CC BY
68
Е.В. Четина, К.А. Маслова, Н.В. Демин, М.Ю. Крылов, В.А. Мякоткин
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ ОСТЕОБЛАСТОВ, И MAMMALIAN TARGET OF RAPAMYCIN (mTOR) В КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТЕОПОРОЗОМ
Контакты: Елена Васильевна Четина [email protected]
Цель — исследовать взаимосвязь минеральной плотности костной ткани (МПКТ) с экспрессией генов, ассоциированных с пролиферацией, выживанием и дифференцировкой клеток кости в периферической крови женщин в постменопаузальном периоде, больных остеопорозом (ОП).
Материал и методы. Обследованы 28 женщин в постменопаузе, больных ОП, и 17 сравнимых по возрасту здоровых женщин. МПКТ измеряли с помощью рентгеновской абсорбциометрии. Активность щелочной фосфатазы, содержание кальция и фосфора в крови определяли стандартными методами. РНК выделяли из периферической крови и использовали для определения уровня экспрессии генов в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Результаты. У больных ОП женщин в постменопаузальном периоде наблюдалось значительное повышение экспрессии ATG1 (се-рин-треонин киназы, ответственной за формирование аутофагальных вакуолей) по сравнению со здоровым контролем, что свидетельствует о развитии аутофагии в клетках крови этих больных. Это сопровождалось значительным снижением экспрессии гена mTOR (мишени рапамицина у млекопитающих), регулятора белкового синтеза и пролиферации клеток, а также генов, ассоциированных с дифференцировкой остеобластов: трансформирующего фактора роста f1 (ТФР f1), Runx 2 (относящегося к Runt-семейству транскрипционного фактора 2) и общей щелочной фосфатазы (ОЩФ), провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли а (ФНО а) и интерлейкина 1f (ИЛ 1 в). Экспрессия генов mTOR, ТФР f1, Runx2 и ИЛ 1f положительно коррелировала с МПКТ отдельных областей бедра. Напротив, экспрессия ATG1 и ОЩФ отрицательно коррелировала с МПКТ этой области и положительно — с МПКТ позвоночника. Хотя экспрессия исследованных генов не коррелировала с уровнем фосфора и кальция в сыворотке, экспрессия TФРpl была положительно связана с активностью ОЩФ у женщин в постменопаузе с ОП.
Заключение. Потеря костной массы у больных ОП в постменопаузе сопровождается значительным увеличением экспрессии маркера аутофагии ATG1 и снижением экспрессии mTOR, что может указывать на ингибирование биосинтеза белка и пролиферации клеток, а также подавлением экспрессии генов, ассоциируемых с дифференцировкой остеобластов и провоспалитель-ных цитокинов ФНО а и ИЛ 1f. Полученные данные по экспрессии генов могут быть использованы для поиска новых маркеров заболевания, тестируемых в периферической крови.
Ключевые слова: остеопороз, минеральная плотность костной ткани, аутофагия, mTOR, экспрессия генов, дифференцировка остеобластов
THE EXPRESSION OF GENES ASSOCIATED WITH OSTEOBLAST DIFFERENTIATION AND THE MAMMALIAN TARGET OF RAPAMYCIN (mTOR) IN THE BLOOD OF PATIENTS WITH OSTEOPOROSIS E.V. Chetina, K.A. Maslova, N.V. Demin, M.Yu. Krylov, V.A. Myakotkin
Research Institute of Rheumatology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Contact: Elena Vasilyevna Chetina [email protected]
Objective: to study an association of bone mineral density (BMD) with the expression of genes associated with the proliferation, survival, and differentiation of osteocytes in the peripheral blood of postmenopausal women with osteoporosis (OP).
Subjects and methods. Twenty-eight postmenopausal women with OP and 17 age-matched healthy women were examined. BMD was measured by X-ray absorptionmetry. Alkaline phosphatase activity and calcium and phosphorus levels in the blood were determined by conventional methods. RNA was isolated from the peripheral blood and used to estimate the gene expression, by using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results. The postmenopausal women with OP were observed to have a significant increase in the expression of ATG1 (serine-threonine kinase that is responsible for the generation of autophagic vacuoles) as compared to the healthy controls, which suggests that autophagy develops in the blood cells of these patients. This was attended by a considerable reduction in the expression of the mTOR (the mammalian target of rapamycin) gene, a regulator of protein synthesis and cell proliferation, and in that of the genes associated with the differentiation of osteoblasts: transforming growth factor f1 (TGF-f1), Runx 2 (Runt-related transcription factor 2) and total alkaline phosphatase (TAP), and the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor-a (TNF-a) and interleukin 1f (IL-1f). The expression of mTOR, TGF-f1, Runx2, and IL-1f genes was positively correlated with BMD in individual areas of the hip. On the contrary, that of ATG1 and TAP was correlated negatively with BMD in this area and positively with that in the spine. Although the expression of the genes in question was not correlated with the serum levels of phosphorus and calcium, that of TGF-f1 was positively related to TAP activity in postmenopausal women with OP.
Conclusion. In postmenopausal women with OP, bone loss is accompanied by a significant increase in the expression of the autophagy marker ATG1 and by a reduction in that of mTOR, which may be indicative of the inhibition of protein biosynthesis and cell proliferation and the suppression of the expression of the genes associated with the differentiation of osteoblasts and the proinflammatory cytokines TNF-a and IL-1f. The obtained data on gene expression may be used to search for new disease markers tested in peripheral blood.
Key words: osteoporosis, bone mineral density, autophagy, mTOR, gene expression, osteoblast differentiation
Остеопороз (ОП) представляет собой заболевание, которое характеризуется низкой плотностью костной ткани, невысоким ее качеством, а также большой частотой переломов. Переломы, ассоциированные с ОП, становятся главной проблемой пожилых людей в связи с осложнениями, которые часто приводят к смерти пациентов старше 50 лет [1]. Устойчивость кости к переломам определяется массой кости, составом костного матрикса и его механическими свойствами. Большой вклад в прочность кости вносит ее минеральная плотность (МПКТ) [2]. В настоящее время не ясны молекулярные механизмы, лежащие в основе развития ОП. Однако недавно было сделано предположение, что они могут включать изменения в дифференцировке и функционировании остеобластов и остеокластов [3].
Фенотипические изменения в клетках костной ткани, ассоциированные с их дифференцировкой, включают экспрессию специфических генов и соответствующих им белков. При этом изменения экспрессии генов, связанные с дифференцировкой остеобластов, имеют три главные стадии: пролиферацию, развитие внеклеточного матрикса и минерализацию [4, 5]. Изначально активно пролиферирующие клетки экспрессируют гены, регулирующие клеточный цикл и рост клеток. К ним относится Яыпх2 (относящийся к Яип^семейству транскрипционный фактор 2) остеобластов, который также контролирует экспрессию главных белков костного матрикса [6]. Созревание остеобластов связано с формированием костного матрикса в виде регулярно и плотно упакованных фибрилл коллагена и высокой степенью минерализации. На этом этапе механические свойства и состав костного матрикса регулируются трансформирующим фактором роста |31 (ТФР |31) [7, 8]. В дальнейшем снижение пролиферативной активности сопровождается усилением экспрессии ингибитора циклин-зави-симых киназ р21 (CIP1/WAF1) (р21) и щелочной фосфатазы [9].
Поскольку дифференцировка остеобластов связана с синтезом различных белков, она может включать активацию сигнальных путей тТОЯ (мишени для рапамицина у млекопитающих). тТОЯ считается эволюционно консервативным центральным координатором фундаментальных биологических процессов, включающих продвижение по клеточному циклу, контроль трансляции и транскрипции, биогенез рибосом и аутофагию [10]. Недавно показано, что активация сигнального пути тТОЯ ассоциируется с повышением экспрессии Яыпх2 и ТФР в в пре-остеобластах [11, 12]. Напротив, подавление тТОЯ рапамицином ингибировало пролиферацию и дифферен-цировку остеобластов, что сопровождалось значительным снижением экспрессии специфичных для костной ткани генов — Яыпх2, остеокальцина, костного сиалопро-теина и остериска, а также активности щелочной фосфа-тазы и способности к минерализации [11, 13]. Кроме того, подавление тТОЯ также сопровождалось развитием аутофагии у многих типов клеток [14, 15]. Аутофагия является физиологическим механизмом в клетках, посредством которого происходит деградация и рециклирование белков для поддержания адекватного уровня аминокислот с целью выживания при неблагоприятных условиях [16—19]. Она включает формирование в цитоплазме везикул, окруженных двойной мембраной, аутофагосом, что сопровождается увеличением экспрессии генов АТО 1—15
[20]. В дальнейшем в условиях гипераутофагии может происходить опосредуемая каспазами смерть клеток в результате апоптоза [21].
Усиление резорбции костной ткани при ОП связано с повышенным рекрутированием резорбирующих остеокластов. Регуляция трансляции белка посредством тТОЯ может также контролировать продолжительность жизни остеокластов, их резорбирующую активность и, таким образом, способна влиять на процессы обмена в костной ткани, поскольку три цитокина, ответственных за дифференцировку и функционирование остеокластов: фактор некроза опухоли а (ФНО а), ЯЛМКЬ (лиганд рецептора активации ядерного фактора каппа В) и макрофагальный колониестимулирующий фактор (МКСФ) — могут активировать тТОЯ как общую мишень [22].
Остеокласты могут происходить из циркулирующих моноцитов, содержащих значительное число Т-лимфоци-тов [23, 24]. Изменения в распределении СБ4+ и СБ8+ подгрупп Т-лимфоцитов у женщин, больных ОП, по сравнению со здоровыми свидетельствуют о том, что Т-лимфоциты могут участвовать в процессах, способствующих потере костной ткани в постменопаузальный период [25]. Это также подтверждается отсутствием резорбции костной ткани, индуцированной удалением яичников у пи/пи (лысых) мышей, лишенных Т-лимфоцитов [26]. Кроме того, значение В-лимфоцитов в этиологии ОП было недавно отмечено при общем геномном исследовании по экспрессии генов в выборке США [27]. Поэтому мы предположили, что специфические изменения в экспрессии генов, участвующих в процессах пролиферации и дифференцировки клеток, а также их выживания, измеренные в периферической крови, могут отражать процессы, происходящие в костной ткани у больных ОП в постменопаузе.
Целью настоящего исследования было изучить взаимосвязь МПКТ с экспрессией генов, ассоциированных с пролиферацией, выживанием и дифференцировкой клеток кости в крови женщин в постменопаузальном периоде, больных ОП.
Материал и методы
Пациенты. В исследование были включены 28 женщин в период постменопаузы, которые лечились в поликлинике НИИР РАМН с ноября 2006 г. по март 2007 г. по поводу ОП. Средний возраст больных составил 66,1±7,2 года (53—76 лет). Пациентки, имевшие заболевания, которые вызывают нарушения костного метаболизма, в том числе диабет, ревматоидный артрит, эндокринологические расстройства, были исключены. Контрольную группу составили 17 здоровых женщин в постменопаузе, средний возраст 61,0+12,2 года (49—78 лет), не имевшие остеоартроза и не принимавшие лекарства, которые могли повлиять на метаболизм костной ткани. Исследовательский протокол был одобрен локальным этическим комитетом, информированное согласие было получено у всех участников исследования.
Инструментальные методы обследования. Измерения МПКТ позвоночника (Ь-Ь^) и проксимального отдела бедра проводили с помощью рентгеновской абсорбцио-метрии на приборе QDR-4500w (Нок^с, США) в НИИР РАМН. Диагноз ОП основывался на рекомендациях ВОЗ [28]: Т-критерий <-2,5 SD (табл. 1).
Таблица 1
Средние значения МПКТ (М + SD) у больных ОП и здоровых доноров
Зона Доноры ^критерий Больные ОП ^критерий р
Позвоночник (Ь-Ьу) 1,052+0,06 0,064+0,62 0,712+0,06 -3,07+0,60 <0,001
Шейка бедра 0,857+0,06 0,064+0,59 0,584+0,08 -2,407+0,71 <0,001
Большой вертел 0,765+0,11 0,633+1,08 0,531+0,07 -1,703+0,74 <0,001
Межвертельная область 1,163+0,10 0,525+0,70 0,830+0,16 -1,696+1,05 <0,001
Треугольник Варда 0,727+0,10 -0,042+0,91 0,378+0,07 -2,839+1,24 <0,001
Бедренная кость (общая) 1,156+0,12 0,533+0,70 0,700+0,11 -1,853+1,11 <0,001
Биохимические маркеры обмена костной ткани. Образцы сыворотки собирали утром после 8-часового периода голодания. Сывороточные концентрации кальция (ммоль/л), фосфора (ммоль/л) и активность щелочной фосфатазы (ед/л) измеряли, используя стандартные фотометрические тесты в соответствии с рекомендациями производителя (DiaSys Diagnostic systems GmbH&Co, Германия).
Фракционирование клеток крови. Фракционирование клеток периферической крови проводили в градиенте плотности верографина-фикола по стандартной методике. В результате были получены фракции периферических мо-нонуклеарных клеток (МКПК), тромбоцитов и гранулоци-тов. Эритроциты лизировали в присутствии NH4CI в буфере, содержащем Трис-НС1, pH=7,2 [29].
Выделение общей РНК и обратная транскрипция (ОТ). Для исследований экспрессии генов общую РНК выделяли из цельной крови сразу после взятия крови, из сыворотки и изолированных клеточных элементов крови с помощью набора Ribo-zol-A («Хеликон», Россия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Реакцию ОТ проводили, используя набор Reverta («Хеликон», Россия) в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Использовали готовые праймеры и зонды по методу TaqMan (Applied Biosystems Int.,
США): mTOR (Hs00234522_m1), ТФР f1
(Hs99999918_m1), Runx2 (Hs00231692_m1), общую щелочную фосфатазу (ОЩФ) (Hs00758162_m1), ATG1 (Hs00177504_m1), ФНО a (Hs00174128_m1) и интерлейкин 1 (ИЛ 1f) (Hs00174097_m1). f-Актин служил геном домашнего хозяйства.
Количественную оценку уровней мРНК проводили на приборе 7300 (Applied Biosystems Int., США), как описано ранее [30].
Статистический анализ. Данные количественных экспериментов представлены как среднее арифметическое ± стандартное отклонение. Анализы проводили в трех повторностях. Для статистической обработки результатов использовали непараметрический тест Манна—Уитни. Различия считали достоверными при р<0,05.
Результаты
Экспрессия генов в периферической крови. В образцах периферической крови 28 больных ОП и 17 здоровых женщин измеряли экспрессию генов, связанных с пролиферацией клеток (mTOR) и их жизнеспособностью (ATG1). Кроме того, в тех же образцах измеряли экспрессию генов обмена костной ткани TФР f1, Runx2, ОЩФ и цитокинов ФНО а и ИЛ 1f (рис. 1). Данные исследования выявили значительно более низкие уровни экспрессии mTOR (среднее 0,34±0,02), TФР f1 (среднее 0,29±0,03), Runx2 (сред-
Рис. 1. Анализ экспрессии генов тТОЯ (тТ), АТО1 (А&, ТФР в1 (Т1), Яыпх2 (Я2), ОЩФ, ФНО а и ИЛ 1в в периферической крови больных ОП по отношению к здоровым донорам (С) посредством ПЦР-РВ.
Для всех генов различия со здоровыми донорами статистически достоверны
Рис. 2. Соотношение уровня экспрессии генов тТОЯ (р=0,02) и АТО1 (р=0,04) во фракции МКПК и гранулоцитах (ГЦ). Нефракционированную периферическую кровь использовали в качестве контроля экспрессии генов
нее 0,21+0,03) и ОЩФ (среднее 0,55+0,04), ФНО а (среднее 0,70+0,09), ИЛ 1в (среднее 0,64+0,23) у больных ОП по сравнению со здоровыми женщинами (р<0,001). Напротив, экспрессия ЛТ01 у больных ОП (среднее 2,02+0,27) была значительно повышена по сравнению с контролем (р=0,04).
Экспрессия исследуемых генов в периферической крови, обусловленная активностью МКПК. Анализ экспрессии исследуемых генов в различных фракциях крови пациентов показал полное отсутствие экспрессии в сыворотке крови, а также в безъядерных клетках — эритроцитах и тромбоцитах. За экспрессию исследуемых генов в образце цельной крови ответственны преимущественно МКПК (рис. 2), поскольку в этих клетках она была значительно более высокой по сравнению с фракцией грануло-цитов. Уровень экспрессии исследуемых генов в МКПК превышал таковой в образце цельной крови вследствие активации клеток, происходящей в процессе фракционирования, что также отмечалось ранее в исследованиях других авторов [31].
Ассоциация экспрессии генов с МПКТ. Анализ бива-риантных корреляций между экспрессией генов, исследуемых в данной работе, и МПКТ показал, что экспрессия тТОЯ положительно коррелировала с МПКТ в области большого вертела, тогда как экспрессия ТФР /31, Яипх2 и ИЛ 1в коррелировала с МПКТ не только в этой зоне, но и в ряде других областей бедра (табл. 2; рис. 3). Напротив, экспрессия ЛТ01 и ОЩФ отрицательно коррелировала с МПКТ ряда отделов бедра. Экспрессия ОЩФ положительно коррелировала с МПКТ позвоночника.
Ассоциация экспрессии генов с биохимическими маркерами метаболизма кости. Только экспрессия ТФР в1 положительно коррелировала с активностью щелочной фосфатазы (г=0,46; р=0,017). Бивариантные корреляции экспрессии других генов с маркерами сыворотки не достигли уровня статистической значимости (данные не приводятся).
Обсуждение. Т- и В-лимфоциты являются ключевыми регуляторами формирования, продолжительности жизни и активности остеокластов и остеобластов. Кроме того, иммунные клетки связаны с этиологией постменопаузального и сенильного ОП [25, 32]. Поэтому в нашем исследовании мы использовали периферическую кровь больных ОП в постменопаузе и соответствующего по возрасту здорового контроля для исследования изменения
экспрессии генов, относящихся к клеточной дифферен-цировке и метаболизму костной ткани.
Мы показали, что потеря костной массы сопровождается значительным снижением экспрессии генов, ассоциированных с дифференцировкой остеобластов, — TФР f1, Runx2 и ОЩФ — в периферической крови больных ОП по сравнению со здоровыми донорами. Снижение экспрессии этих генов в связи с резорбцией кости ранее наблюдали в костной ткани. Так, более низкая экспрессия ОЩФ была отмечена у больных ОП по сравнению со здоровыми людьми в выборке из Венгрии [33]. Кроме того, исследования на животных показали ингибирование экспрессии TФР f1 в костной ткани в связи с уменьшением МПКТ при недостатке эстрогенов [34, 35], а снижение экспрессии Runx2 с последующей резорбцией кости наблюдали при кормлении грызунов розиглитазоном — агентом, резорбирующим кость [36]. Поэтому наблюдаемое нами снижение экспрессии TФР f1, Runx2 и ОЩФ в периферической крови больных ОП может указывать на координацию экспрессии генов костного метаболизма в крови и костной ткани.
Наше предположение также подтверждается положительной корреляцией экспрессии генов в периферической крови с МПКТ ряда отделов бедра и позвоночника у исследуемых больных ОП.
Многие заболевания человека возникают, когда нарушается соотношение регуляции роста клеток (отношение клеточной массы к размеру) и их пролиферации (скорость клеточного деления) [37]. Резорбция кости также связана с фенотипическими изменениями клеток, она включает экспрессию специфических генов и синтез соответствующих белков. Поэтому при развитии ОП могут происходить нарушения сигнального пути mTOR — главного регулятора роста и пролиферации клеток [10]. Действительно, наши исследования показали значительное снижение экспрессии mTOR в крови больных ОП. Положительная корреляция экспрессии mTOR с МПКТ в области большого вертела также подтверждает его участие в резорбции кости при ОП. Это предположение подтверждается результатами исследований на животных, которые свидетельствуют о повышении активности сигнального пути mTOR при усилении костеобразования у крыс [38]. Напротив, длительное назначение животным ингибитора mTOR — FK506 — приводило к развитию ОП [39, 40]. Это сопровождалось подавлением экспрессии Runx2 [41]. На-
Таблица 2
Коэффициенты корреляции Спирмена между экспрессией генов и МПКТ у больных ОП
Отделы/гены Относительная экспрессия генов
mTOR 1ФР pi Runx2 ОЩФ ATG1 ил ip
Позвоночник 0,311 (р=0,001)
Шейка бедра 0,281 (р=0,005) 0,273 (р=0,015) -0,473 (р<0,001)
Большой вертел 0,206 (р=0,030) 0,276 (р=0,004) 0,510 (р<0,001) 0,268 (р=0,020)
Межвертельная область 0,331 (р<0,001) 0,307 (р=0,004) 0,304 (р=0,012)
Треугольник Варда 0,355 (р=0,001) -0,295 (р=0,002) -0,231 (р=0,037)
Бедренная кость 0,255 (р=0,009) 0,354 (р=0,001) 0,275 (р=0,023)
Примечание. Представлены только статистически значимые результаты
Рис. 3. Анализ линейной регрессии экспрессии генов тТОЯ (а) и ЛТ01 (б) по отношению к в-актину в периферической крови больных ОП и значения их МПКТ в области большого вертела (а) и треугольника Варда (б)
конец, использование БК506 при иммуносупрессорной терапии людей сопровождалось тяжелой потерей костной ткани и переломами у 65% пациентов [42, 43].
Подавление экспрессии тТОЯ в периферической крови больных ОП в наших исследованиях сопровождалось также значительным повышением экспрессии гена ЛТ01. Об активации экспрессии генов, ассоциированных с аутофагией, при ОП до сих пор не сообщалось. Ау-тофагия связана с повышением жизнеспособности многих типов клеток [44]. Наши данные о повышении экспрессии генов аутофагии в крови больных ОП позволяют предположить вклад аутофагии в увеличение срока жизни остеокластов при ОП. Действительно, в опытах на животных наблюдали увеличение длительности жизни остеокластов, которое сопровождалось быстрой потерей костной ткани при индукции ОП глюкокортикои-дами [45].
Заключение
Наши исследования показали, что развитие постменопаузального ОП сопровождается значительными мета-
болическими нарушениями не только в костной ткани, но и в клетках периферической крови. В данной статье мы впервые сообщаем о том, что в клетках крови больных ОП происходит значительное увеличение экспрессии гена АТО1, ответственного за их жизнеспособность. Это сопровождается значительным уменьшением экспрессии генов тТОЯ, ТФР в1 и Яыпх2, связанных с биосинтезом белка и активностью костного метаболизма. Положительная корреляция экспрессии этих генов с МПКТ позволяет предположить, что экспрессия этих генов в костной ткани больных ОП может изменяться аналогичным образом. Полученные данные по экспрессии генов больных ОП в периферической крови являются дополнением существующих знаний о механизмах развития ОП. Они могут быть использованы для разработки новых методов предотвращения потери костной ткани, а также для ранней диагностики ОП.
Работа осуществлена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 09-04-01158-а)
ЛИТЕРАТУРА
1. Colon-Emeric C.S., Saag K.G. Osteoporotic fractures in older adults. Best Pract Res Clin Rheumatol 2006;20:695-706.
2. Currey J.D. What determines the bending strength of compact bone? J Exp Biol 1999;202(Pt 18):2495-503.
3. Hopwood B., Tsykin A., Findlay D.M., Fazzalari N.L. Gene expression profile of the bone microenvironment in human fragility fracture bone. Bone 2009;44:87-101.
4. Stein G.S., Lian J.B., Owen T.A. Relationship of cell growth to the regulation of tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation. FASEB J 1990;4:3111-23.
5. Balint E., Lapointe D., Drissi H. et al. Phenotype discovery by gene expression profiling: mapping of biological processes linked to BMP-2-mediated osteoblast differentiation. J Cell Biochem 2003;89:401-26.
6. Komori T. Regulation of bone development and maintenance by Runx2. Front Biosci 2008;13:898-903.
7. Alliston T. TGF-p regulation of osteoblast differentiation and bone properties. J Musculoskelet Neuronal Interact 2006;6:З49-50.
8. Stabellini G., Vertemati M., Locci P. et al. In vitro human osteoblast and extracellular matrix changes after transforming growth factor beta 1 treatment. Pathology 2005;З7:З47-54.
9. Matsumoto T., Sowa Y., Ohtani-Fujita N. et al. p53-independent induction of WAF1/Cip1 is correlated with osteoblastic differentiation by vitamin D3. Cancer Lett 1998;129:61-8.
10. Fingar D.C., Blenis J. Target of rapamycin (TOR): an integrator of nutrient and growth factor signals and coordinator of
cell growth and cell cycle progression. Oncogene 2004;23:3151-71.
11. Singha U.K., Jiang Y., Yu S. et al. Rapamycin inhibits osteoblast proliferation and differentiation in MC3T3-E1 cells and primary mouse bone marrow stromal cells.
J Cell Biochem 2008;103:434-46.
12. Patterson T.E., Sakai Y., Grabiner M.D. et al. Exposure of murine cells to pulsed electromagnetic fields rapidly activates the mTOR signaling pathway. Bioelectromagnetics 2006;27:535-44.
13. Tang C.H., Lu D.Y., Tan T.W. et al. Ultrasound induces hypoxia-inducible factor-1 activation and inducible nitric-oxide synthase expression through the integrin/integrin-linked kinase/Akt/mammalian target of rapamycin pathway in osteoblasts. J Biol Chem 2007;282:25406-15.
14. Longo L., Platini F., Scardino A. et al. Autophagy inhibition enhances antho-cyanin-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther 2008;7:2476-85.
15. Goswami S.K., Das D.K. Autophagy in the myocardium: Dying for survival? Exp Clin Cardol 2006;11:183-8.
16. Lleo A., Invernizzi P., Selmi C. et al. Autophagy: Highlighting a novel player in the autoimmunity scenario. J Autoimmun 2007;29:61-8.
17. Proud S.G. Regulation of mammalian translation factors by nutrients. Eur J Biochem 2002;269:5338-49.
18. Starkman B.G., Cravero J.D.,
DelCarlo M. et al. IGF-1 stimulation of proteoglycan synthesis by chondrocytes requires activation of the PI 3-kinase pathway but not ERK MAPK. Biochem J 2005;389:723-9.
19. Kimura N., Tokunaga C., Dalai S. et al. A possible linkage between AMP-activated protein (AMPK) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway.
Genes Cells 2003;8:65-79.
20. Lum J.J., DeBerardinis R.J.,
Thompson C.B. Autophagy in metazoans: cell survival in the land of plenty. Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6:439-48.
21. Bell B.D., Leverrier S., Weist B.M. et al. FADD and caspase-8 control the outcome of autophagic signaling in proliferating T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:16677-82.
22. Glantschnig H., Fisher J.E.,
Wesolowski G. et al. M-CSF, TNF а and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell Death Differ 2003;10:1165-77.
23. Matayoshi A., Brown C., DePersio J.F. et al. Human blood-mobilized hematopoietic precursors differentiate into osteoclasts in the absence of stromal cells. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:10785-90.
24. Colucci S., Brunetti G., Rizzi R. et al.
T cells support osteoclastogenesis in an in
vitro model derived from human multiple myeloma bone disease: the role of the OPG/TRAIL interaction. Blood 2004;104:3722-30.
25. Teitelbaum S.L. Postmenopausal osteoporosis, T cells, and immune dysfunction. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:16711-2.
26. Cenci S., Weitzmann M.N., Roggia C. et al. Estrogen deficiency induces bone loss by enhancing T-cell production of TNF-alpha. J Clin Invest 2000;106:1229-37.
27. Xiao P., Chen Y., Jiang H. et al. In vivo genome-wide expression study on human circulating B cells suggests a novel ESR1 and MAPK3 network for postmenopausal osteoporosis. J Bone Miner Res 2008;23:644-54.
28. World Health Organization Study Group. Assessment of fracture risk and its application for screening for postmenopausal osteoporosis. - Geneva: WHO, 1994.
29. Лимфоциты - методы. Под ред.
Д. Клауса. М.: Мир, 1990;52-3.
30. Четина Е.В., ДиБатиста Д.,
Пул А.Р. Роль простагландина E2 в ингибировании разрушения коллагена суставного хряща больных остеоартрозом. Науч-практич ревматол 2009;3:18-21.
31. Batliwalla F.M., Baechler E.C., Xiao X. et al. Peripheral blood gene expression profiling in rheumatoid arthritis. Genes Immun 2005;6:388-97.
32. Rifas L., Arackal S. T cells regulate the expression of matrix metalloproteinase in human osteoblasts via a dual mitogen-activated protein kinase mechanism. Arthr Rheum 2003;48:993-1001.
33. Balla B., Kosa B.B., Kiss J.P. et al. Different gene expression patterns in the bone tissue of aging postmenopausal osteoporotic and non-osteoporotic women. Calcif Tissue Int 2007;82:12-26.
34. Gao Y., Qian W.-P., Dark K. et al. Estrogen prevents bone loss through transforming growth factor f signaling in T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:16618-23.
35. Finkelman R.D., Bell N.H., Strong D.D. et al. Ovariectomy selectively reduces the concentration of transforming growth factor beta in rat bone: implications for estrogen deficiency-associated bone loss. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:12190-3.
36. Ali A.A., Weinstein R.S., Stewart S.A. et al. Rosiglitazone causes bone loss in mice by suppressing osteoblast differentiation and bone formation. Endocrinology 2005;146:1226-35.
37. Tee A.R., Blenis J. mTOR, translational control and human disease. Seminars Cell Dev Biol 2005;16:29-37.
38. Ford-Hutchinson A.F., Ali Z., Lines S.E. et al. Inactivation of Pten in osteo-chon-droprogenitor cells leads to epiphyseal growth plate abnormalities and skeletal overgrowth. J Bone Miner Res 2007;22:1245-59.
39. Cvetkovic M., Mann G.N., Romero D.F. et al. The deleterious effects of long-term cyclosporine A, cyclosporine G, and FK506 on bone mineral metabolism in vivo. Transplantation 1994;57:1231-7.
40. Sass D.A., Bowman A.R., Yuan Z. et al. Alendronate prevents cyclosporin A-induced osteopenia in the rat. Bone 1997;21:65-70.
41. Sun L., Blair H.C., Peng Y. et al. Calcineurin regulates bone formation by the osteoblast. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:17130-5.
42. Epstein S., Shane E., Bilezikian J.P. Organ transplantation and osteoporosis.
Curr Opin Rheumatol 1995;7:255-61.
43. Epstein S., Inzerillo A.M., Caminis J. et al. Disorders associated with acute rapid and severe bone loss. J Bone Miner Res 2003;18:2083-94.
44. Neufeld T. P. Contribution of ATG1-dependent autophagy to mTOR-mediated cell growth and survival. Autophagy 2007;3:477-9.
45. Weinstein R.S., Chen J.R., Rowers C.C. et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.
J Clin Invest 2002;109:1041-8.
Поступила 23.03.2011
