CC BY
61
УДК:616.22+616.321-006.6:577.152.344
экспрессия генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в тканях опухолей у больных раком гортани и гортаноглотки
Е.Б. малахова, и.в. кондакова, о.в. Неремисина, г.в. какурина, к.Ю. меньшиков
ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН, г. Томск 634050, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru
Проведено изучение экспрессии генов матриксных металлопротеиназ (ММП-2,-9,-14) и их тканевых ингибиторов (ТИМП-1,-2) в злокачественных новообразованиях гортани и гортаноглотки, а также связь этих показателей с клиникоморфологическими параметрами опухоли. Исследование экспрессии генов -2, -9, -14 и ТИМП-1, -2 проводили методом ПЦР в режиме реального времени. Установлена зависимость экспрессии генов ММП и ТИМП от размера первичного очага плоскоклеточного рака гортани и гортаноглотки. Зарегистрировано, что в процессе метастазирования наблюдается увеличение экспрессии ММП-2 и уменьшение экспрессии ингибитора ТИМП-2. Данные доказывают важную роль экспрессии генов ММП-2 и ТИМП-2 в развитии злокачественных новообразований.
Ключевые слова: рак гортани и гортаноглотки, матриксные металлопротеиназы, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ, экспрессия генов.
GENE EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASES AND THEIR TISSUE INHIBITORS IN TUMOR TISSUES OF PATIENTS WITH LARYNGEAL AND LARYNGOPHARYNGEAL CANCERS E.V Malakhova, I.V Kondakova, O.V Cheremisina, G.V Kakurina, K.Yu. Menshikov Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk 5, Kooperativny Street, 634050-Tomsk, Russia, e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru
The aim of the present study was to investigate the expression of matrix metalloproteinase genes (MMP-2,-9,-14) and their tissue inhibitors (TIMP-1,-2) as well as to estimate their correlation with clinical-morphological parameters of the tumor in patients with laryngeal and laryngopharyngeal cancers. Expression of genes -2, -9, -14 and TIMP-1, -2 was studied by real-time PCR method. Expression of MMP and TIMP genes was found to be dependent on the primary squamous cell laryngeal and laryngopharyngeal tumors. It was registered that the increase in MMP-2 and decrease in TIMP-2 inhibitor expressions were observed during the process of metastatic spread. The data obtained showed a significant role of MMP-2 and TIMP-2 gene expression in the development of cancer.
Key words: laryngeal and laryngopharyngeal cancers, matrix metalloproteinases, tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, gene expression.
Рак гортани и гортаноглотки занимает первое место среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя от 65 до 70 %. Заболеваемость раком гортани в последнее десятилетие имеет тенденцию к росту [6]. Метаста-зирование плоскоклеточных карцином гортани и гортаноглотки представляет серьезную проблему в связи с тем, что часто встречаются высокоагрессивные опухоли с метастазами при малых размерах новообразования.
Согласно современным представлениям о механизмах метастазирования, для инвазивного роста опухолевым клеткам необходимо преодолевать ба-
рьеры в виде базальных мембран, экстраклеточного матрикса и тканевых структур. Кроме деградации экстраклеточного матрикса, в метастазировании ключевую роль играют процессы разрушения адгезивных контактов и приобретение подвижности опухолевых клеток. Для этого малигнизированные клетки вырабатывают протеолитические ферменты. Матриксные металлопротеиназы (ММП), как принято считать, являются основными про-теолитическими ферментами, способствующими метастазированию раковых клеток [1, 4].
Установлено, что ММП не только разрушают основные белки экстраклеточного матрикса и
базальной мембраны, но и стимулируют миграцию злокачественных клеток, принимают участие в регуляции неоангиогенеза, обеспечивающего дополнительные пути эвакуации клеток первичной опухоли [5, 13], а также угнетают противоопухолевый иммунный надзор [14]. ММП-2 и ММП-9 способны гидролизовать основной структурный белок базальной мембраны - коллаген IV типа, поэтому в настоящее время эти ферменты стали рассматриваться в качестве факторов прогноза метастазирования [8]. ММП-14 является мембраносвязанным ферментом и принимает участие не только в деградации белков стромы, но и в расщеплении межклеточных контактов, а также в увеличении подвижности опухолевых клеток [15]. Каталитическая активность ММП может быть ограничена тканевыми ингибиторами металлопро-теаз (ТИМП), которые связываются с про-ММП и активными ММП стехиометрически, ингибируя, таким образом, как автокаталитическую активацию латентных форм ММП, так и активные ферменты. Взаимосвязь изменения экспрессии MMП на уровнях мРНК и белка с плохим клиническим прогнозом в различных типах рака широко обсуждается многими авторами. Показана прогностическая значимость определения ММП и ТИМП в сыворотке крови больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи [2]. У больных с раком гортани наблюдалась корреляция между экспрессией генов ММП-2 и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы [10]. В отношении экспрессии генов других ММП и ТИМП такие исследования не проводились. Раннее выявление метастазов и рецидивов злокачественного процесса является необходимым условием для адекватного выбора тактики лечения больных, улучшения его результатов и прогноза заболевания.
Целью исследования явилась оценка экспрессии генов матриксных металлопротеиназ (ММП-2,-9,-14) и их тканевых ингибиторов (ТИМП-1,-2) в злокачественных новообразованиях гортани и гор-таноглотки в связи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.
Материал и методы
В работе представлены результаты исследования 80 больных со злокачественными новообразованиями гортани и гортаноглотки (стадии T1_3N0_3M0), находившихся на обследовании и лечении в НИИ онкологии г. Томска. Во всех случаях опухоли
имели гистологическое строение плоскоклеточной карциномы разной степени дифференцировки. Все пациенты до настоящего исследования не получали никакого специального лечения. Забор материала для комплексного морфологического исследования с целью верификации диагноза, а также исследования экспрессии генов опухолеассоциированных протеаз и их ингибиторов проводился при фибро-ларингоскопии. Кроме того, у всех пациентов забирался образец неизмененной ткани, находящийся не далее чем в 2 см от опухоли.
Выделение РНК проводили гуанидин-фенольным методом (Chomczynski and Sacchi, 1987) [7]. Для анализа уровня экспрессии генов ММП-2,-9,-14 и ТИМП-1,-2 использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) с праймерами производства фирмы Sintol (Москва) (табл. 1). Для каждого исследуемого образца реакцию РВ-ПЦР проводили в трех повторах одновременно. Реакционная смесь при проведении ПЦР-реакции (суммарный объем 25 мкл) содержала дНТФ 2,5 мМ (2,5 мкл), 10хПЦР буферБ (2,5 мкл), Mg Cl2 25мМ (2,5 мкл), смесь праймеров 10 пкмоль/мкл (0,5_1,0мкл), флуоресцентный зонд 10 пкмоль/мкл (0,1_0,5), Tag ДНК-полимераза, 5 Е/мкл (0,2_0,5 мкл), образец ДНК (1-5 мкл), деионизированная вода до 25,0 мкл. Реакцию проводили на амплификаторе Rotor-gene 6000 (Австралия). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводили нормализацию продуктов амплификации исследуемых генов, был выбран ген «домашнего хозяйства» GAPDH.
Статистический анализ был проведен с использованием программы STATISTICA 6.0. (с использованием двухстороннего непараметрического теста Манна-Уитни). Наличие связи между изучаемыми признаками исследовали с использованием корреляционного анализа и оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R).
Результаты и обсуждение
При анализе полученных результатов было выявлено, что экспрессия генов ММП-2,-9,-14 и ТИМП-1,-2 определялась во всех исследуемых опухолевых образцах и в неизмененной ткани. Обнаружено, что уровень экспрессии исследуемых генов в опухолевой и прилежащей неизмененной ткани достоверно различался только для гена ММП-2 (табл. 2). Нужно отметить, что отсутствие
различия в экспрессии исследуемых генов в малиг-низированной и неизмененной ткани, по-видимому, может говорить об увеличении деструктивного потенциала не только опухоли, но и прилежащей к ней нормальной ткани, что может увеличивать инвазив-ность и метастататический потенциал опухоли, что согласуется с литературными данными [4].
Исследование экспрессии генов ММП и ТИМП в зависимости от размера первичной опухоли позволило выделить две группы показателей, которые имели сходные закономерности изменения параметров. Так, не было зарегистрировано
достоверных различий в экспрессии ММП-2, -14 и ТИМП-1 при увеличении Т-стадии процесса (рис. 1). В противоположность этому получена волнообразная зависимость экспрессии генов ММП-9 и ТИМП-2 от Т-стадии (рис. 2). При увеличении распространенности опухоли до Т2 наблюдалось значимое снижение экспрессии генов и возрастание этих параметров при Т3 по сравнению с опухолями Т Показана положительная корреляционная зависимость между размером опухоли и уровнем экспрессии гена мМп-14 (р=0,0009, R=0,39) и ТИМП-2 (р=0,001, R=0,6). В целом, полученные
Таблица 1
нуклеотидные последовательности для изучения экспрессии генов
ММП-2, -9, -14 и тИМП-1, -2
Объект Наименование 5-3 последовательность
ММП-2 Sense Ttc-ttc-aag-gac-cgg-ttc-att
AntiStnse Agt-cgg-att-tga-tgc-ttc-caa
ММП-9 Sense Gtc-ttg-tgg-agg-ctt-tga-g
AntiStnse Aga-cac-cag-tgc-ttt-ctg-ac
ММП-14 Sense Tgg-agg-aga-cac-cca-ctt-tga
AntiStnse Gcc-acc-agg-aag-atg-tca-ttt-c
ТИМП-1 Sense Ggc-ttc-acc-aag-acc-tac-a
AntiStnse Ttg-cag-ggg-atg-gat-aaa
ТИМП-2 Sense Tgg-act-ctg-gaa-acg-aca-t
AntiStnse Tct-cag-gcc-ctt-tga-aca-t
GAPDH Sense Ctc-aac-ggg-aag-ctc-act-gg
AntiStnse Agg-tca-gat-cca-caa-ccg-aca
ММП-2 probe (ROX) (ROX)ttt-gat-gcg-gta-tac-gag-gcc-cca-ca(BHQ2)
ММП-9 probe (FAM) (FAM)gt-gaa-cag-ggg-caa-acc-tta-(RTQ1)
ММП-14 probe (FAM) (FAM)tct-gcc-gag-cct-tgg-act-gtc-agg--(BHQ1)
ТИМП-1 probe (ROX) (ROX)gg-ctg-tga-gga-atg-cac-(BHQ2)
ТИМП-2 probe (FAM) (FAM)tg-gca-acc-cta-tca-aga-g-(RTQ1)
GAPDH probe (Cy5) (Cy5)tt-ccg-tgt-ccc-cac-ccc-caa--(BHQ2)
Таблица 2
Экспрессия генов ММП и ТИМП в опухолевой и неизмененной тканях
Объект исследования ММП-2 p=0,03 ММП-9 p>0,05 ММП-14 p>0,05 ТИМП-1 p>0,05 ТИМП-2 p>0,05
Опухолевая ткань 1,51 ± 0,17 n=45 1,66 ± 0,24 n=11 1,24 ± 0,12 n=65 1,28 ± 0,09 n=34 1,2 ± 0,25 n=23
Неизмененная ткань 0,94 ± 0,14 n=6 1,53 ± 0,22 n=4 1,33 ± 0,37 n=11 1,33 ± 0,43 n=8 1,09 ± 0,15 n=8
Примечание: р - значимость различий между опухолевой и неизмененной тканями.
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2012. №1 (49)
Рис. 1. Изменение экспрессии генов ММП-2, -14 и ТИМП-1 в зависимости от местной распространенности опухоли
Рис. 2. Изменение экспрессии генов ММП-9 и ТИМП-2 в зависимости от местной распространенности опухоли. Примечания: * - различия статистически значимы между группами больных с Т1 и Т2 (р<0,05);
** - различия статистически значимы между группами больных с Т2 и Т3 (р<0,05)
Рис. 3. Изменение экспрессии генов в зависимости от выраженности лимфогенного метастазирования. Примечания: * - различия статистически значимы по сравнению с группой больных без лимфогенных метастазов (р<0,05)
данные свидетельствуют о зависимости исследуемых показателей от местной распространенности опухоли.
В норме существует баланс продукции протеаз и их ингибиторов. Анализ связи экспрессии генов ММП и ТИМП с метастазированием показал, что при наличии местных метастазов наблюдалось увеличение экспрессии гена ММП-2, тенденция к увеличению экспрессии генов других протеаз и снижение экспрессии гена ТИМП-2 (рис. 3). Снижение продукции эндогенных ингибиторов
может приводить к активации локальных протео-литических процессов, способствующих инвазии и метастазированию злокачественных клеток. Таким образом, при низком уровне экспрессии гена ТИМП-2 увеличивается вероятность метастазирования. Ранее иммуногистохимическим методом нами было показано достоверное снижение уровня экспрессии ТИМП-2 в опухолевых клетках при наличии метастазов в регионарные лимфатические узлы [3]. Связь ТИМП-2 с метастазированием при раке гортани подтверждается и в работе
W. Pietruzewska et al. [12], в которой показана связь экспрессии ингибитора с лимфогенным метастазированием и безметастатической выживаемостью, и в исследовании A. Katayama et al. [9], которые выявили повышение экспрессии ММП-9 и ТИМП-2 при лимфогенном и отдаленном мета-стазировании плоскоклеточных карцином головы и шеи. Полученные результаты и литературные данные позволяют рассматривать ТИМП-2 в качестве потенциального прогностического маркера лимфогенного метастазирования при раке гортани и гортаноглотки.
При анализе взаимосвязей экспрессии генов ММП и ТИМП выявлено, что у больных раком гортани и гортаноглотки уровень ММП-14 ассоциировался с содержанием ТИМП-2 (р=0,019, R=0,47). Возможно, активация в опухоли экспрессии гена ММП-14 и ТИМП-2 необходима для увеличения синтеза белков ТИМП-2 и ММП-14, которые участвуют в регуляции активности ММП-2, формируя тройной комплекс с про-MMП-2 на поверхности клеток [9]. Известно, что ММП-2 специфически активна в отношении коллагена IV, ключевого структурного компонента базальных мембран [8]. Кроме того, корреляционный анализ показал положительную взаимосвязь экспрессии гена ММП-2 и ТИМП-1 (р=0,05). Известно, что THM^! может непосредственно прикрепляться к поверхности опухолевых клеток и работать в качестве лиганда аналогично цитокинам и факторам роста, что может обусловливать рост опухоли. Полученные данные свидетельствуют о сложной регуляции ММП в злокачественных опухолях гортани и гортаноглотки. По-видимому, ТИМП не только ингибируют каталитическую активность протеиназ, но и регулируют их экспрессию.
Заключение
В проведенном исследовании выявлена зависимость экспрессии генов ММП и ТИМП от размера первичного очага плоскоклеточного рака гортани и гортаноглотки. Зарегистрировано, что в процессе метастазирования наблюдается увеличение экспрессии ММП-2 и уменьшение экспрессии ингибитора ТИМП-2. Данные доказывают важную роль экспрессии генов ММП-2 и ТИМП-2 в развитии злокачественных новообразований. Перспективы исследований матриксных металлопротеиназ связаны с изучением взаимодействий ферментов этой группы внутри сложных протеолитических
каскадов. В последнее время для обозначения таких каскадов часто используется термин «протеазная паутина» (protease web) [11]. Предполагается, что понимание взаимосвязей внутри таких систем позволит более эффективно конструировать противоопухолевые препараты, мишенями которых являются MMH Кроме того, дальнейшее изучение ММП и ТИМП может стать основой для разработки дополнительных критериев прогноза развития онкологических заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ганусевич И.И. Роль матриксных металлопротеаз (ММП) при злокачественных новообразованиях // Онкология. 2010. Т. 12, № 1. С. 10-16.
2. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л. и др. Прогностическая значимость определения металлопротеаз и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи // Онкохирургия. 2011. Т. 3, № 1. С. 20-25.
3. Кондакова И.В., Клишо Е.В., Савенкова О.В. и др. Тканевая регуляция экспрессии матриксных металлопротеиназ в плоскоклеточных карциномах головы и шеи // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2010. Т. 21, № 3. С. 36-41.
4. Кондакова И.В., Клишо Е.В., Савенкова О.В. и др. Патогенетическая значимость системы матриксных металлопротеаз при плоскоклеточном раке головы и шеи // Сибирский онкологический журнал. 2011. № 1 (43). С. 29-33.
5. Спирина Л.В., Кондакова И.В., Клишо Е.В. и др. Металлопротеазы как регуляторы неоангиогенеза в злокачественных новообразованиях // Сибирский онкологический журнал. 2007. № 1 (21). С.67-71.
6. Чойнзонов Е.Л., Мухамедов М.Р., Балацкая Л.Н. Рак гортани. Современные аспекты лечения. Томск, 2006. 280 с.
7. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. Vol. 162 (1). Р 156-169.
8. Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis // Front Biosci. 2006. Vol. 11. P 479-491.
9. Katayama A., Bandoh N., Kishibe K. et al. Expressions of Matrix Metalloproteinases in Early-Stage Oral Squamous Cell Carcinoma as Predictive Indicators for Tumor Metastases and Prognosis // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10. P 634-640.
10. Krecicki T., Zalesska-KrecickaM., JelenM. et al. Expression of type IV collagen and matrix metalloproteinase-2 (type IV collagenase) in relation to nodal status in laryngeal cancer // Clin. Otolaryngol. 2001. Vol. 26. P. 469-472.
11. Overall С.М., Dean R.A. Degradomics: Systems biology of the protease web. Pleiotropic roles of MMPs in cancer // Cancer Metastasis Rev. Vol. 25 (1). P. 69-75.
12. Pietruzewska W., Kobos J., GryczynskiM., Bojanowska-Pozniak K. Analysis of TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 expression as a prognostic factor of laringeal cancer progression // Otolaringol. Pol. 2008. Vol. 62. P. 380-387.
13. Rundhaug J.E. Matrix metalloproteinases and angiogenesis // J. Cell Mol. 2005. Vol. 9. P. 267-285.
14. Wang B.Q., Zhang CM., Gao W. et al. Cancer-derivved matrix metalloproteinase-9 contributes to tumor tolerance // Cancer Res. Clin. Oncol. 2011. Vol. 137 (10). P 1525-1533.
15. ZarrabiK., Dufour A., Kuscu C. et al. Inhibiton of matrix metal-loproteinase 14 (MMP-14)-mediated cancer cell migration // Biol. Chem. 2011. Vol. 286 (38). P. 33167-33177.
Поступила 8.10.11
