CC BY
54
Труды Карельского научного центра РАН № 3. 2011. С. 73-77.
УДК 581.1
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА с\7 В ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ КРАТКОВРЕМЕННЫХ ЕЖЕСУТОЧНЫХ СНИЖЕНИЙ ТЕМПЕРАТУРЫ
В. В. Лаврова, М. И. Сысоева, Е. Г. Шерудило, Л. В. Топчиева, Е. М. Матвеева
Институт биологии Карельского научного центра РАН
На растениях картофеля (Solanum tuberosum L., с. Сударыня и с. Невский) изучено влияние ежесуточных кратковременных и постоянных низкотемпературных воздействий на холодоустойчивость и экспрессию COR гена ci7. Показано, что прирост холодоустойчивости у растений, подвергнутых ежесуточным кратковременным снижениям температуры, был в 5-6 раз выше, чем при постоянном действии низкой температуры. При этом уровень экспрессии гена ci7 в листьях картофеля был одинаковым при разных типах низкотемпературных воздействий. Предполагается, что повышение устойчивости растений картофеля к кратковременному воздействию низких температур опосредовано не только изменением экспрессии COR гена ci7, но и иными механизмами.
Ключевые слова: Solanum tuberosum L., температура, устойчивость, COR гены, ген ci7.
V. V. Lavrova, M. I. Sysoeva, E. G. Sherudilo, L. V. Topchieva, E. M. Matveeva. EXPRESSION OF ci7 GENE IN POTATO LEAVES UNDER SHORT-TERM TEMPERATURE DROP
The effects of daily short-term and constant low-temperature treatments on cold resistance and expression of the COR gene ci7 in potato plants (Solanum tuberosum L., cv. Sudarynya & Nevskiy) has been studied. The rise in cold resistance of the plants daily exposed to short-term temperature drop was 5-6 times higher than in the plants constantly exposed to low temperature. The level of ci7 gene expression in potato leaves was the same at different modes of exposure to cold. It is suggested that the rise in potato plant resistance to short-term low temperature drop is achieved not only by means of change in expression of the COR gene ci7 but also through other mechanisms.
Key words: Solanum tuberosum L., temperature, resistance, COR genes, ci7 gene.
Введение
В природе широко распространены кратковременные падения температур в суточном цикле, которые согласно одному из сценариев изменения климата будут значительно усили-
ваться, особенно в ранневесенний период [Филатов и др., 2003]. Наряду с этим кратковременные снижения температуры широко используются в современном растениеводстве в качестве одного из приемов выращивания компактных растений [Moe, Heins, 2000]. Как
показано ранее, они оказывают влияние на биологическую продуктивность и скорость развития растений, а также способствуют увеличению их холодоустойчивости [Марковская и др., 2008]. Причем механизмы формирования устойчивости при постоянных и кратковременных низкотемпературных воздействиях различны [Марковская и др., 2007].
Известно, что важную роль в механизмах повышения устойчивости растений к действию неблагоприятных температур играют гены холодового шока, в частности COR гены, кодирующие белки, которые могут контролировать в растительном организме биологические и физиологические изменения, необходимые для роста и развития при низких температурах [Колесниченко, Войников, 2003; Трунова, 2007; Thomashow, 1998]. В настоящее время активно изучается экспрессия COR генов при действии постоянной низкой положительной температуры [Kirch et al., 1997; Thomashow, 1998; Wanner, Junttila, 1999]. В то же время информация об экспрессии COR генов при кратковременном периодическом действии низкой закаливающей температуры в доступной нам литературе отсутствует. В связи с этим целью настоящей работы было изучение влияния кратковременных ежесуточных снижений температуры на экспрессию COR гена ci7 в листьях растений картофеля.
Материалы и методы
Опыты проводили с двумя сортами картофеля (Solanum tuberosum L.) Сударыня и Невский, районированными на территории Республики Карелия. Мини-клубни картофеля, полученные в ГНУ «Карельская ГСХОС Россель-хозакадемии», проращивали стандартным способом на свету в течение трех недель, высаживали в пластиковые сосуды с песком при поливе питательным раствором Кнопа с добавлением микроэлементов (рН 5,5-5,6) и помещали в камеру искусственного климата при температуре 23°С, фотопериоде (день/ночь) 16/8 ч и освещенности 10 клк. По достижении фазы 3-х листьев часть растений оставляли при 23°С (вариант контроль), а остальные либо подвергали в течение 6 суток ежесуточным снижениям температуры (с 23 до 5°С) на 2 ч в конце ночного периода (вариант ДРОП, от англ. drop - падение), либо выращивали в течение 6 суток при постоянной низкой температуре 5°С (вариант ПНТ). На следующий день после завершения температурных обработок анализировали холодоустойчивость и исследовали экспрессию COR гена у растений всех вариантов.
Холодоустойчивость растений определяли по температуре (ЛТ50), вызывающей гибель
50% палисадных клеток паренхимы высечек из листа площадью 0,5 см2 после их 5-минутного тестирующего промораживания в термоэлектрическом термостате ТЖР-02/-20 («Интерм», Россия) в интервале температур от -6 до -10°С с шагом 0,4°С [Дроздов и др., 1976].
Для выделения РНК навеску листьев картофеля (50 мг) растирали в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли с помощью набора Yellow Solve («Силекс», Россия). Степень чистоты и концентрацию РНК определяли спектрофотометрически на приборе SmartSpec Plus (Bio-Rad, США). Для удаления остатков ДНК препарат РНК обрабатывали ДНКазой (10 ед./мл) («Силекс», Россия). Уровень экспрессии генов оценивали методом ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуорофора для детекции продуктов использовали интер-калирующий краситель SYBR Green. Амплификацию проводили в приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 (Bio-Rad, США), используя набор для амплификации («Синтол», Россия). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 2 мкл (100 нг) тотальной РНК, 5 мкл реакционной смеси, по 0,5 мкл прямого и обратного праймеров, 16 мкл воды, свободной от нукле-аз, 1 мкл MgCl2. Для ПЦР в режиме реального времени использовали праймеры («Синтол», Россия): прямой - 5' CAC AAT CAT AAC ATC CCA AA 3', обратный - 5' GCG GAC ATA AGA AGA CG 3'. Протокол ПЦР: 40 циклов - 10 с при 95°C и 30 с при 55°C. Специфичность продуктов амплификации проверяли плавлением ПЦР фрагментов: 1 мин при 95°C, 1 мин при 55°C, 10 с при 55°C (80 циклов, в каждом из которых температура повышалась на 0,5°C). Уровень экспрессии гена ci7 растений, подвергнутых низкотемпературному воздействию, был рассчитан относительно уровня экспрессии этого гена у растений контрольного варианта (не подвергнутых низкотемпературному воздействию).
Средние арифметические значения из двух независимых опытов и их стандартные ошибки представлены на рис. 1, 2. Повторность при оценке холодоустойчивости - 6-кратная, при ПЦР-анализе - 2-кратная. Данные обработаны статистически с использованием пакета программ Statgraphics for Windows 7.0. В статье обсуждаются величины, достоверно различающиеся при Р<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ холодоустойчивости растений картофеля показал, что при кратковременном ежесуточном снижении температуры (вариант ДРОП) прирост холодоустойчивости относительно контроля для с. Сударыня соста-
0
вил 2,7°С, для с. Невский - 2,9°С (см. рис. 1). В то же время постоянное действие низкой закаливающей температуры (вариант ПНТ) вне зависимости от сорта вызвало значительно меньшее по сравнению с ДРОП увеличение холодоустойчивости, прирост которой достигал только 0,5°С (см. рис. 1). Ранее подобный эффект отмечался и на других видах растений (огурце, петунии, кукурузе, пшенице, капусте белокочанной), что дало возможность высказать предположение о разных механизмах формирования устойчивости в ответ на постоянное и кратковременное действие низкой температуры [Марковская и др., 2007].
суммарного действия низкой температуры (б сут по 2 ч).
Рис. 1. Холодоустойчивость растений картофеля при кратковременном ^PO^ и постоянном (ПНІ) действии низкой закаливающей температуры (5°С)
1 - контроль, г - ДPOП, 3 - ПНІ
Из литературы известно, что постоянное действие низкой (4°С) температуры индуцировало экспрессию COR гена ci7 в клубнях и листьях картофеля [Kirch et al., 1997]. Нами также выявлено увеличение экспрессии данного гена в листьях растений, подвергнутых постоянному действию низкой закаливающей температуры (см. рис. 2). Вместе с тем, как показали результаты нашего эксперимента, не только постоянные, но и кратковременные снижения температуры вызвали экспрессию гена ci7 в листьях картофеля (см. рис. 2), причем у обоих изученных сортов уровень экспрессии был одинаковым при разных типах низкотемпературных воздействий. Интересно, что, если для достижения максимального уровня экспрессии гена ci7 при ПНІ требовалось 72 ч низкотемпературного воздействия [Berkel et al., 1994; Kirch et al., 1997], то при периодической кратковременной низкотемпературной обработке в нашем эксперименте подобный эффект достигался уже при 12 ч
Рис. г. Изменение уровня экспрессии гена ci7 при кратковременном ^PO^ и постоянном (ПНІ) действии низкой закаливающей температуры (5°С) в листьях растений картофеля
1 - ДPOП, г - ПНІ. Уровень экспрессии гена у контрольных растений (при 23°С) принят за единицу
Іаким образом, как кратковременное низкотемпературное воздействие, так и постоянное действие низкой температуры индуцировали практически одинаковый уровень экспрессии COR гена ci7 в листьях картофеля, однако величина прироста холодоустойчивости листьев в вариантах ДPOП и ПНІ существенно различалась. Выявленные различия в величине холодоустойчивости при двух видах низкотемпературного воздействия позволяют предположить, что значительно более высокий уровень устойчивости к низкой температуре в варианте ДPOП по сравнению с вариантом ПНІ может быть обусловлен не только экспрессией COR гена ci7, но и иными механизмами. Pанее нами было показано, что при периодических низкотемпературных воздействиях растения находятся в функционально активном состоянии, характеризующимся стимуляцией метаболических процессов, увеличением продуктивности, ускорением развития, в то время как постоянное действие низкой температуры вызывает снижение метаболической активности у растений [Марковская и др., 2008]. Было высказано предположение о том, что немаловажную роль в повышении холодоустойчивости растений при кратковременных низкотемпературных воздействиях играют фотоассимиляты [Марковская и др., 2008]. O6 этом свидетельствуют, в частности, результаты анализа ком-
0
понентов водорастворимой фракции углеводов, выявившие существенные различия двух видов низкотемпературного воздействия -ДРОП и ПНТ [Марковская и др., 2010]. Растения варианта ДРОП характеризовались наличием двух пулов сахаров, участвующих как в формировании устойчивости, так и в активации метаболизма, что и обеспечивало нахождение таких растений в состоянии повышенной функциональной активности и высокого уровня холодоустойчивости. Именно это играет большую роль при адаптации растений к условиям нестабильного суточного температурного режима в период активной вегетации, являясь одной из составляющих онтогенеза растений в норме.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-04-00097) и проекта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (№ г. к. П1299).
Литература
Дроздов С. Н., Курец В. К., Будыкина Н. П., Бала-гурова Н. И. Определение устойчивости растений к заморозкам // Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. Л.: Колос, 1976. С.222-228.
Колесниченко А. В., Войников В. К. Белки низкотемпературного стресса растений. Иркутск: Арт-Пресс, 2003. 196 с.
Марковская Е. Ф., Шерудило Е. Г., Галибина Н. А., Сысоева М. И. Роль углеводов в реакции теплолюбивых растений на кратковременные и длительные низ-
котемпературные воздействия // Физиология растений. 2010. Т. 57, № 5. С. 687-694.
Марковская Е. Ф., Сысоева М. И., Шерудило Е. Г., Топчиева Л. В. Дифференциальная экспрессия генов в растении огурца в ответ на многократные кратковременные низкотемпературные воздействия // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 5. С. 686-691.
Марковская Е. Ф., Сысоева М. И., Шерудило Е. Г. Феномен ежесуточного кратковременного влияния низких закаливающих температур на жизнедеятельность растения // Онтогенез. 2008. Т. 39, № 5. С.323-332.
Трунова Т. И. Растение и низкотемпературный стресс. М.: Наука, 2007. 54 с.
Филатов Н. Н., Назарова Л. Е., Сало Ю. А., Семенов А. В. Динамика и прогноз изменения климата Восточной Фенноскандии // Гидроэкологические проблемы Карелии и использования водных ресурсов. Петрозаводск: изд-во Карельского научного центра РАН, 2003. С. 33-39.
Berkel J., Salamini F., Gebhardt C. Transcripts accumulating during cold storage of potato (Solanum tuberosum L.) tubers are sequence related to stress-responsive genes // Plant Physiology. 1994. Vol. 104. P.445-452.
Kirch H. H., Berkel J., Glaczinski H., Salamini F., Gebhardt C. Structural organization, expression and promoter activity of a cold-stress-inducible gene of potato (Solanum tuberosum L.) // Plant Mol. Biol. 1997. Vol. 33. P. 897-909.
Moe R., Heins R. D. Thermo- and photomorphogenesis in plants // Adv. Floriculture Res. Agric. Univ. of Norway. 2000. Rep. N 6. P. 52-64.
Thomashow M. F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 1-7.
Wanner L. A., Junttila O. Cold-induced freezing tolerance in Arabidopsis // Plant Physiol. 1999. Vol. 120. P. 391-399.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Лаврова Виктория Витальевна
аспирант ИБ КарНЦ РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия,
Россия, 185910
эл. почта: vicandra@mail.ru
тел. (8142) 762706
Сысоева Марина Ивановна
главный научный сотрудник, д.б.н.
ИБ КарНЦ РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910
эл. почта: sysoeva@krc.karelia.ru тел. (8142) 762706
Шерудило Елена Георгиевна
старший научный сотрудник, к.б.н.
ИБ КарНЦ РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910 эл. почта: sherudil@krc.karelia.ru тел. (8142) 762706
Lavrova, Victoria
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: vicandra@mail.ru tel. (8142) 762706
Sysoeva, Marina
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: sysoeva@krc.karelia.ru tel. (8142) 762706
Sherudilo, Elena
Institute of Biology, Karelian Research Centre, Russian Academy of Science 11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: sherudil@krc.karelia.ru tel. (8142) 762706
©
Топчиева Людмила Владимировна
старший научный сотрудник, к.б.н.
ИБ КарНЦ РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910
эл. почта: topchieva@krc.karelia.ru тел. (8142) 571879
Матвеева Елизавета Михайловна
старший научный сотрудник, к.б.н.
ИБ КарНЦ РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910
эл. почта: matveeva@krc.karelia.ru тел. (8142) 783622
Topchieva, Lyudmila
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: topchieva@krc.karelia.ru tel. (8142) 571879
Matveeva, Elizaveta
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Science
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: matveeva@krc.karelia.ru tel. (8142) 783622
