CC BY
37
УДК 615.033:616.133-007.272-008.9
ЭКСПРЕССИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р В ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОМ БАРЬЕРЕ ПРИ ДВУХСТОРОННЕЙ ОККЛЮЗИИ ОБЩИХ СОННЫХ АРТЕРИЙ
И.В. ЧЕРНЫХ Е.Н. ЯКУШЕВА А.В. ЩУЛЬКИН
И.Ю. ВИНОГРАДОВ Д.С. ТИТОВ
Рязанский государственный медицинский университет
В исследовании на 24 крысах изучено влияние двухсторонней
окклюзии общих сонных артерий на экспрессию белка-транспортера гли-копротеина-Р (Pgp) в гематоэнцефалическом барьере лобных долей больших полушарий мозга. Экспрессию Pgp оценивали методом иммуно-гистохимического окрашивания с использованием моноклональных антител. Дополнительно анализировали зависимость интенсивности экспрессии транспортера от уровня окислительного стресса в ткани мозга. Выявлена индукция экспрессии Pgp через 4 часа после начала окклюзии, которая находилась в обратнопропорциональной зависимости от концентрации 8Н-групп в ткани коры головного мозга.
e-mail: enya.rzn@yandex.ru
Ключевые слова: гликопротеин-Р, АВСВ1-белок, ишемия, инсульт, перекисное окисление липидов, общие сонные артерии.
Гликопротеин-Р (Pgp) или АВСВ1-белок - это энергозависимый белок-транспортер, участвующий в эффлюксе большого числа различных по химической структуре веществ. Считается, что, локализуясь в мембране эндотелиальных клеток гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), Pgp обеспечивает защиту головного мозга от ксенобиотиков и ряда биобиотиков, препятствуя их проникновению в ткань мозга [14].
Установлено, что функциональная активность Pgp вариабельна и может различаться у представителей одного вида в результате гендерных различий [4], генетических особенностей (полиморфизм гена МБЯ1, кодирующего транспортер, и транскрипционных факторов, регулирующих его экспрессию, различия в постранскрипционных процессах и пр.), а также изменяться под действием широкого спектра лекарственных средств и факторов внешней и внутренней среды [2, 3, 5, 9]. При этом, повышение функциональной активности Pgp может привести к неэффективности фармакотерапии в связи с интенсивным выведением веществ из клеток и пре-пятствованием их всасыванию в желудочно-кишечном тракте, а снижение - к развитию относительной передозировки и нежелательным лекарственным реакциям [7].
В ряде исследований показано, что экзогенная гипоксическая гипоксия является сильным индуктором функциональной активности Pgp [6, 9, 11, 15]. Предполагается, что развитие гипоксии при различных заболеваниях может существенно изменить фармакокинетику веществ-субстратов Pgp, поэтому способно оказать влияние на эффективность фармакотерапии. Однако влияние других типов гипоксии на экспрессию и функциональную активность данного белка-транспортера и механизмы его реализации изучены недостаточно.
Цель настоящего экспериментального исследования - изучить экспрессию Pgp в ге-матоэнцефалическом барьере при ишемии головного мозга и ее зависимость от выраженности окислительного стресса.
Материалы и методы. Исследование выполнено на 24 крысах Wistar массой 250-300 г. Работа с животными проводилась в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н).
Все животные были разделены на 4 серии: 1 серия - интактные животные, которым выполняли ложную операцию со вскрытием кожных покровов, но без перевязки сонных артерий;
2, 3 и 4 серии - животные, которым моделировали ишемию головного мозга продолжительностью 30 минут, 2 и 4 часа соответственно. Каждая серия включала по 6 крыс. Ишемию головного мозга моделировали двухсторонней перевязкой общих сонных артерий под эфирным наркозом. Все манипуляции выполняли в условиях операционной вивария РязГМУ.
В конце исследования животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Для исследования забирали кору лобных долей больших полушарий, часть которой фиксировали в ю%-ном растворе нейтрального формалина, а часть замораживали при -290С для проведения биохимических исследований.
Гистологический материал подвергали стандартной обработке: проводили обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли ксилолом и заключали в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей посредством нагревания на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0),
блокировали эндогенную пероксидазу 3%-ным раствором пероксида водорода. Затем инкубировали срезы с первичными антителами к Pgp (Mdr-1 3H2833: sc-71557 «SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC», США) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой («DAKO», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.
Микропрепарат фотографировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot G5 при увеличении в 400 раз. В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков (10 фотографий). В дальнейшем изображения анализировали с помощью медицинской программы для анализа и обработки цифровых изображений ImageJ. Оценивали относительную площадь гематоэнцефалического барьера, экспрессирующего Pgp, которую рассчитывали автоматически как: площадь гематоэнцефалического барьера, экспрессирующего Pgp, (pix2) / общая площадь поля зрения (pix2).
В гомогенате коры больших полушарий определяли содержание ТБК-реактивных продуктов - по реакции с тиобарбитуровой кислотой по методу Гавриловой В.Б. и соавт. (1987), свободных сульфгидрильных (SH) групп по методу Ellman G.L. (1959), активность глутатионпероксидазы (G-per) по методу Paglia D.E., Valentine W.N. в модификации Ланкина В.З. (1976) и глутатион^-трансферазы (G-tr) по методу Keen J.N., Iakoby W.B. (1978).
Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «StatSoft Statistica 7.0». Тип распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Полученные данные обрабатывали тестом ANOVA (при нормальном распределении данных) или Крускала-Уоллиса (при распределении данных, отличном от нормального). Межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Зависимость экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере от изучаемых биохимических показателей оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона (r). Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического±стандартное отклонение (M±SD) - при нормальном распределении данных, или в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - при распределении данных, отличном от нормального.
Результаты. Двухсторонняя перевязка общих сонных артерий приводила к активации продукции свободных радикалов и развитию окислительного стресса (таблица). Так, концентрация ТБК-реактивных продуктов повысилась через 30 минут ишемии на 76,9% (p<0,05), через 2 часа - на 135,2% (p<0,01), а через 4 часа - на 79,1% (p<0,05) по сравнению с показателями интактных животных.
Уровень SH-групп уменьшился через 30 минут, 2 часа и 4 часа после окклюзии на 30,6% (p<0,05), 42,9% (p<0,01) и 38,8% (p<0,01) соответственно по сравнению с показателями нормы.
После моделирования ишемии активность G-tr повысилась через 2 и 4 часа на 63,9% (p<0,01) и 56,4% (p<0,05) соответственно, активность G-per снизилась через 30 мин на 21,5% (p<0,05), через 4 часа - на 24,9% (p<0,05) по сравнению с уровнем нормы.
Таблица
Выраженность окислительного стресса в коре больших полушарий и экспрессия гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере
Серия эксперимента Изучаемый биохимический показатель Экспрессия Pgp в ГЭБ
ТБК-реактивные продукты, нмоль/мг белка SH-группы, мкмоль/мг белка Активность G-tr, нмоль ХДНБ/мг бел-ка*мин Активность G-per, нмоль НАДФН/мг белка*мин Относительная площадь ГЭБ, %
Интактные животные (п=6) 9,1 (7,7; 10,7) 4,9 (4,3; 5,3) 81,6±12,9 20,5 (18,6; 22,8) 1,58±1,04
Ишемия 30 минут (п=6) 16,1 (14,2; 17,3)* 3,4 (3,1; 3,6)* 105,6±16,6 16,1 (12,7; 19,3)* 2,19±0,83
Ишемия 2 часа (п=6) 21,4 (19,3; 24,1)** 2,8 (2,6; 3,3)** 133,8±38,5** 20,9 (19,2; 27,4) 2,56±1,29
Ишемия 4 часа (п=6) 16,3 (14,7; 16,8)* 3,0 (2,5; 3,2)** 127,6±13,7* 15,4 (14,3; 18,0)* 3,71±1,04**
Примечание: * - р<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных;
** - р<0,01 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных.
Установлено, что при перевязке сонных артерий экспрессия Pgp в гематоэнцефаличе-ском барьере постепенно увеличивается, возрастая к 4-му часу ишемии на 134,8% (р<0,01) (рис. 1, табл. 1.).
При проведении корреляционного анализа выявлена обратно- пропорциональная зависимость экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере от концентрации сульфгидрильных (БН) групп в ткани коры больших полушарий головного мозга крыс г=-0,612 (р=0,002) (рис. 2).
Рис. 1. Срезы коры больших полушарий головного мозга крыс, окрашенные иммуногистохимически. Увеличение 400 раз.
6,5
6,0 * 5,5
«£ 5,0
о о
& 3,5
§ 3,0
2,0 1,5
0 1 2 3 4 5 6 концентрация БИ-групп, мкмоль/мг белка
Рис. 2. Зависимость экспрессии гликопротеина-Р от концентрации БН-групп
Обсуждение результатов. В настоящей работе выявлено, что развитие острой тотальной ишемии головного мозга приводит к постепенному повышению экспрессии Pgp в ге-матоэнцефалическом барьере начиная с 30 минуты эксперимента и достигая достоверных различий к 4 часу наблюдения.
Полученные результаты согласуются с данными литературы. Ранее методом Western blotting установлено, что перманентная окклюзия средней мозговой артерии у крыс-самцов в течение 4 часов приводила к стимуляции экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере и нейронах головного мозга, а также росту функциональной активности данного белка-транспортера и снижению внутриклеточного содержания его субстратов (родамина-123, флюо-ресцеина натрия и нимодипина) [12]. В другом исследовании показано, что при моделировании 2-часовой ишемии головного мозга у крыс проницаемость гематоэнцефалического барьера существенно не изменялась через 2-3 часа от начала патологии, однако уже через 4 часа после ишемического воздействия экстравазация красителя была повышена на 179% по сравнению с серией интактных крыс [10].
Указанные изменения могут быть связаны с нарушением структуры и увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера, вызванными гипоксией [12, 13].
Видимо, усиливающаяся экспрессия Pgp в ранние сроки ишемии оказывает протекторное действие, сдерживая растущую проницаемость гематоэнцефалического барьера. Через 4 часа после ишемии повреждение гематоэнцефалического барьера оказывается настолько выраженным, что повышенной экспрессии Pgp оказывается недостаточно для эффлюкса проникающих субстратов.
Механизмы регуляции экспрессии Pgp в условиях гипоксии в настоящее время активно изучаются.
Считается, что важную роль в данном процессе играют транскрипционные факторы HIF-1a (Hypoxia-inducible factor 1) и Sp1 (Specificity protein 1), повышенный уровень которых усиливает синтез белка-транспортера [8].
В настоящем исследовании также показано, что двухсторонняя перевязка общих сонных артерий приводит к развитию окислительного стресса в коре больших полушарий, что проявляется повышением концентрации ТБК-реактивных продуктов (конечных продуктов перокси-дации), снижением уровня сульфгидрильных (SH-групп) и уменьшением активности антиокси-дантного фермента - глутатионпероксидазы. Активность другого антиоксидантного фермента глутатион^-трансферазы повышается, что, скорее всего, является компенсаторной реакцией.
При изучении зависимости экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере от показателей, характеризующих выраженность окислительного стресса в ткани мозга нами установлена обратнопропорциональная связь между экспрессией изучаемого белка-транспортера и концентрацией сульфгидрильных (SH) групп.
Глутатион, как основной источник SH-групп в клетке, играет важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-гомеостаза. Нарушение баланса между его окисленной и восстановленной формами может приводить к изменению экспрессии ряда транскрипционных факторов [1]. Таким образом, видимо, важную роль в механизмах экспрессии Pgp в условия острой ишемии головного мозга играет редокс-гомеостаз.
Выводы:
• Развитие острой ишемии головного мозга через 4 часа после двухсторонней окклюзии общих сонных артерий приводит к повышению экспрессии гликопротеина-Р в гематоэнце-фалическом барьере и развитию окислительного стресса в ткани коры больших полушарий головного мозга;
• Выявлена зависимость экспрессии гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере от концентрации SH-групп в ткани коры больших полушарий головного мозга крыс.
Работа поддержана грантом РФФИ 14-04-97522 р центра.
Литература
1. Калинина, Е. В. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах / Е. В. Калинина, Н. Н. Чернов, А. Н. Саприн // Успехи биологической химии. - Т. 48. - 2008. -
с. 319-358.
2. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины: руководство для врачей / Кукес В. Г. [и др.]. - М.: ГЭОТАР - Медиа. - 2008. - 304 с.
3. Якушева, Е. Н. Влияние экспериментальной подострой гипобарической гипоксической гипоксии на функциональную активность гликопротеина-P / Е. Н. Якушева, И. В. Черных // Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - № 1. - С. 60-64.
4. Половые различия функциональной активности и экспрессии гликопротеина-P у кроликов / Е.Н. Якушева [и др.] // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2014. - Т. 100. - № 8. -С. 944-952. .......
5. Activation of P-glycoprotein (Pgp)-mediated drug efflux by extracellular acidosis: in vivo imaging with (68)Ga-labelled PET tracer / O. Thews [et al.] // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. - 2010. - Vol. 37. - № 10. -
P. 1935-1942.
6. Animal models of acute moderate hypoxia are associated with a down-regulation of CYP1A1, 1A2, 2B4, 2C5, and 2C16 and up-regulation of CYP3A6 and P-glycoprotein in liver / C. Fradette [et al.] / / Drug Metab. Dispos. - 2007. - Vol. 35. - № 5. - P. 765-771.
7. Cell-Free Microfluidic Determination of P-glycoprotein Interactions with Substrates and Inhibitors / K. Eyer [et al.] // Pharm. Res. - 2014 [Epub ahead of print].
8. Hypoxia-inducible Factor-1-dependent Regulation of the Multidrug Resistance (MDR1) Gene / K.M. Comerford [et al.] // Cancer Res. - 2002. - Vol. 62. - P. 3387.
9. Influence of intermittent hypoxia on myocardial and hepatic P-glycoprotein expression in a rodent model / J.M. Dopp [et al.] // Pharmacotherapy. - 2009. - Vol. 29. - № 4. - P. 365-372.
10. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats / L. Belayev [et al.] // Brain Research. - 1996. - Vol. 739. - № 1-2. - P. 88-96.
11. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells / C. Lotz [et al.] // Oncol. Rep. - 2007. - Vol. 17. - № 1. - P. 239-244.
12. Alteration in P-glycoprotein at the blood-brain barrier in the early period of MCAO in rats / J. Cen [et al.] // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2013. - Vol. 65. - P. 665-672.
13. Penetration of verapamil across blood brain barrier follow in cerebral ischemia depending on both paracellular pathway and P-glycoprotein transportation / W. Fang [et al.] // Neurochem. Int. - 2013. -Vol. 62. - № 1. - P. 23-30.
14. A proposed role for efflux transporters in the pathogenesis of hydrocephalus / S. Krishnamurthy [et al.] // Croat Med. J. - 2014. - Vol. 55. - № 4. - P. 366-376.
15. Effect of hypoxia on acquired drug resistance and response to epidermal growth factor in Chinese hamster lung fibroblasts and human breast-cancer cells in vitro / R. Kalra [et al.] / / Int. J. Cancer. - 1993. -Vol. 54. - № 4. - P. 650-655.
P-GLYCOPROTEIN EXPRESSION IN BLOOD-BRAIN BARRIER IN BILATERAL OCCLUSION OF THE COMMON CAROTID ARTERY
Ryazan State Medical University
I.V. CHERNYKH E.N. YAKUSHEVA A.V. SHCHULKIN I.YU. VINOGRADOV D.S. TITOV
On 24 Wistar rats the impact of bilateral occlusion of the common carotid artery on the expression of P-glycoprotein (Pgp) in the blood-brain barrier of the frontal lobes of the cerebral hemispheres was studied. Pgp expression through immunohistochemical staining using monoclonal antibodies was evaluated. Moreover the correlation between expression of P-glycoprotein and the level of oxidative stress in brain tissue was assessed. The induction of Pgp expression was revealed in 4 hours alter start of the occlusion, which was inversely proportional to the concentration of SH-groups in the cerebral cortex tissue.
e-mail: enya.rzn@yandex.ru
Key words: P-glycoprotein, ABCBl-protein, ischemia, stroke, lipid peroxidation, common carotid artery.
