% of the patients. That of viral IL-6 was not detected in this disease. Nevertheless, a genetic HHV-8 material was ascertained in the tumor tissue of 2 patients with PC.
Патогенетическая роль интерлейкина-6 (ИЛ-6) при раке предстательной железы (РПЖ) широко обсуждается в литературе. Первоначально экспрессия ИЛ-6 и рецептора для данного цитокина была установлена на модели клеточных линий РПЖ [1]. Впоследствии доказано, что рецептор ИЛ-6 представлен в 78% случаев доброкачественной гиперплазии предстательной железы и в 100% случаев РПЖ [2]. В линии клеток, происходящей из нормального эпителия предстательной железы (PZ-HPV-7), цитоки-ны семейства ИЛ-6 (ИЛ-6, лейкозингибирующий фактор, онкостатин М) не экспрессированы. ИЛ-6
способен индуцировать нейроэндокринную диффе-ренцировку [3]. Доказано, что по мере прогрессии данной опухоли появляется экспрессия рецептора ИЛ-6 ^р80), и опухолевые клетки приобретают способность секретировать данный цитокин, что является одним из механизмов аутокринной регуляции роста аденокарциномы. Важная патогенетическая роль ИЛ-6 при РПЖ состоит в том, что он вызывает независимую от лигандов активацию рецептора андрогенов на опухолевых клетках [4]. Повышенные уровни сывороточного ИЛ-6 коррелируют с прогрессией андрогеннезависимого РПЖ [5].
В последние годы открыт новый цитокин семейства ИЛ-6 — вирусный ИЛ-6, который закодирован в геноме вируса герпеса 8 типа человека (HHV-8). Интересно отметить, что одним из резервуаров HHV-8 в организме человека является предстательная железа. Выполненные с помощью гибридизации in situ исследования показали, что в железистом эпителии простаты лиц из эндемичных по HHV-8 регионов могут быть экспрессированы некоторые гены латентной инфекции HHV-8 [6]. Маркеры HHV-8 — вирусспецифиче-ские антитела и/или нуклеотидные последовательности вируса — были обнаружены в сыворотке крови и эякулятах значительного числа пациентов с различной патологией простаты [7]. О возможной роли HHV-8 в патогенезе РПЖ свидетельствует тот факт, что уровни антител к HHV-8 у больных РПЖ достоверно выше, чем у здоровых [8].
В работе представлены результаты исследования экспрессии человеческого и вирусного ИЛ-6 в ткани РПЖ. Особое внимание уделено генетическому подтверждению наличия последовательностей HHV-8 в образцах удаленных опухолей.
Материалы и методы
Исследование проведено у 17 больных РПЖ в возрасте 54—
71 года. Во всех случаях диагноз аденокарциномы предстательной железы был верифицирован гистологически на основании исследования биопсийного материала.
Выделение ДНК. К клеточной суспензии добавляли 0,1 % SDS по объему и разрушали мембраны клеток троекратным замораживанием/ размораживанием. После этого добавляли равный объем фенола, встряхивали содержимое пробирки на вортексе и откручивали при 13400 об/мин на центрифуге в течение 10 мин. Далее отбирали из пробирки верхнюю фазу и переносили ее в пробирку с равным объемом смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), интенсивно встряхивали и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 мин. Отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объем хлороформа и снова центрифугировали при 13400 об/мин 10 мин. Снова отбирали верхнюю фазу, переносили ее в новую пробирку и добавляли 3М ацетат натрия рН 5,0 (10% по объему) и равный объем изопропилового
Таблица 1.
Результаты OT-ПЦР с РНK, выделенной из образцов РПЖ
„ Экспрессия мРНК
Пациент hIL-6 vIL-6 p-gloliiii
ВИ
ТБ
МИ
ТК
КО
АМ
МА
ЭЛ
БО
АТ
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Рис. 1. Результаты ОТ-ПЦР 1—2 — кДНКбольного ВИ; 3—4 — кДнКбольного ТБ; 5—6 — кДНКбольного МИ; 7—8 — кДНКбольного ТК. Положительный сигнал на мРНКМЬ-6наблюдается у пациентов ТБ (3), МИ (5). Здесь и на рис. 2:1, 3, 5, 7 — использовались праймеры к кДНКМЬ-6; 2, 4, 6, 8 — использовались праймеры к кДНКу1Ь-6
Рис. 2. Результаты ОТ-ПЦР 1—2 — кДНК больного КО; 3—4 — кДнК больного АМ; 5—6 — кДНК больного МА; 7—8 — кДНК больного ЭЛ. Положительный сигнал на мРНКМЬ-6 наблюдается у пациентов КО (1), АМ (3), ЭЛ (7)
■
Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР 1—2 — кДНКбольного БО; 3—4 — кДНКбольного АТ; 5—6 — негативный контроль ^И20 вместо кДНК); 7—8 — положительный контроль на мРНКМЬ-6 и у1Ь-6 (7 — кДНКклеточной линии к562, 8 — кДНКклеточной линии ВС3). Положительный сигнал на мРНКМЬ-6 наблюдается у пациентов БО (1), АТ (3)
спирта. Пробирку ставили на ночь в морозильную камеру (-20°С), после этого откручивали на центрифуге при 13400 об/мин 10 мин. Осадок высушивали, а после ресуспендировали деионизованной водой.
Выделение РНК. К клеточной суспензии добавляли гуанидин-тиоционатный буфер (4М гуанидин тиоцианат, 25 мМ натрия цитрат pH 7,0, 0,5% натрия N-лауроилсаркозилат, 0,1% p-меркаптоэтанол), держали 10 мин при комнатной температуре, далее добавляли 3М ацетат натрия рН 5,0 (10% по объему), интенсивно перемешивали содержимое пробирки, добавляли равный объем фенола, 5 мин держали при комнатной температуре, далее добавляли смесь хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), интенсивно перемешивали и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 мин, после чего отбирали верхнюю фазу, переносили ее в новую пробирку и повторяли экстракцию с фенолом и хлороформом. Отбирали водную фазу, добавляли 2,5 объема этилового спирта и ставили на ночь в морозильную камеру (-20°С), затем откручивали от спирта на центрифуге при 13400 об/мин в течение 10 мин, осадок высушивали и ресуспендировали деионизованной водой.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). Для каждой пары праймеров использовалась индивидуальная программа. Для амплификации использовали следующие пары праймеров:
vIL-6 forward: 5’-CAGCCATATGATGTGCTG-GTTCAAGTTGTG-3’, vIL-6 reverse: 5’-AGCACTC-GAGTTACTTATCGTGGACGTCAG-3’; условия амплификации: денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 58°С 45 с, элонгация 72°С 45 с. Цикл повторялся 35 раз. Продукт амплификации равнялся 615 п.о.;
ORF26 forward: 5’—AGCCGAAAGGATTCCAC-CAT—3’, ORF26 reverse: 5’—CTGGACGTAGACAA-CACGGA—3’; условия амплификации: денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 55°С 30 с, элонгация 72°С 30 с. Цикл повторялся 35 раз. Продукт амплификации равнялся 233 п.о.;
K1 forward: 5’-GACCTTGTTGGACATCCCG-TACAATC-3’, K1 reverse: 5’-AGGCCATGCTGTAAG-TAGCACGGTT-3’, условия амплификации: денатурация 94°С 1 мин, отжиг праймеров 55°С 1 мин, элонгация 72°С 2 мин. Цикл повторялся 35 раз. Продукт амплификации равнялся 1073 п.о.;
GAPDH forward 5’-AGTCCAGTGAGCTTCC-CGTTCAGC-3’, GAPDH reverse 5’-TGGTATCGTG-GAAGGACTCATGAC-3’; условия амплификации: денатурация 94°С 1 мин, отжиг праймеров 60°С 1 мин, элонгация 72°С 1 мин. Цикл повторяли 40 раз. Продукт амплификации равнялся 190 п.о.;
hIL-6 forward: 5’-CCTGAACCTTCCAAAGATGG-3’, hIL-6 reverse: 5’-CATTTGCCGAAGAGCCCTCA-3’ (продукт амплификации равнялся 370 п.о.); условия
амплификации: денатурация 94°С 45 с, отжиг праймеров 60oQ элонгация 72°С 30 с. Цикл повторяли 30 раз;
p-globin forward: 5’-CTGGGCAGGCTGCTG-GTG-3’, p-globin reverse: 5’-GCTTGTCACAGT-GCAGCTC-3’ (продукт амплификации равнялся 210 п.о.); условия амплификации: денатурация 94oG 45 с, отжиг праймеров 60oQ элонгация 72°С 30 с. Цикл повторяли 30 раз. Для разделения ПЦР-амп-лифицированных фрагментов использовали 1,7% легкоплавкую агарозу на 1х TBE-буфере, содержащую бромистый этидий.
Обратная транскрипция (ОТ). Реакцию проводили стандартно в объеме 40 мкл. К 20 мкл РНК добавляли 2 мкл политимидинового олигонуклеотида (18 звеньев). После этого ставили пробирку в термостат (+70oQ на 5 мин. Далее добавляли 8 мкл 5х буфера для ОТ, 4 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов, 4 мкл ингибитора рибонуклеазы и ставили пробирку в термостат (+37oQ на 5 мин. После добавляли 2 мкл фермента MMulV обратной транскриптазы и ставили пробирку в термостат (42oQ на 1 ч. Фермент инактивировали 10 мин при 70oQ Результаты и обсуждение
Результаты одновременного изучения экспрессии человеческого и вирусного ИЛ-6 тканью РПЖ
Таблица 2. Результаты ПЦР с ДНK,
выделенной из образцов РПЖ
Пациент vil 6 ^ORKlS^ 8 K1 Контроль GAPDH
КВ — — — +
КС — — — +
MK + + — +
ВИ — — — +
ТБ — — — +
ВФ — — — +
MИ — — — +
ТК — — — +
ФЯ — — — +
ЧН + — — +
БК — — — +
КО — — — +
AM — — — +
MA — — — +
ЭЛ — — — +
БО — — — +
AТ — — — +
а Маркер 1 107З п.о. б1З п.о
в Маркер 1 2 З 4 З б 7 8
б1З п.о.
2ЗЗ л.о.И 190 л.о.Н
Рис. 4. Результаты ПЦР образцов РПЖ, полученных у больных КВ (а), ЧН и БК (б) и МК (в)
1, 5 — использовались праймеры к гену у1Ь-6,
2, 6 — праймеры к гену ОЯЕ26, 3, 7 — к гену К1, 4, 8 — к гену ОЛРБИ. а: 1—4 — позитивный контроль (ДНК клеточной линии ВС3),
5—8 — ДНК больного КВ; б: 1—4 — ДНК больного ИН, 5—8 — ДНК больного БК; в: 1—4 — ДНК больного МК, 5—8 — негативный контроль ^И20 вместо ДНК)
представлены в табл. 1. В качестве положительного контроля изучалась мРНК -глобина (100% положительный результат).
Экспрессии вирусного ИЛ-6 не наблюдалось ни в одном из исследованных случаев. Экспрессия ИЛ-6 человека была обнаружена в 7 (70%) случаях из 10.
На рис. 1—3 представлены результаты ОТ-ПЦР, свидетельствующие о том, что даже в ИП-6-пози-тивных случаях не наблюдается следовых уровней экспрессии уП-6.
Анализ на наличие последовательностей НБУ-8 дал положительный результат у 2 пациентов. У пациента МК были обнаружены ген у^-6 и ген
ORF26, а у пациента ЧН — только ген у^-6 (рис. 4, табл. 2). Обсуждение
Полученные данные позволили ответить на 3 важных вопроса. Во-первых, подтверждена экспрессия ИЛ-6 опухолевой тканью РПЖ в 70% случаев. Это находится в полном соответствии с данными литературы, и именно в этих случаях можно предполагать аутокринную или паракринную регуляцию опухолевого роста данным цитокином. Таким образом, с учетом роли ИЛ-6 в индукции нейроэндокринной дифференцировки РПЖ и активации рецепторов для андрогенов становится возможной более точная идентификация данной группы пациентов для разработки соответствующих лечебных мероприятий.
Во-вторых, нами практически исключена какая бы то ни было патогенетическая роль вирусного гомолога ИЛ-6, закодированного в геноме НН^8. Ни в одном из 10 изученных случаев РПЖ экспрессии данного цитокина не отмечено.
И, наконец, возможная патогенетическая или этиологическая роль НН^8 в части случаев РПЖ не исключается на основании полученных нами данных. У 2 (12%) из 17 пациентов в ткани опухоли были обнаружены нуклеотидные последовательности генома НН^8. Интересно отметить, что в обоих случаях (пациенты МК и ЧН) нельзя исключить интеграцию части генома НН^8, так как последовательности К1 отсутствовали. У одного из пациентов в опухолевой ткани выявлен только ген вирусного ИЛ-6, а у второго — ген вирусного ИЛ-6 в сочетании с ORF-26. Обращает на себя внимание, что ген вирусного ИЛ-6 присутствовал у обоих больных, что теоретически не исключает возможности индукции экспрессии цитокина в опухолевых клетках.
Литература -----------------------------
1. Siegall C.B., Schwab G., Nordan R.P. et al. Expression of the interleukin 6 receptor and interleukin 6 in prostate carcinoma cells. Cancer Res 1990;50(24):7786—8.
2. Siegsmund M.J., Yamazaki H., Pastan I. Inreleukin 6 receptor mRNA in prostate carcinomas and benign prostatic hyperplasia. J Urol 1994;151(5):1396—9.
3. Palmer J., Hertzog P.J., Hammacher A. Differential expression and effects of gp130 cytokines and receptors in prostate cancer cells. Int J Biochem
2004;36(11):2258—69.
4. Kim O., Jiang T, Xie Y. et al. Synergism of cytoplasmic kinases in IL6-induced ligand-independent activation of androgen receptor in prostate cancer cells. Oncogene 2004;23(10):1838—44.
5. Hammacher A., Thompson E.W.,
Williams E.D. Interleukin-6 is a potent inducer of S100P, which is upregulated in andoreg-refactory and metastatic prostate cancer. Int J Biochem 2005;37(2):442—50.
6. Гурцевич В.Э. Вирус герпеса человека 8
типа (HHV-8). В кн.: Канцерогенез.
Под ред. Д.Г Заридзе. M., Mедицина; 2004. с.314—25.
7. Гурцевич В.Э., Кадырова Е.Л.,
Чернова b.A. и др. Поиск резервуара для HHV-8-ассоциированных болезней и путей распространения HHV-8 в России. Вопр вирусол 2004;49(6):20—4.
8. Hoffman L.J., Bunker C.H., Pellett P.E. et al. Elevated seroprevalence of human herpesvirus 8 among men with prostate cancer. J Infect Dis 2004;189(1):15—20.
