CC BY
61
за (11; 32) дня, с медианным значением 22 дня, при использовании тромболизата (п=9). Длительность культивирования клеток в присутствии 10% ЭТС составила (34; 75) дней, с медианой 54 дня (п=5).
Таким образом, использование 5% тромболизата в качестве добавки к куль-туральной среде позволяет сократить сроки культивирования в 1,6-2,4 раза по сравнению с применением 10% ЭТС.
При анализе клеточности образцов было установлено, что сокращение сроков их культивирования не приводило к уменьшению количества клеток в трансплантатах, получаемых с использованием тромболизата. Напротив, использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде способствовало увеличению клеточности образцов на всех этапах получения трансплантатов МСК по сравнению с использованием 10% ЭТС (рис. 2).
Как видно из гистограммы (см. рис. 2), клеточность образцов МСК КМ, полученных от пациентов с рассеянным склерозом, варьирует в диапозоне (119,7; 412,48)
х106, с медианой 209х106, на конечном этапе культивирования при использовании тромболизата (п=8). Аналогичный показатель при добавлении ЭТС - (12; 89,3) х106, с медианой 64,3х106 клеток, (п=8). При культивировании МСК КМ от здоровых доноров количество клеток в анализируемых образцах составило (112; 774,35) х106, с медианой 192,63 х106, для лизата тромбоцитов (п=8), и (66,7; 244,35) х106, с медианой 84,94 х106, - для ЭТС (п=8). При культивировании МСК ЖТ данный показатель составил (91;328,24) х106, с медианой 172 х106, при использовании тромболизата (п=9). Длительность культивирования клеток в присутствии 10% ЭТС - (20,5; 69,5) х106, с медианным значением 30х106 (п=5).
Таким образом, использование 5% тромболизата в качестве добавки к культу-ральной среде способствует увеличению клеточности трансплантатов от 2,3 раза для МСК, выделенных из костного мозга, до 5,7 раза для МСК, выделенных из жировой ткани, по сравнению с клетками, культивированными в присутствии 10% ЭТС.
Выводы:
1. Установлено, что использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде обеспечивает получение качественного клеточного трансплантата в более короткие сроки по сравнению с применением 10% ЭТС.
2. Использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде способствует увеличению клеточности трансплантатов МСК.
3. Полученные данные позволяют рекомендовать использование лизата тромбоцитов в качестве альтернативы ЭТС в клинических протоколах.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. BergerM.G. [et al.] // Stem. Cells. - 2006. - Vol.24. -Р.2888-2890.
2. Doucet C. [et alj // J. Cell. Physiol. - 2005. -Vol.205. - Р.228-236.
3. Kume T [et al.] // Eur. J. Pharmacol. - 2006. -Vol.542. - Р.69-76.
4. Lange^ C. [et al.] // Cell. Ther. Transplant. - 2008. -
5. Stute N. [et al.] // Exp. Hematol. - 2004. - Vol.32. -Р.1212-1225.
Поступила 19.07.2013 г.
Экспрессия вт-тубулина в клетках колоректального рака
Портянко А.С.1, Ковалев П.А.2, Межеевский А.Б.1, Горгун Ю.В.3, Черствый Е.Д.1
Белорусский государственный медицинский университет, Минск 21ородское клиническое патологоанатомичекое бюро, Минск 3Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Portyanko A.S.1, Kovalev P.A.2, Mezheyeuski A.B.1, Gorgun J.V.3, Cherstvoy E.D.1
1 Belarusian State Medical University, Minsk 2 City Clinical Pathological Bureau, Minsk 3 Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Expression of pm-tubulin in colorectal cancer cells
Резюме. Известно, что инвазивный рост опухоли связан с динамикой структур цитоскелета, в том числе и микротрубочек. Состав микротрубочек влияет на их свойства, включая динамику и чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Цель данного исследования -установление изменений в экспрессии fi-тубулина в клетках колоректального рака. В основу исследования легло определение оптической плотности хромогена в гистологических препаратах, окрашенных методом иммуногистохимии. Было установлено статистически значимое повышение оптической плотности в инвазивном крае.
Ключевые слова: колоректальный рак, тубулин, цитоскелет, опухолевое почкование, инвазия. Медицинские новости. — 2014. — №4. — С. 50-53.
Summary. It is known that cancer cell invasion is associated wtth the dynamics of cytoskeletal structures including microtubules. Composition of microtubules affects their properties, including dynamics and sensitivity to anticancer agents. Hence, we investigated the expression of ftiirtubulin in colorectal cancer cells. The study was based on the determination of optical density of chromogen on histological slides stained by immunohistochemistry. A significantly higher optical density was found at the invasive front. Keywords: colorectal cancer, tubuiin, microtubules, cytoskeleton, tumor budding, invasion. Meditsinskie novosti. - 2014. - N4. - P. 50-53.
Несмотря на определенные успехи, смертность от злокачественных новообразований остается актуальной проблемой здравоохранения во всем мире. Во многом это связано
с ограниченным эффектом используемых химиотерапевтических средств. Для обеспечения значительного прорыва в данной области требуются новые подходы к созданию противоопухоле-
вых препаратов. Одним из таких подходов может стать подавление миграционной активности опухолевых клеток, поскольку именно метастазирование как следствие инвазивного роста и со-
ставляет основную проблему лечения онкологических пациентов.
Движение клеток, частным вариантом которого является инвазия опухолевыми клетками, тесно связано с динамикой структур цитоскелета. Хорошо известно, что движение клеток обеспечивается актиновыми микрофиламентами. Позднее было установлено, что микротрубочки также играют важную роль в обеспечении клеточной подвижности и что функционирование актиновых микрофиламентов зависит от полимериза-ционной динамики микротрубочек.
Микротрубочки цитоскелета эука-риот построены из гетеродимеров а- и в-тубулинов. И а- и в-тубулины представляют собой полипептидные субъединицы массой 50 кДа, которые существуют в виде множества изотипов. Микротрубочки, состоящие из очищенного изотипа авш, намного более динамичны, чем микротрубочки из изотипов ав,, или аву или из нефракционированного очищенного на фосфоцеллюлозе тубулина. Более того, увеличение доли изотипа ав,, в смеси с изотипами ав,, и ав,,, подавляло динамику микротрубочек, демонстрируя таким образом, что динамика микротрубочек зависит от того, из каких изотипов тубулина они состоят [13]. Кроме того, разные типы тубулинов связаны с различной чувствительностью опухоли к разным химиотерапевтическим агентам [8, 9, 11].
По данным ВОЗ, колоректальный рак (КРР) занимает 4-е место среди причин онкологической летальности в мире. Каждый год диагностируется более миллиона новых случаев, более 500 тысяч пациентов ежегодно умирают от этой болезни [3]. КРР - удобная модель для изучения опухолевой инвазии, поскольку имеет легко определяемый инвазивный фронт.
В инвазивном фронте КРР описан гистологический феномен «опухолевого почкования», который ассоциирован с негативным прогнозом течения заболевания и представляет собой наличие отдельных или мелких групп клеток в инва-зивном крае [2, 10].
Цель исследования - определение экспрессии вщ-тубулина в клетках КРР и ее связи с опухолевым почкованием.
Материалы и методы
Образцы тканей. Исследование было проведено на фиксированном в формалине гистологическом операционном материале 32 опухолей от 31 пациента с высоко и умеренно дифференцированной аденокарциномой. Для исследования были выбраны блоки с участком наиболее глубокого инвазивного роста опухоли.
Антитела. Использовались моно-клональные мышиные антитела к ßIH-тубулину (клон 5G8, Promega, США) и к цитокератину (клон AE1/3, DAKO, Дания) в разведениях 1:1000 и 1:100 соответственно. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к цитокератину применялось для выявления опухолевого почкования.
Процедура иммуногистохимического окрашивания. Гистологические срезы толщиной 4 мкм монтировались на предметные стекла, покрытые силаном, и после депарафинизирования в ксилоле реги-дратировались в этаноле. Демаскировка антигенов проводилась в микроволновой печи с использованием цитратного буфера (pH 6) в течение 16 мин при мощности 850 Вт. Эндогенная пероксидазная активность подавлялась 3% раствором перекиси водорода в течение 20 мин, неспецифическое связывание - 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин. Инкубация с первичным антителом проводилась в холодильной камере при 4 °C в течение 18 ч. Детекция связавшихся антител производилась при помощи полимерной системы визуализации EnVision (DAKO, Дания). В качестве хромогена использовался диаминобензидин (DAKO, Дания), в качестве контрокрашивания - гематоксилин Майера. Для проведения отрицательного контрольного окрашивания исключались первичные антитела. Срезы КРР с интенсивным окрашиванием использовались в качестве положительного контроля иммуногистохимической реакции.
Оценка иммуногистохимического окрашивания. Опухолевое почкование оценивалось количественно на препаратах, окрашенных антителами к цитокератину. За опухолевую почку принимались изолированные недифференцированные клетки или кластер из менее чем пяти клеток в области наиболее глубокого инвазивного роста. Оценивалось количество опухолевых почек в поле зрения (объектив х20) с наибольшей интенсивностью опухолевого почкования.
Количественная оценка препаратов, окрашенных антителами к ß^-тубулину, производилась на полученныхпри увеличении х200 с использованием цифровой камеры Leica DC200 изображениях 10 случайных непересекающихся полей зрения из центральной зоны и 10 непересекающихся последовательных полей зрения из инвазивного фронта каждой опухоли. Размер каждого изображения составил 1798x1438 пикселей. Полу-
Иммуногистохимичес кое окрашивание гистологических срезов КРР с антителами к цитокератину ДО и вш-тубулину (Б); хромоген ДАБ, контрокрашивание гематоксилином, объектив х20
П р и м е ч а н и е (А): стрелками указаны опухолевые почки.
П р и м е ч а н и е (Б): черные стрелки указывают на позитивные «отпочковывающиеся» комплексы, прозрачные - на более дифференцированные негативные клетки.
ченные изображения анализировались с помощью пакета анализа ImageScope v.9.0.19.1516 (Aperio Technologies, Inc.). Для последующего анализа эпителиальный компонент обводился при помощи планшета Bamboo pen tablet (Wacom Co., Ltd.) и инструмента Pen Tool в пакете ImageScope. Артефакты, просветы желёз, некротические массы также обводились, но при помощи инструмента Negative Pen Tool, и таким образом исключались из последующего анализа. Для количественного анализа позитивного окрашивания использовался алгоритм Positive Pixel Count v.9. Пороговые значения слабой, умеренной и выраженной интенсивностей были оставлены по умолчанию. Из автоматически рассчитываемых параметров были использованы следующие: Iavg - средняя интенсивность всех позитивных пикселей; Positivity - общее количество позитивных пикселей / общее количество всех пикселей в проанализированных регионах. Из них рассчитывались следующие показатели [6]: OD (оптическая плотность) = -lg (Iavg/240), ODp = OD x Positivity x 100%.
^Та блица | Результаты количественной оценки экспрессии ßш-тубулина
Опухоль ОП Инвазивный край LI [ентр опухоли
n OD ODp, % n OD ODp, %
1 20 147 0,3312* 31,97* 244 0,2140 18,58
2 30 174 0,2200* 18,49* 210 0,1300 3,86
3 40 126 0,1857* 10,76* 228 0,1367 1,79
4 5 173 0,1922* 14,17* 308 0,1545 9,37
5 49 124 0,1186* 2,84 179 0,1109 2,73
6 4 145 0,1410* 5,49 198 0,1153 4,26
7 32 303 0,1606* 12,62* 269 0,1187 8,51
8 58 210 0,1261* 5,89* 264 0,1037 3,49
9 74 253 0,1914* 12,12* 268 0,1584 8,26
10 106 164 0,1861* 14,47* 181 0,0969 2,98
11 46 181 0,1756 8,53 148 0,1590 7,09
12 25 201 0,1977* 4,02* 188 0,1796 1,00
13 141 317 0,1562* 8,08* 135 0,1140 1,46
14 51 157 0,2234* 18,39* 260 0,1761 9,64
15 42 135 0,1470* 11,13* 147 0,1248 8,00
16 12 103 0,1105* 0,26* 143 0,0617 0,10
17 21 115 0,1733* 13,11* 123 0,1430 6,73
18 32 199 0,1145* 3,64* 197 0,0972 1,78
19 11 201 0,1462 4,08* 149 0,1567 3,98
20 24 96 0,1673* 12,56* 129 0,1230 1,36
21 16 133 0,2883 5,22* 172 0,2902 2,28
22 10 149 0,1546* 1,04* 232 0,0706 0,08
23 21 175 0,1893 1,04* 264 0,1918 0,23
24 0 157 0,1610* 0,57* 270 0,1174 0,37
25 38 110 0,2523 3,07* 180 0,2627* 1,33
26 45 186 0,3303* 6,79* 103 0,2158 2,50
27 38 131 0,4011* 27,37* 177 0,2027 2,94
28 17 110 0,1682* 3,29* 146 0,1233 0,93
29 39 271 0,2372* 8,53* 218 0,1689 1,93
30 5 216 0,2092* 8,63* 249 0,1420 1,66
31 0 126 0,0982 0,45 434 0,0943 0,66*
32 57 194 0,2301* 7,40* 250 0,1773 1,63
П р и м е ч а н и е: ОП - количество опухолевых почек в поле зрения; n - количество эпителиальных компартментов; OD - оптическая плотность хромогена; ODp, % -процент позитивных пикселей; * - достоверно более высокое значение (p<0,05, тест Mann-Whitney).
Статистический анализ проводился с использованием пакета MedCalc (v. 12.2.1.0). Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовался тест D'Agostino-Pearson. Для всех данных, использованных в данном исследовании, гипотеза о нормальном распределении была отвергнута (p<0,05). Для анализа данных также использовались тесты Mann-Whitney и Wilcoxon, а также корреляционный анализ Spearman. Нулевая гипотеза отклонялась при значении p<0,05.
Результаты и обсуждение
Опухолевые почки были обнаружены в 29 случаях (90,6%) (рисунок, А). Результаты количественной оценки этого феномена представлены в таблице. Все случаи были разделены на три группы в зависимости от степени опухолевого почкования. В качестве отсекающих были приняты значения 33 и 66 перцентилей, 20 и 40 опухолевых почек в поле зрения соответственно.
Позитивное окрашивание с антителами к ßm-тубулину наблюдалось во всех случаях. Эпителий прилежащей неопухолевой слизистой оболочки толстой кишки окрашивался негативно, опухолевые клетки окрашивались гетерогенно. Наиболее интенсивное окрашивание наблюдалось в области инвазивного края. Экспрессия ßm-тубулина была выявлена в опухолевых клетках инвазивного фронта, непосредственно «отпочковывающихся» от более дифференцированных и окрашивающихся негативно клеток опухоли (рисунок, Б).
Как видно из таблицы, в 2б опухолях (81,3%) оптическая плотность (OD) хромогена была достоверно выше в инва-зивном крае, в одном случае (3,1%) -достоверно выше в центре опухоли, в 5 случаях (15,6%) этот показатель не отличался. Показатель ODp, учитывающий также процент позитивных пикселей, был достоверно выше в инва-зивном фронте в 28 опухолях (87,5%), в одном случае (3,1%) - достоверно выше в центре опухоли, в 3 случаях (9,3%) не обнаружено различий между центром и периферией опухоли. Тест Wilcoxon для зависимых выборок выявил достоверное различие по обоим параметрам экспрессии ß^-тубулина (р<0,0001) между центром и инвазив-ным фронтом опухолей.
Была установлена прямая корреляционная связь между количеством опухолевых почек в поле зрения и показателем ODp экспрессии ß^-тубулина в инвазивном крае (Spearman: р=0,350, p=0,0493). В группе с низкой степенью опухолевого почкования показатель ODp в инвазивном крае был достовер-
но ниже, чем в группе с умеренной и высокой степенью (тест Mann-Whitney: р=0,0312 и р=0,0210 соответственно). Между группами с умеренной и высокой степенью опухолевого почкования достоверных различий не обнаружено (р=0,2766).
В результате проведенного исследования было установлено повышение экспрессии ßm-тубулина в инвазивном фронте КрР. Также была показана связь этого факта со степенью опухолевого почкования, которая, в свою очередь, является известным предиктором неблагоприятного течения КРР в послеоперационный период [2, 9, 11]. Ранее нами было показано, что ß^-тубулин экспрессируется непосредственно опухолевыми почками, и чем выше
процент опухолевых почек, позитивных к ßm-тубулину, тем выше степень опухолевого почкования [1].
Для многих опухолей доказано, что экспрессия ß^-тубулина в опухолях связана с более высокой их агрессивностью [4], а также устойчивостью к некоторым химиотерапевтичеким агентам [5, 8]. Полученные нами данные свидетельствуют о возможной роли ßm-тубулина в миграционной активности опухолевых клеток, что позволяет рассматривать эту молекулу как потенциальную мишень для подавления инвазивного потенциала опухоли.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Портянко А.С., Дегтярева М.Ю., Горгун Ю.В. с соавт. // Лечеб. дело. - 2012. - №4. - C.64-69.
2. Compton C. Prognostic factors in cancer (3rd ed). -NY: WileyLiss, 2006.
3. Jemal A., Bray F, Ferlay J. et al. // CA: Cancer J. Clin. - 2011. - Vol.61, N2. - P.69-90.
4. Katsetos C.D., Herman M.M., Mork S.J. // Cell Motil. Cytoskeleton. - 2003. - Vol.55. - P.77-96.
5. Kavallaris M. // Nat. Rev. Cancer. - 2010. - Vol.10. -P.194-204.
6. Krajewska M., Smith L.H., Rong J. et al. // J.
Histochem. Cytochem. - 2009. - Vol.57. - P.649-663.
7. Panda D., Miller H.P., Banerjee A. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. - Vol.91. - P.11358-11362.
8. Stengel C., Newman S.P., Leese M.P. // Brit. J. Cancer. - 20l0. - Vol.102. - P.316-324.
9. Tanaka M., Hashiguchi Y, Ueno H. // Dis. Colon Rectum. - 2003. - Vol.46, N8. - P.1054-1059.
10. Ueno H., Price A.B., Wilkinson K.H. et al. // Ann. Surg. - 2004. - Vol.240. - P.832-839.
11. Wang L.M., Kevans D., Mulcahy H. et al. // Am. J. Surg. Path. - 2009. - Vol.33, N1. - P.134-141.
Работа выполнена при поддержке Государственной программы научных исследований (1.2.42) и Международного научно-технического центра (B-1636).
Поступила 25.06.2013 г.
Характеристика микробиоценоза содержимого пародонтальных карманов пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом на фоне системной антибактериальной терапии сопутствующего заболевания
Матвийкив Т.И.
Ивано-Франковский национальный медицинский университет, Украина
Matviykiv TI.
Ivano-Frankivsk State National Medical University, Ukraine
Microbiocenosis characteristics of the periodontal pockets content for the patients with chronical generalized periodontitis on the basis of systemic antibacterial therapy of other somatic pathology
Резюме. Системная антибиотикотерапия является важным принципом лечения различных соматических заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет микробный фактор. Один из недостаточно изученных аспектов побочного действия таких мощных фармакологических препаратов, как антибиотики широкого спектра действия, - их влияние на течение параллельно протекающих стоматологических заболеваний, в частности хронического генерализованного пародонтита. Представлены результаты микробиологических исследований, которые свидетельствуют об углублении неблагоприятных изменений качественного и количественного состава микрофлоры пародонтальных карманов у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом, получавших системную антибиотикотерапию по поводу лечения сопутствующей патологии. Предложено корригирующее лечение с включением в схему антисептического ополаскивателя для полости рта «Стоматофит» и пробиотического препарата «Энтерожермина», позволяющее более эффективно очистить пародонтальные карманы от пародонтопатогенной микрофлоры, доказывается целесообразность и терапевтическая эффективность предложенного лечения. Ключевые слова: микробиологический спектр содержания пародонтального кармана, хронический генерализованным пародонтит, системная антибиотикотерапия, сопутствующая патология, профессиональная гигиена полости рта, Энтерожермина, Стоматофит.
Медицинские новости. - 2014. - №4. - С. 53- 58. Summary. Systemic antibiotic therapy is an important principle of treating various medical conditions in the pathogenesis of which the role of microbial factor plays a decisive role. One of the understudied aspects of the side effects of such powerful pharmacological agents, such as broad-spectrum antibiotics, regards their impact on the parallel proceeding dental diseases, particulary chronical generalized periodontitis. The obtained results of performed microbiological studies indicates on deepening of adverse changes of qualitative and quantitative composition of periodontal pockets microflora for patients with diagnosed chronic generalized periodontitis, which are treated with systemic antibiotic therapy of other parallel somatic pathology. A proposed corrective stomatological treatment involves a scheme of "Stomatofit" antiseptic mouthwash usage and intake of probiotic preparation "Enterozhermina". It allows more effectively clean and eliminate paradonthopathogenic microflora from the periodontal pockets and improves the feasibiiity and therapeutic efficacy of the proposed treatment.
Keywords: spectrum microbiological content of the periodontal pocket, chronic generalized periodontitis, systemic antibiotic therapy, somatic pathology, professional oral hygiene, Enterozhermina, Stomatofit. Meditsinskie novosti. - 2014. - N4. - P. 53- 58.
Системная антибиотикотерапия (САБТ) является важным принципом лечения различных соматических заболеваний, в патогенезе которых решающую роль играет микробный фактор [2, 3]. Применение различных групп антибиотиков широкого спектра действия (макролидов, фторхинолонов, цефало-споринов и т.д.) для лечения пневмоний,
хронических неспецифических заболеваний легких, язвенной болезни желудка в клинике внутренних болезней часто практикуется в соответствии со стандартами лечения соответствующей патологи [6, 13]. Однако далеко не всегда они обоснованы результатами бактериологического обследования для такой категории пациентов [3, 4].
Некоторые аспекты побочного действия таких мощных фармакологических препаратов, каковыми являются антибиотики широкого спектра действия, недостаточно изучены. Это касается и их влияния на ход параллельно протекающих стоматологических заболеваний, в частности хронического генерализованного пародонтита (ХГП) [12, 14].
