Экспрессия HLA-DR-антигенов на моноцитах периферической крови как показатель состояния иммунной системы при гипохромных анемиях Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Статья поступила в редакцию 20.02.2012 г.

ЭКСПРЕССИЯ HLA-DR-АНТИГЕНОВ НА МОНОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ГИПОХРОМНОЙ АНЕМИИ

EXPRESSION OF HLA-DR-ANTIGENES ON MONOCYTES OF PERIPHERAL BLOOD AS INDICATOR OF CONDITION OF IMMUNE SYSTEM IN HYPOCHROMIC ANEMIA

Клочкова-Абельянц С.А. Klochkova-Abelyants S.A.

Суржикова Г.С. Surzhikova G.S.

Новокузнецкий государственный институт Novokuznetsk State Institute

усовершенствования врачей, of Medical Extension Course,

г. Новокузнецк, Россия Novokuznetsk, Russia

Цель - изучение функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на моноцитах при гипохромной анемии. Материалы и методы. Исследования проведены у 284 женщин в возрасте от 16 до 60 лет. Из них, 79 женщин были практически здоровыми и составили контрольную группу, у 205 человек выявлен анемический синдром, в т.ч. 103 женщины страдали железодефицитной анемией, 102 - анемией хронических заболеваний. Функциональную активность моноцитов периферической крови оценивали по экспрессии на клетках HLA-DR-антигена методом прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител CD14, HLA-DR, меченых флуоресцентными красителями изотиоцианатом флюоресцеина ^ГГС) и фикоэритрином (РЕ). Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре СуЬэт^ ВС-500 в многопараметрическом анализе с поэтапным гейтированием.

Результаты. При анализе функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на клетках в моноцитарной популяции (моноцитар-ном гейте) выявлено снижение относительного числа моноцитов, экспресси-рующих молекулы HLA-DR до 81,7 ± 0,8 %, в то время как у практически здоровых женщин экспрессия HLA-DR-антигена на моноцитах составила 90,4 ± 0,5 % (р < 0,001). При анализе функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на моноцитах у всех обследованных лиц с АХЗ выявлено достоверное снижение количества моноцитов, экспрессирующих молекулы HLA-DR, до 65,2 ± 0,6 % у больных с АХЗ на фоне бактериальных инфекций и до 67,5 ± 0,3% у больных с АХЗ на фоне аутоиммунной патологии, по сравнению с практически здоровыми женщинами (р < 0,001) и группой лиц с ЖДА (р < 0,001).

Выводы. При гипохромной анемии имеет место снижение экспрессии антигена HLA-DR на моноцитах, что позволяет диагностировать отклонения в иммунной защите на уровне презентации антигена Т-клеткам. Определение экспрессии антигена HLA-DR на моноцитах периферической крови может служить показателем состояния иммунной системы при гипохромной анемии. Ключевые слова: гипохромная анемия; железодефицитная анемия; анемия хронических заболеваний; цитофлюориметрия; HLA-DR-антиген.

Objective - to study the functional activity of monocyte by expression of HLA-DR-antigen on monocytes in hypochromic anemia. Materials and methods. The study included 284 women aged 16 to 60. 79 of them were apparently healthy. They were included into control group. 205 women had anemia, including 103 women suffered from iron deficiency anemia (IDA), 102 - anemia of chronic disease. The functional activity of peripheral blood monocytes was assessed by the expression on the cells of HLA-DR-antigen with direct immunofluorescence using monoclonal antibodies CD14, HLA-DR, labeled with fluorescent dyes fluorescein isothiocyanate (FITC) and phycoerythrin (PE). Stained cells were analyzed on flow cytometer Cytomics FC-500 in a multi-parameter analysis with stepwise gating.

Results. In the analysis of the functional activity of monocyte expression of HLA-DR-antigen on cells in the monocytic population (monocyte gate) a reduction in the relative number of monocytes expressing HLA-DR molecules to 81,7 ± 0,8 % was revealed, while healthy women showed the expression of HLA-DR-antigen on monocytes 90,4 ± 0,5 % (p < 0,001). In the analysis of the functional activity of monocyte with expression of HLA-DR-antigen on monocytes all examined individuals with anemia of chronic disease showed a significant decrease in the number of monocytes expressing HLA-DR molecules up to 65,2 ± 0,6 % among the patients with anemia of chronic disease in bacterial infection pattern and 67,5 ± 0,3 % for patients with anemia of chronic disease having autoimmune pathology, in comparison with healthy women (p < 0,001) and the group of individuals with IDA (p < 0,001).

Conclusions. In hypochromic anemia a decrease of expression of antigen HLA-DR on monocytes occurs, which allows us to diagnose abnormalities in the immune protection at the level of antigen presentation to T-cells. Determination of antigen expression on monocytes of peripheric blood can serve as an indicator of a condition of immune system in hypochromic anemia. Key words: hypochromic anemia; iron deficiency anemia; anemia of chronic disease; cytofluorometry; HLA-DR-antigen.

Гипохромная анемия относится к числу наиболее распространенных заболеваний в мире, среди которых железодефицитная анемия (ЖДА) составляет до 80-95 % всем форм малокровия [1]. При железо-дефицитной анемии нарушается деятельность практически всех органов и систем, в том числе и иммун-

ной системы, что приводит к срыву адаптации и росту заболеваемости [2]. Анемия, сопровождающая хронические воспалительные, опухолевые процессы, относится к так называемой анемии хронических заболеваний (АХЗ) и занимает второе место по распространенности после ЖДА. За последние не-

сколько лет понимание механизмов развития анемического синдрома при хронических инфекционных и системных аутоиммунных заболеваниях стало несравненно глубже, что дало толчок к разработке технологий нового поколения для современной диагностики и патогенетического обоснования лечения [3].

№ 2 [июнь] 2012

Вместе с тем, остается целый ряд вопросов, касающихся механизмов участия отдельных звеньев иммунитета в патогенезе АХЗ.

При формировании иммунной реакции одна из важных ролей принадлежит моноцитам. Моноциты у здоровых индивидуумов экспресси-руют на своей поверхности молекулы HLA-DR высокой плотности. HLA-DR — белок, принадлежащий к молекулам гистосовместимости II класса, экспрессируется в основном на антиген-представляющих клетках — АПК (моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В-клет-ки). HLA-DR, кроме этого, может экспрессироваться на различных подклассах лимфоцитов (CD4+, CD8+, натуральных киллерах, ре-гуляторных Т-клетках) при активации, однако функция этой молекулы на клетках, неспособных представлять антиген, не совсем ясна. Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что моноциты с уменьшенной или отсутствующей экспрессией молекул HLA-DR не могут выполнять свою антигенпредставляющую функцию и не обладают способностью продуцировать воспалительные медиаторы в ответ на соответствующие стимулы [4]. По данным Зуроч-ки А.В. и соавт. [5], уменьшение экспрессии HLA-DR на моноцитах коррелирует с увеличением риска инфекционных осложнений у пациентов с травмой, ожогами, при панкреатите, сепсисе. Аналогичный эффект наблюдали при осложнениях в сердечно-сосудистой хирургии [6], после трансплантации [7].

Однако в доступной литературе нам не встретились работы по исследованию HLA-DR на моноцитах при гипохромной анемии. В связи с этим, представляет интерес провести оценку функционального состояния моноцитов при гипохромной анемии, т.к. эта популяция клеток является важным звеном механизма кооперации клеток в иммунном ответе и может быть использована как показатель оценки состояния иммунного статуса.

Целью настоящей работы является изучение функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на моноцитах при гипохромной анемии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены у 284 женщин в возрасте от 16 до 60 лет. Из них, 79 были практически здоровыми и составили контрольную группу, у 205 женщин выявлен анемический синдром, из них 103 женщины страдали ЖДА, 102 — анемией хронических заболеваний. Основной причиной же-лезодефицитной анемии являлись кровотечения: у 26 — вследствие наличия фибромиоматозных узлов, у 77 — вследствие нарушения менструального цикла с гиперполи-менорреей. 62 % женщин с ЖДА страдали частыми респираторными заболеваниями. В период наблюдения у больных не было каких-либо инфекционно-воспалительных заболеваний. У 52 женщин диагностирована анемия, развившаяся на фоне аутоиммунных заболеваний соединительной ткани (ревматоидный артрит), у 50 — анемия хронических заболеваний при бактериальных инфекциях (хронический тонзиллит, бактериальный эндокардит, хронический пиелонефрит). Долабораторное клиническое обследование проводили с помощью анкеты-опросника, включавшей разделы, касающиеся жалоб больных, анамнеза жизни и болезни, наличия сопутствующих заболеваний, данных объективного обследования.

У всех пациентов было получено информированное согласие на использование данных исследования в научных целях и согласие этического комитета на проведение исследования.

Критериями исключения пациенток из исследования были следующие: возраст младше 16 лет и старше 60 лет, другие формы анемии, наличие злокачественных заболеваний, отказ от участия в исследовании.

Исследования показателей периферического звена эритрона проводили на гематологическом анализаторе «ADVIA» с оценкой морфофункциональных показателей эритроцитов. Количественное определение сывороточного железа (СЖ) и общей железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС) проводили феррозиновым методом

с использованием диагностических наборов с последующим вычислением латентной железосвя-зывающей способности сыворотки (ЛЖСС) и коэффициента насыщения трансферрина железом (КИТ). Оценку запасов железа проводили по уровню сывороточного феррити-на (СФ), который исследовали им-муноферментным методом. Функциональную активность моноцитов периферической крови оценивали по экспрессии на клетках HLA-DR-антигена методом прямой им-мунофлюоресценции с использованием моноклональных антител CD14, HLA-DR, меченых флуоресцентными красителями изотио-цианатом флюоресцеина (FITC) и фикоэритрином (РЕ). Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC-500 в многопараметрическом анализе с поэтапным гейтированием [8].

Пробоподготовку периферической крови проводили по безотмы-вочной технологии с использованием лизирующих и фиксирующих реагентов «ImmunoPrep Reagent Sistem» и автоматической рабочей станции TQ-PREP. Иа гистограммах, полученных по прямому и боковому светорассеянию, легко локализовались клетки лимфоцитар-ного, моноцитарного и гранулоци-тарного рядов дифференцировки, причем их зоны не перекрывались (рис. 1). Популяцию моноцитов выделяли при помощи гетерогенного гейтирования по параметрам бокового (SS) светорассеяния и экспрессии CD14 антигена (рис. 2). Далее анализировали моноцитарный регион Е, используя двухпараметри-ческие гистограммы распределения моноцитов периферической крови с использованием моноклональных антител CD14 и HLA-DR, меченных FITC и РЕ (рис. 3).

Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики, для оценки достоверности результатов исследования использовали t-критерий Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Все математические операции проведены с использованием программных пакетов «MS-EXCEL», «MS-WORD».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ У всех обследованных больных ЖДА отмечалось достоверное снижение гематокритного показателя и объема эритроцитов, среднего содержания гемоглобина (МСН) и средней концентрации гемоглобина (МСНС) в эритроцитах (табл. 1), снижение уровня СЖ и КНТ, при значимо повышенных ОЖСС и ЛЖСС по сравнению с таковыми у здоровых лиц (р < 0,05) (табл. 2). Уровень СФ у больных ЖДА составил в среднем 4,91 ± 0,66 нг/мл и был значимо ниже по сравнению с таковым в контрольной группе (р < 0,05), что в совокупности с клиническими данными, результатами гематологических исследований и исследованием феррокине-тики свидетельствовало о микроци-тарном, гипохромном, железодефи-цитном характере анемии.

При исследовании показателей периферического звена эритрона у лиц с АХЗ выявлена анемия легкой и средней степени тяжести, которая характеризовалась нормальными, чаще сниженными показателями среднего объема эритроцитов и среднего содержания гемоглобина в эритроцитах, отмечалась умеренная степень анизо-цитоза и пойкилоцитоза. У лиц с АХЗ на фоне бактериальных инфекций и при аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани уровни СЖ, ОЖСС и КНТ были значимо ниже по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Уровень СФ в группе лиц с АХЗ при бактериальных инфекциях и аутоиммунных заболеваниях составил 178,59 ± 75,52 нг/мл и 238,38 ± 64,16 нг/мл, соответственно, против 33,55 ± 2,59 нг/мл у здоровых лиц (р < 0,05), то есть количество

депонированного железа в организме, определяемое по уровню сывороточного ферритина, не было сниженным, несмотря на гипохромный характер анемий (табл. 2).

При оценке лейкограммы содержание моноцитов у больных же-лезодефицитной анемией легкой и средней степени тяжести составило 0,24 х 109/л и не отличалось от такового у практически здоровых лиц - 0,25 х 109/л (p > 0,05). При анализе функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на клетках в моноци-тарной популяции (моноцитарном гейте) выявлено снижение относительного числа моноцитов, экс-прессирующих молекулы HLA-DR, до 81,7 ± 0,8 %, в то время как у практически здоровых женщин экспрессия HLA-DR-антигена на моноцитах составила 90,4 ± 0,5% (р < 0,001) (рис. 4, 5).

Рисунок 1 Рисунок 2

Распределение популяций лейкоцитов Распределение популяций лейкоцитов по боковому

периферической крови по параметрам малоуглового светорассеянию и экспрессии СБ 14 (Р8, ось ординат) и бокового (88, ось абсцисс)

тж

Y-'

I I I J. I III |

.........1-г—г-гттт

Рисунок 3

Анализ моноцитарного региона Е по экспрессии CD14 и HLA-DR антигенов

Рисунок 4

Нормальная экспрессия молекул HLA-DR на моноцитах периферической крови

65

№ 2 [июнь] 2012

Таблица 1

Показатели периферического звена эритрона при гипохромных анемиях

АХЗ при инфекционно-

Показатель Контрольная группа воспалительных процессах АХЗ при РА ЖДА

RBC, х1012/л 4,18 ± 0,05 3,23 ± 0,28* 3,52 ± 0,13* 3,57 ± 0,07*

HGB, г/л 135,88 ± 3,08 91,00 ± 7,55* 103,00 ± 3,87*« 90,14 ± 1,99*

HCT, % 36,88 ± 1,1 25,4 ± 2,89* 27,02 ± 1,35* 29,09 ± 0,71*

MCV, фл 89,15 ± 1,38 76,00 ± 3,88* 76,67 ± 2,99* 74,8 ± 1,18*

MCH, пг 33,15 ± 0,31 26,8 ± 1,97* 27,99 ± 1,22*« 23,46 ± 0,64*

MCHC, г/дл 37,44 ± 0,55 34,1 ± 0,89*« 35,22 ± 0,047*« 31,28 ± 0,6*

RDW, % 11,09 ± 0,11 16,53 ± 0,92* 15,59 ± 0,62* 14,29 ± 0,4*

Примечание: * достоверность различий показателей по сравнению с показателем контрольной группы при р < 0,05; • достоверность различий показателей у лиц с АХЗ по сравнению с показателями у лиц с ЖДА при р < 0,05.

Таблица 2

Показатели феррокинетики при гипохромных анемиях

Показатель Контрольная группа АХЗ при инфекционно-воспалительных процессах АХЗ при РА ЖДА

СЖ, мкмоль/л 20,4 ± 1,02 11,07 ± 1,9* 9,52 ± 1,0* 8,44 ± 0,32*

ОЖСС, мкмоль/л 65,68 ± 1,83 53,24 ± 4,5*« 49,65 ± 6,56*« 80,96 ± 1,25*

ЛЖСС, мкмоль/л 44,53 ± 1,87 42,91 ± 4,38« 38,42 ± 8,02« 71,41 ± 1,45*

КНТ, % 32,32 ± 1,84 14,99 ± 2,73* 16,74 ± 2,02*« 11,4 ± 0,52

СФ, нг/мл 33,55 ± 2,59 178,59 ± 75,52 238,38 ± 64,16 4,91 ± 0,66

Примечание: * достоверность различий показателей по сравнению с показателем контрольной группы при р < 0,05; • достоверность различий показателей у лиц с АХЗ по сравнению с показателями у лиц с ЖДА при р < 0,05.

Абсолютное содержание моноцитов у лиц с АХЗ на фоне бактериальных инфекций и при аутоиммунных заболеваниях составило в среднем 0,5 ± 0,03 х 109/л и 0,45 ± 0,05 х 109/л, соответственно, и оказалось достоверно выше по сравнению с таковым у практи-

чески здоровых лиц и лиц, страдающих ЖДА. При анализе функциональной активности моноцитов по экспрессии HLA-DR-антигена на моноцитах у всех обследованных лиц с АХЗ выявлено достоверное снижение количества моноцитов, экспрессирующих молекулы HLA-

DR, до 65,2 ± 0,6 % у больных с АХЗ на фоне бактериальных инфекций и 67,5 ± 0,3 % у больных с АХЗ на фоне аутоиммунной патологии, по сравнению с практически здоровыми женщинами (р < 0,001) и группой лиц с ЖДА (р < 0,001) (рис. 6).

Рисунок 5

Экспрессия молекул HLA-DR на моноцитах периферической крови больного Г.

с железодефицитной анемией

10'

: D1

ш

с.

ÜL а

1<»Ч

10е-,

0.7%

¿D3

17.2%

D2

81.7%

'.-ft

ifflf

D4

0.6%

-1—I W 1 II fTJ-ТТТТТТЯ]-1-I TTTTTTj-I-г-гтттп

10» 101 10г 10*

CD14-FITC

Рисунок 6

Экспрессия молекул HLA-DR на моноцитах периферической крови больной Н. с АХЗ на фоне ревматоидного артрита

66

ПОЛИТРАВМА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при гипохромной анемии (ЖДА и АХЗ на фоне бактериальных инфекций и аутоиммунных заболеваний) имеет место снижение количества моноцитов, экспрессирующих молекулы HLA-DR, более выраженное при анемии хронических заболеваний, что является показателем дисфункции иммунной системы при гипох-

Литература:

ромной анемии. Такие изменения в моноцитарно-макрофагальном звене приводят к снижению эф-фекторных реакций клеточного иммунитета за счет нарушения презентации антигена иммуноком-петентным клеткам. Нарушение кооперативных взаимодействий Т-клеток с клетками моноцитарно-макрофагального звена, обусловленное недостаточной экспрессией

HLA-DR-молекул на моноцитах, является одним из звеньев нарушения Т-клеточного иммунитета, выявленным нами ранее у больных с гипохромной анемией. Снижение экспрессии HLA-DR на моноцитах может служить маркером иммунодефицита у больных с гипохром-ной анемией и показателем для назначения иммуномодулирующей терапии.

1. Серов, В.Н. Анемия - акушерские и перинатальные аспекты

/В.Н. Серов, Н.В. Орджоникидзе //Русский медицинский журнал. - 2004. - Т. 12, № 1. - С. 12-15.

2. Сафуанова, Г.Ш. Результаты исследования рецепторов актива-

ции иммунитета (HLA-DR, CD25, CD71), апоптоза (CD95) и стволовых клеток (CD34) у больных железодефицитной анемией /Г.Ш. Сафуанова, А.Н. Чепурная, А.Б. Бакиров //Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - № 10. - С. 15.

3. Кулибаба, Т.Г. Гематологические синдромы при ревматических

заболеваниях /Т.Г. Кулибаба //Медицина XXI век. - 2006. - № 4. - С. 45-51.

4. Хайдуков, С.В. Цитометрический анализ в клинической иммуно-

логии /С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка, В.А. Черешнев. - Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 220 с.

5. Изменения экспрессии HLA-DR-антигенов на моноцитах у де-

тей и ее клиническая значимость при сепсисе /А.В. Зурочка, А.Н. Котляров, М.В. Кувайцев [и др.] //Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10, № 4-5. - С. 379-387.

6. Standardized immune monitoring for the prediction on infections af-

ter cardiopulmonary bypass surgery in risk patients /J.C. Strohmeyer, C. Blume, C. Meisel [et al.] //Cytometry. - 2003. - Vol. 53. - P. 54-62.

7. Human leukocyte antigen-DR expression on peripheral blood monocytes and the risk of pneumonia in pediatric lung transplant recipients /J.A. Hoffman, K.I. Weinberg, C.G. Azen [et al.] //Transpl. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 6 - P. 147-155.

8. Хайдуков, С.В. Избранные вопросы современной проточной цитоме-трии /С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка. - Челябинск: ЧГМА, 2007. - 84 с.

Сведения об авторах:

Клочкова-Абельянц С.А., к.м.н., доцент, кафедра клинической лабораторной диагностики, Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Минздравсоцразвития России», г. Новокузнецк, Россия.

Суржикова Г.С., к.м.н., доцент, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики, Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Минздравсоцразвития России», г. Новокузнецк, Россия.

Адрес для переписки:

Клочкова-Абельянц С.А., ул. Глинки, 3-67, г. Новокузнецк, Кемеровская область, Россия, 654000

Тел: 8 (3843) 79-62-19; 8 (3843) 79-66-76

E-mail: [email protected]

Information about authors:

Klochkova-Abelyants S.A., candidate of medical sciences, docent, clinical and laboratory diagnostics chair, Novokuznetsk State Institute of Medical Extension Course, Novokuznetsk, Russia.

Surzhikova G.S., candidate of medical sciences, docent, head of clinical and laboratory diagnostics chair, Novokuznetsk State Institute of Medical Extension Course, Novokuznetsk, Russia.

Address for correspondence:

Klochkova-Abelyants S.A., Glinki St., 3-67, Novokuznetsk, Kemerovo region, Russia, 654000

Tel: 8 (3843) 79-621-9; 8 (3843) 79-66-76 E-mail: [email protected]

m

67

№ 2 [июнь] 2012